MAKALAH

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)

PUTI OKTADIRA

NIM. PO. 71340230015

POLTEKKES KEMENKES JAMBI

KEMENTRIAN KESEHATAN RI

JURUSAN TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS

PRODI DIII TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS

TAHUN AKADEMIK 2023/2024

 KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT, yang telah memberikan
rahmat, hidayah, serta kesehehatan sehingga penulis dapat menyelesaikan proposal Karya Tulis
Ilmiah yang berjudul “KROMATOGRAFI LAPIS LIPIS ”. Pada kesempatan ini penulis
mengucapkan terimakasih atas segala bimbingan, arahan, dan dukungan semua pihak yang telah
membantu dalam menyelesaikan laporan ini. Untuk itu dalam kesempatan ini penulis menyampaikan
ucapan terimakasih kepada yang terhormat:

1. Bapak Rusmimpong, S.Pd, M.Kes selaku Direktur Politeknik Kesehatan Kemenkes Jambi

2. Bapak James P. Simanjuntak, S.Si.. M,Si. selaku Ketua Jurusan Teknologi Laboratorium
Medis Politeknik Kesehatan Kemenkes Jambi

3. Ibu Dra. Dewi K,M. Pd. selaku koordinator mata kuliah instrumentasi yang penuh kesabaran
dan keiklasan hati memberi arahan serta mengajar selama studi kasus.

4. Seluruh staf pengajar Jurusan TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS Poltekkses

Kemenkes Jambi yang telah memberi bekal ilmu pada penulis selama pendidikan.

Penulis menyadari dalam penulisan proposal kasus ini masih terdapat banyak kekurangan,
untuk itu penulis mengharapkan kritikan dan saran yang bersifat membangun, sehingga menjadi
masukan bagi penulis dimasa yang akan datang..

Jambi, Oktober
2023

Penulis

PUTI OKTADIRA
 DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ……………………………................................................. ….I

KATA PENGANTAR ………………………………………………………………..II

DAFTAR ISI……………………………………………………….…………………III

BAB I PENDAHULUAN …………………..………………………………………4

A. Latar Belakang …........................................................................................ 4

B. Rumusan Masalah …………….……….….…………………...………... …. 4

C. Tujuan penelitian…………………………………………..…………………… 5

BAB II PEMBAHASAN………………………………………………………………. 6

A. Kromatografi Lapis Tipis ……………………………………………………6

B. Kelebihan dan Kekurangan Kromatografi Lapis Tipis………….……………9

C Prinsip Kerja Kromatografi Lapis Tipis, ………….………………………….. 10

D. Pembuatan Lapisan Tipis…………………………………………………………..10

BAB III PENUTUP…………………………………………………………………….21

A. KESIMPULAN………………………………………………………………….21

DAFTAR PUSTAKA …………………………………………………………………..22

 BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Didalam sebuah produk seperti cairan vitamin atau obat sejenis serta produk pangan
lainnya terkadang sulit untuk membedakan dengan benar tentang unsur / zat yang
terkandung didalamnya. Dengan adanya kemajuan teknologi dibidang elektrokimia saat
ini telah memiliki peranan penting dalam menentukan berbagai kandungan / unsur zat
didalam cairan. Adapun teknologi yang masih digunakan saat ini seperti penerapan
metode kromatografi. Kromatografi ( Chromatography sebenarnya secara harfiah berasal
dari nama "warna menulis", namun tak ada hubungan secara langsung kecuali senyawa
pertama yang mengalami pemisahan dengan cara ini adalah pigmen hijau tumbuhan,
seperti klorofil. Kromatografi adalah suatu nama yang diberikan untuk teknik pemisahan
tertentu. Pada dasarnya semua cara kromatografi menggunakan dua fasa yaitu yang
pertama, fasa diam ( Stationary Phase) dan kedua, fasa bergerak ( Mobile Phase ).
Dengan adanya penelitian-penelitian baru yang memungkinkan untuk menerapkan prinsip
kromatografi pada senyawa-senyawa vang tak berwarna termasuk gas.

Adapun perkembangan pesat dari beberapa jenis sistem kromatografi diantaranya

adalah ; Kromatografi kertas, kromatografi lapisan tipis ( Thin Layer Chromatography ),
kromatografi gas ( Gas Chromatography ), dan kromatografi cair kinerja tinggi (High
Performance Liquid Chromatography).

Pada kromatografi lapisan tipis, terdapat lapisan tipis ( tebal 0.1-2 mm ) yang terdiri
atas bahan padat yang dilapiskan kepada permukaan penyangga datar ( plat ), yang
biasanya terbuat dari kaca, tetapi dapat pula terbuat dari plat polimer atau logam. Lapisan
yang melekat pada permukaan dengan bantuan bahan pengikat, biasanya kalsium sulfat
dan kromatografi lapisan tipis dapat digunakan untuk keperluan yang luas dalam
pemisahan. Seperti halnya, kromatografi lapisan tipis yang banyak digunakan akhir-akhir
ini oleh sebagian besar laboratorium di Indonesia menggunakan alat berupa TLC Scanner
3 merk CAMAG ( Made in Switzerland dengan metode kromatografi lapisan tipis, yang
mana proses pengambilan sample yang berada pada permukaan plat (tempat sample yang
telah dilakukan pemisahan) menggunakan scanner didalam alat tersebut kemudian
hasilnya ditransfer ke PC dan dilakukan proses selanjutnya. Dan kelebihan dari TLC
 Scanner 3 CAMAG sendiri adalah mampu menganalisa senyawa berwarna dan tak
berwarna, membutuhkan waktu yang relatif cepat.

B.Rumusan Masalah

1. Untuk mengetahui apa yang dimaksud dengan kromatografi lapis tipis.

2. Mengetahui apa kelebihan dan kekurangan kromatografi lapis tipis.

3. Mendeskripsikan bagaimana prinsip keja kromatografi lapis tipis.

C. Tujuan

1. Dapat memahami definisi dari kromatografi lapis tipis.

2. Dapat memahami kelebihan dan kekuangan kromatografi lapis tipis.

3. Dapat mendeskripsikan bagaimana prinsip kerja kromatografi lapis tipis.

4. Dapat memahami apa apa yang dimaksud dengan fase diam dan fase gerak dalam
kromatografi lapis tipis.
 BAB II

PEMBAHASAN

A. Kromatografi Lapis Tipis

1. Definisi Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) pertama kali dikembangkan oleh zmailoff dan
Schraiber pada tahun 1938. KLT merupakan bentuk kromatografi planar , yang fase
diamnya berupa lapisan seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang
didukung oleh lempeng kaca, plat aluminium, atau plat plastik (Gandjar dan Rohman,
2007).

KLT merupakan salah satu metode isolasi yang terjadi berdasarkan perbedaan
daya serap (adsorpsi) dan daya partisi serta kelarutan dari komponen-komponen kimia
yang akan bergerak mengikuti kepolaran eluen. Oleh karena daya serap adsorben
terhadap komponen kimia tidak sama, maka komponen bergerak dengan kecepatan
yang berbeda sehingga hal inilah yang menyebabkan pemisahan (Hostettmann et al,
1995).

Pada proses adsorpsi senyawa kimia dapat terpisalh-pisah disebabkan oleh daya
serap adsorban terhadap tiap-tiap komponen kimia tidak sama. Sedangkan partisi
adalah kelarutan tiap-tiap komponen kimia dalam cairan pengelusi (eluen) tidak sama
dimana arah gerakan eluen disebabkan oleh gaya sentrifugal sehingga komponen kimia
dapat bergerak dengan kecepatan yang berbeda-beda.

Kromatografi lapis tipis merupakan jenis kromatografi yang dapat digunakan

untuk menganalisis senyawa secara kualitatif maupun kuantitatif. Lapisan yang
memisahkan terdiri atas bahan berbutir (fase diam) ditempatkan pada penyangga
berupa pelat gelas, logam, atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisah
berupa larutan, ditotolkan berupa bercak atau pita, setelah pelat/lapisan ditaruh dalam
bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok (fase
gerak).Pemisahan terjadi setelah perambatan kapiler (pengembangan), selanjutnya
senyawa yang tidak berwarna harus ditampakkan/dideteksi. Deteksi dilakukan dengan
menggunakan sinar UV (Sudjadi, 1988).
 Teknik ini dikembangkan tahun 1938 Ismailoff dan Schraiber. Adsorbent
dilapiskan pada lempeng kaca yang bertindak sebagai penunjang fase diam. Fase
bergerak akan menyerap sepanjang fase diam dan terbentuklah kromatogram. Ini di
kenal juga sebagai kromatografi kolom terbuka. Metode ini sederhana, cepat dalam
pemisahan dan sensitif. Kecepatan pemisahan tinggi dan mudah untuk memperoleh
kembali senyawa-senyawa yang terpisahkan.

Biasanya yang sering digunakan sebagai materi pelapisnya adalah silika gel,
tetapi kadang kala bubuk selulosa dan tanah diatome juga dapat digunakan. Untuk
fase diam hidrofilik dapat digunakan pengikat seperti semen Paris, kanji, disperse
koloid plastic, silica terhidrasi. Untuk meratakan pengikat dan zat pada pengadsorbsi
digunakan suatu aplikator. Sekarang inintelah banyak tersedia kromatografi lapisan
tipis siap pakai yang dapat berupa gelas kaca yang telah terlapisi, kromatotube, dan
sebagainya. Kadar air dalam lapisan ini harus terkendali agar didapat hasil analisis
yang reprodusibel.

Pemilihan sistem pelarut dan komposisi lapisan tipis ditentukan oleh prinsip
kromatografi yang akan digunakan. Untuk meneteskan sampel yang akan dipisahkan
digunakan suatu mikro-syringe (penyuntik berukuran mikro). Sample diteteskan pada
salah satu bagian tepi pelat kromatografi. Pelarut harus nonpolar dan mudah menguap.
Kolom-kolom dalam pelat dapat diciptakan dengan mengerok lapisan vertical
searahgerakan pelarut. Teknik ascending digunakan untuk melaksanakan pemisahan
yang dilakukan pada temperature kamar, sampai permukaan pelarut mencapai tinggi
l5-18 cm. waktu yag diperlukan antara 20-40 nmenit. Semua teknik yang digunakan
untuk kromatografi kertas dapat di pakai juga untuk kromatografi lapis tipis. Resolusi
KLT juah lebih tinggi daripada kromatografi kertas karena laju difusi yang luar biasa
kecilnya pada lapisan pengadsorpsi. RRPC dapat juga dilakukan pada kromatografi
lapisan ini, dengan menggunakan lapisan yang sudah dicelupkan lebih dahulu pada
perafin, minyak silikon, dan lain-lain. Pelarut yang digunakan adalah CH;COOH atau
asetonitril. Kadangkala untuk RPPC, waktu yang diperlukan cukup lama.

Zat-zat warna dapat terlihat langsung, tetapi dapat juga digunakan reagent
penyemprot untuk melihat bercak suatu zat. Asam kromat sering digunakan untuk zat
organic. Demikian juga penandaan secara radiokomia juga dapat digunakan. Untuk
menempatkan posisi suatu zat, reagent dapat juga disemprotkan pada bagian tepi saja.
 Bagian yang lainnya dapat diperoleh kembali tanpa pengotoran dari reagent dengan
pengerokan setelah pemisahan selesai.

Untuk analisis kuatitatif dapat digunakan plot fotodensitometri. Analisisnya dapat

dilakukan dengan spektrofotometer UV, sinar tampak, IR atau flourosens atau dengan
reaksi kolorimeter dengan reagent kromogenik.

Aplikasi KLT sangatlah luas. Senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap serta
terlalu labil untuk kromnatografi cair dapat dianalisis dengan KLT. la dapat pula
untuk memeriksa adanya zat pengotor dalam pelarut. Ahli kimia foresik menggunakan
KLT untuk bermacam pemisahan. Pemisahan berguna dari plasticizer, antioksidan,
tinta dan formulasi zat pewarna dapat ditentukan dengan KLT. Pemakaiannya juga
meluas dalam pemisahan anorganik.

2. Macam - macam kromatografi lapis tipis

a) KLT preparative

Tebal lapisan adsorben dibuat sekitar 1 -1,5 mm. Semakin tebal adsorbennya
pemisahannya semakin sulut. Larutan adsorben yang dipakai biasanya lebih kental.
Setelah adsorben dilapiskan, plat harus dikeringkan pada suhu kamar sebelum
diaktifkan untuk mencegah terjadinya keretakan pada lapisan adsorben atau
terjadinya case hardening.

Sampel kira-kira 2 ml diaplikasikan dengan cara menggariskannya selebar 5 8

mm pada garis dasar dengan tiak merusak lapisan adsorben. Sebelum
dikembangkan, zat pelarut yang dipakai dalam sampel harus diuapkan lebih
dahulu. Pengembangkan dikerjakan seperti KLT yang lain. Banyaknya sampel
yang diaplikasikan antar 50 -250mg.

Cara visualisasi yang dipakai bersifat nondestruktif, terutama den gan sinar
UV pada adsorben yang mengandung P, penyemprotan dengan air atau dengan
dengan menempatkan plat yang telah dikembangkan dalam ruangan yang
mengandung uap iodium. Pengumpulan komponen yang terpisah dikerjakan
dengan mengerok adsorben dengan menggunakan spatula atau silet. Hasil kerokan
tersebut dikumpulkan diatas corong dengan kertas saring, kemudian diekstraksi
dengan pelarut, yang dipolaritasnya cukup melarutkan secara kuantitatif. KLT
 preparative harus dikerjakan secepat mungkin untuk menghindari terjadinya
kerusakan pada masing – masing komponen penyusun.

b) KLT Kuantitatif

Umunya KLT sukar dipakai sebagai cara kuantitatif. Pendekatan yang digunakan ialah :

 Analisis langsung dengang plat, dengan:

1) Charring secara standard, kemudian digunakan densitometer untuk menentukan
kuantitasnya.

2) Pengukuran radioaktaktivitasnya, khususnya untuk senyawa yang ditandai dengan

radioaktif.

3) Dengan neutron activation analysis

 Gravimetric. Measing-masing komponen disolasi, diekstrak, diuapkan, dan
 ditimbang.
 Menganalisis elemen-elemen spesifik atau gugus fungsional dengan spektrometri

c) KLT dengan argentasi

Cara ini khususnya untuk pemisahan senyawa-sen yawa yang mempunyai jumlah
ikatanrangkap yang berbeda. Isomer cis dan trans dari beberapa asam lemak juga dapat
dipisahkan dengan cara ini.

Plat adsorben yang digunakan mengandung AgNO3. Plat tersebut dapat dibuat dengan
menyemprotkan 10% larutan AgNO3 dalam equeous ethanol. Cara lain dapat dikerjakan
dengan mencelupkan plat KLT ke dalam larutan AgN03 10- 12 %. Lebih baik ialah dengan
mencampurkan AgNO3 dalam pembuatan larutan adsorben.

System pelarut yang sering digunakan ialah campuran heksana-eter dalam proporsi yang
bervariasi, tergantung jumlah ketidakjenuhan senyawanya. Pemisahan untuk monoenoat
(berikatan rangkap satu) dapat dipakai heksan-eter 93:7, untuk dienoat (berikatan rangkap
dua) dengan perbandingan 83:17, sedang untuk memisahkan monoena, diena, triena, tetraena,
pentaena, heksaena dari metil esternya dapat dipisahkan dengan menggunakan campuran
heksan-eter 60:40.
3. Alat yang digunakan dalam metode kromatografi lapis tipis

Gambar 2.1 alat yang digunakan dalam metode kromatografi lapis tips

a. Erlenmeyer

Fungsinya dgunakan untuk melakukan ekstraksi sampel yang akan diuji.

b Batang pengaduk

Fungsinya digunakan mengaduk agar larutan lebih mudah homogen

C. Chamber dan penutupnya

Fungsinya sebagai wadah penampung eluen atau fase gerak dan penutupnya berfungsi
agar eluen tidak menguap

d. Kertas saring

Fungsinya untuk menyaring campuran sampel kering dengan pelarutnya saat ekstraksi.

e. Silika gel (fase diam)

Silika gel yang berfungsi sebagai fase diam, namun terdapat berbagai macam jenis.

Misalnya G, GF, H
 f . Pipa Kapiler

Berupa pipa kecil dan sangat tipis yang digunakan untuk menotolkan cuplikan larutan
baku dan larutan sampel yang akan diuji

g. Beker Gelas

Berfungsi sebagai wadah untuk baku standart dan sampel hasil ekstraksi. h. Lampu
Ultra Violet

B. Kelebihan dan Kekurangan Kromatografi Lapis Tipis

Lampu UV ini berfungsi sebagai penampak bercak pada silica gel setelah dilakukan
penotolan

a) Kelebihan KLT

1. KLT lebih banyak digunakan untuk tujuan analisis.

2 Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna,

fluoresensi, atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.

3. Dapat dilakukan elusi secara mekanik (ascending), menurun (descending), atau

dengan cara elusi 2 dimensi.

4. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan
ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.

5 Hanya membutuhkan sedikit pelarut.

6. Biaya yang dibutuhkan terjangkau.

7. Jumlah perlengkapan sedikit.

8. Preparasi sample yang mudah

9. Dapat untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipid dan hidrokarbon) yang

dengan metode kertas tidak bisa (Gandjar dan Rohman, 2007).

b) kekurangan KLT

1. Butuh ketekunan dan kesabaran yang ekstra untuk mendapatkan bercak/noda

yang diharapkan.
 2. Butuh sistem trial and eror untuk menentukan sistem eluen yang cocok.

3 Memerlukan waktu yang cukup lama jika dilakukan secara tidak tekun

C. Prinsip Kerja Kromatografi Lapis Tipis

Pada dasarnya KLT digunakan untuk memisahkan komponen-komponen

berdasarkan perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase diam di bawah gerakan
pelarut pengembang (Watson, 2010). KLT sangat mirip dengan kromatografi
kertas, terutama pada cara pelaksanaannya. Perbedaan nyata terlihat pada fase
diamnya atau media pemisahnya, yakni digunakan lapisan tipis adsorben sebagai
pengganti kertas.

Pada proses pemisahan dengan kromatografi lapis tipis, terjadi hubungan

kesetimbangan antara fase diam dan fasa gerak, dimana ada interaksi antara
permukaan fase diam dengan gugus fungsi senyawa organik yang akan
diidentifikasi yang telah berinteraksi dengan fasa geraknya. Kesetimbangan ini
dipengaruhi oleh 3 faktor, yaitu : kepolaran fase diam, kepolaran fase gerak, serta
kepolaran dan ukuran molekul.

D. Pembuatan Lapisan Tipis

Penyerap dituangkan diatas permukaan plat yang kondisi bentuknya baik,

biasanya digunakan plat kaca / aluminium. Ukuran yang digunakan tergantung pada
jenis dari pemisahan yang akan dilakukan dan jenis dari bejana kromatografi.
Seringkali bentuk plat kaca l aluminium dijual dengan ukuran 20 x 5 cm atau 20 x
20 cm, dua ukuran ini dianggap sebagai "standard". Hal yang penting yaitu bahwa
permukaan dari plat harus rata. Plat -plat kaca / aluminium sebelum dipakai dicuci terlebih
dahulu dengan air dan detergent kemudian dikeringkan. Terakhir, dapat dicuci dengan
aseton, tetapi hal ini tidak mesti dilakukan. Satu hal yang perlu diperhatikan jangan
menyentuh permukaan dari plat yang bersih dengan jari tangan karena bekas jari tangan
yang menempel akan merubah tebal dari permukaan penyerap pada plat.

Untuk membuat penyerap, pertama bahan penyerap dicampur dengan air sampai
menjadi bubur, biasanya dengan perbandingan x gram penyerap dan 2x ml air. Bubur diaduk
sampai rata dan dituangkan diatas plat dengan berbagai cara. Tebal lapisan merupakan
 faktor yang paling penting dalam kromatografi lapisan tipis. Tebal standard adalah 250
mikron. Lapisan-lapisan yang lebih tebal (0.5 - 2.0 mm ) digunakan untuk penmisahan-
pemisahan yang sifatnya besar, dengan menggunakan penyerap hingga 250 mg untuk plat
den gan ukuran 20 x 20 cm. Salah satu kesukaran dengan lapisan tebal ialah adanya tendensi
mengelupas bila kering.

Tabel 2.1 Perbandingan untuk membuat bubur penyerap

Penyerap Medium bubur penyerap Perbandingan, Gram dalam ml

Silika gel Metilena klorida: methanol (2:2, v/v) 35 gr dalam 100 ml
Serbuk Metilena klorida : methanol (50:50, v/v) methanol 50 gr dalam 100 ml
selulosa
Alumina Metilena klorida : methanol (70:30, v/v) methanol60 gr dalam 100 ml

Sifat yang terpenting dari penyerap adalah besar partikel bubur penyerap dan
homogenitasnya, karena adhesi terhadap plat sangat tergantung pada kedua sifat
tersebut. Besarnya partikel yang biasa digunakan adalah 1 - 25 mikron. Partikel
yang butirannya sangat kasar tidak akan memberikan hasil yang memuaskan dan
salah satu alasan untuk menaikkan hasil pemisahan adalah menggunakan penyerap
yang butirannya halus. Sedangkan dalam kolom partikel yang sangat halus akan
mengakibatkan aliran pelarut menjadi lambat, pada lapisan tipis butiran yang halus
memberikan aliran pelarut yang lebih cepat. Beberapa contoh penyerap yang
digunakan untuk pemisahan-pemisahan dalam kromatografi lapisan tipis adalah
sebagai berikut :

Tabel 2.3 Macam-macam penyerap untuk kromatografi lapisan tipis

Zat Padat Digunakan untuk memisahkan

Silika Asam- asam amino, alkaloid, gula,
asam-asam lemak, lipida, minyak
esensial, anion, dan kation organic,
sterol, terpenoid.
Alumina Alkaloid, zat warna, fenol, steroid,
vitamin-vitamin, karoten, asam-asam amino
Kieselguhr Gula, oligosakarida, asam- asam
 lemak, trigliserida, asam -asam
amino, steroid.
Bubuk Sellulosa Asam-asam amino, alkaloid, nukleotida
Pati Asam-asam amino
Sephadex Asam-asam amino, protein

5 Fase Diam dan Fase Gerak

Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil
dengan diameter partikel antara 10-30 um (Gandjar dan Rohman, 2007), Semakin
kecil ukuran rata rata partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase
diam, maka semakin baik kinerja KLT dalam hal efisiensi dan resolusinya.

Silika gel salah satu contoh fase diam yang terbentuk dari silikon dioksida
(silika). Atom silikon dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang
besar. Namun, pada permukaan silika gel, atom silikon berlekatan pada gugus -OH.
Jadi, pada permukaan jel silika terdapat ikatan Si-0-H selain Si-O-si.

Permukaan silika gel sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat
membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya,
sebagaimana halnya gaya van der Waals dan atraksi dipol-dipol.
 Gambar 2.3 plat kerta

Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina dari aluminium
oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Pada
dasarnya sifat serta penggunaannya mirip silika gel.

Fase duam Mekanisme sorosi Penggunaan

Silika gel Adsorpsi Asam amino,hidrokarbon,
vitamin,alkaloid
Serbuk selulosa Partisi Asam amino,nukleotida,
karbohidrat
Selulosa penukar ion Pertukaran ion Asam nulkleat,nukleotida
halida dan ion ionlogam
Gel sephadex Eksklusi Polimer,protein,kompleks
logam
B-siklodekstrin Interaksi adsorpsi Campuran enansiomer
stereospesifik

Adsorben yang sering digunakan antara lain :

a) Silika gel
Yang paling banyak digunakan dalam pengujian, bersifat asam lemah, sering
ditambah CaS04 (gibs) sebagai pengikat agar melekat kuat pada penyangga.
Penambahan ini juga mempercepat mengeringnya lapis tipis. Juga dapat ditambahkan
indicator fluoresensi yang akan berfluoresensi di bawah sinar UV pada 254 nm, hingga
noda yang mengabsorpsi pada frekuensi ini menjadi sangat kontras terhadap latar
belakang yang berfluoresensi hijau kuning. Silica gel sangat higroskopis, pada
humaditas relative 45 - 75% akan menarik air sampai 7 - 20%o. Derajat diaktivasinya
ditentukan oleh kelembaban ruangan dimana pemisahan akan dilakukan atau tempat
penyimpanan lapis tipisnya. Kemurnian juga penting karena dapat mempengaruhi
watak kromatografi beberapa senyawa tertentu. Pencemar dalam adsorben ini dapat
juga menyebabkan dekomposisi senyawa yang hendak dianalisa.
b) Alumina
Bersifat basa lemah. Tidak sebaik silica gel dan lebih relative secara kimia
hingga untuk senyawa yang sensitive dapat terdegrasi. Juga dapat ditambah Ca2S04
dan indicator fluoresensi.
c) Kieselguhr (tanalh diatome)
 Merupakan adsorben netral dengan aktivitas rendah. Daya resolusinya juga
kecil. Dapat ditanmbahkan sebagai campuran pada silikagel yang akan memberikan
adsorben campur yang kurang aktif. Juga dapat ditambah Ca2So4.
d) Selulosa
Dengan menggunakan selulosa sebagai adsorben akan didapat lapis tipis yang
sifatnya analog dengan kromatografi kertas. Memberikan lapis tipis yang baik tanpa
pengikat. Adsorben ini dapat ditambah indicator fluoresensi atau Ca asetat. Kerugian
penggunaan selulosa ini ialah tidak dapat digunakannya pereaksi yang korosif seperti
asam sulfat atau pereaksi destruktif lainnya.
e) Poliamida
Merupakan magnesium silikat. Daya melekatnya tidak sebaik adsorben lainnya.
Biasanya ditambahkan pengikat seperti selulosa atau amilum. Mempunyai kapasitas
yang besar dan banyak digunakan untuk pemisahan fenol. Selain fasa diam, dalam
KLT juga diperlukan fasa gerak/eluent yang berperan penting pada proses elusi bagi
larutan umpan (feed) untuk melewati fasa diam (adsorbent). Interaksi antara adsorbent
dengan eluent sangat menentukan terjadinya pemisahan komponen. Oleh sebab itu
pemisahan komponen secara kromatografi dipengaruhi oleh laju alir eluent dan jumlah
umpan. Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut
atau campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang banyak
digunakan adalah jenis adsorben alumina atau sebuah lapis tipis silika. Suatu pelarut
yang bersifat larutan relatif polar, dapat mengusirpelarut yang tak polar dari ikatannya
dengan alumina (gel silika). Semakin dekat kepolaran antara senyawa dengan cluen
maka senyawa akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut. Hal ini berdasarkan
prinsip like dissolved like" (Watson, 2010).

7. Prosedur Kerja dengan Kromatografi Lapis Tipis

Pada KLT, fasa diam berupa plat yang biasanya disi dengan silica gel. Sebuah garis pensil

digambar dekat bagian bawah fasa diam dan setetes larutan sampel ditempatkan di atasnya.

Sampel ditotol dengan bantuan pipa kapiler. Garis pada fasa diam berguna untuk menunjukkan
posisi asli sampel. Pembuatan garis harus menggunakan pensil karena jika semua ini dilakukan

dengan tinta, pewarna dari tinta juga akan bergerak sebagai kromatogram berkembang. Ketika titik

campuran kering, fasa diam diletakkan berdiri dalam gelas tertutup yang telah berisi fasa gerak

dengan posisi fasa gerak di bawah garis. Digunakan gelas tertutup untuk memastikan bahwa

suasana dalam gelas jenuh dengan uap pelarut. Pelarut (fasa gerak) perlahan-lahan bergerak naik.
Komponen-komponen yang berbeda dari campuran berjalanan pada tingkat yang berbeda dan

campuran dipisahkan memiliki warna yang berbeda. Diagram menunjukkan plat setelah pelarut

telah bergerak sekitar setengah jalan. Pelarut diperbolehkan untuk naik hingga hampir mencapai

bagian atas plat yang akan memberikan pemisahan maksimal dari komponen-komponen pewarna

untuk kombinasi tertentu dari pelarut dan fase diam.

Identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah pada lapisan tipis lebih baik dikerjakan
dengan pereaksi kimia dan reaksi-reaksi warna. Untuk identifikasi menggunakan harga Rr
meskipun harga-harga Rr dalam lapisan tipis kurang tepat bila dibandingkan pada kertas. Seperti
halnya pada kertas harga R didefinisikan sebagai berikut (Gritter et al, 1991):

Harga-harga Rr untuk senyawa-senyawa murni dapat dibandingkan dengan harga-harga

standard. Perlu diperhatikan bahwa harga-harga Rr yang diperoleh berlaku untuk campuran
tertentu dari pelarut dan penyerap yang digunakan, meskipun daftar dari harga-harga Rr untuk
berbagai campuran dari pelarut dan penyerap dapat diperoleh (Gritter et al, 1991).
 Ujung lempeng dicelupkan ke dalam lapisan campuran pelarut dan mulai
bermigrasi sepanjang lempeng, didorong oleh gaya tegangan muka. Pelarut-pelarut tersebut
menyusun diri mereka sendiri pada permukaan seperti yang ditunjukkan dalam gambar.
Pelarut yang berinteraksi lebih kuat dengan fase diam terekstrak dari campuran dan
membentuk suatu lapisan teradsorbsi pada permukaan fase diam dan ditunjukkan oleh daerah
(X).

Saat ini campuran binari terus bermigrsi sepanjang lempeng dan komponen pelarut
berikutnya yang berinteraksi paling kuat dengan fase diam (pelarut B) teradsorbsi sebagai
lapisan pada permukaan lempeng yang ditunjukkan oleh daerah (Y).

Akhirnya, pelarut yang tersisa (C), yang mempunyai interaksi paling lemah dengan
fase diam, melanjutkan migrasinya dan menutup permukaan dengan lapisan pelarut (C) pada
daeralh (Z).

Terlihat bahwa sistem kromatografi yang dihasilkan oleh analisis frontal dari tiga
komponen fase gerak menjadi kompleks. Sampel akan berinteraksi selama proses pemisahan.
Pada seksi pertama (X), sampel akan terdistribusi diantara campuran pelarut ternari (A), (B),
(C) dengan permukaan fase diam yang tertutup dengan pelarut (A).

Pada seksi (Y) sampel akan terdistribusi diantara campuran pelarut binari (B) serta
(C) dan permukaan fase diam yang terturup dengan pelarut (B). Akhirnya, distribusi dalam
seksi (Z) terjadi antara pelarut (C) murni serta permukaan fase diam yang tertutup dengan
pelarut (C).

Proses pemisahan dapat disederhanakan dengan melakukan pra-pengkondisian

lempeng dengan uap pelarut dari fase gerak sebelum pemisahan dimulai. Sayangnya, hal ini
hanya mengurangi sebagian efek adsorpsi, karena kesetimbangan antara uap pelarut dan
permukaan fase diam tidak akan sama dengan kesetimbangan antara pelarut cair dengan
permukaan fase diam. Jelas bahwa dengan terbentuknya suatu gradien akibat analisis frontal
fase gerak dan pemilihan yang hati-hait campuran pelarut, akan tercipta model pseudo-
gradien yang dapat diperhitungkan versatilitas, popularitas dan kesuksesan TLC yang
digunakan.

Setiap komponen memiliki harga Rf sendiri-sendiri, denagn bantuan sinar UV

maka dapat ditentukan noda yang tidak tampak oleh kasat mata. Cara yang biasa dilakukan
dengan menyemprotkan KMNO4 dan H:SO4 yang kemudian akan berinteraksi dengan
komponen-komponen sampel baik secara kimia maupun berdasarkan kelarutan membentuk
warna-warna tertentu.

Noda kemudian dihitung harga Rf nya. Harga Rf dihitung dengan menggunakan

perbandingan jarak yang di tempuh solut denagn jarak yang di tempuh fase gerak

Dapat di tulis rumus sebagai berikut:

Rf = Jarak yang ditempuh senyawa yang tidak diketahui

Jarak yang ditempuh senyawa standar yang diketahui

Nlai maksimum Rf adalah I dan nilai minimum nya adalah 0. Dengan

menggunakan silika gel sebagai fase diam, harga Rf 1 menunjukan jka senyawa tersebut
sangat nonpolar sedangkan harga Rf o menunjukan bahwa senyawa tersebut sanagat polar.

8. Deteksi Bercak

Ada dua cara untuk menyelesaikan analisis sampel yang tidak berwarna, yaitu:

1. Menggunakan pendarflour
Fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis seringkali memiliki substansi yang
ditambahkan kedalamnya, supaya menghasilkan pendaran flour ketika diberikan sinar
ultraviolet (UV). Itu berarti jika sinar UV disinarkan, maka sampel akan berpendar.
Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada,
meskipun bercak-bercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Itu
berarti bahwa jika disinarkan sinar UV pada lempengan, akan timbul pendaran dari
posisi yang berbeda dengan posisi bercak-bercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil
yang gelap.
Sementara UV tetap disinarkan pada lempengan,, kita harus menandai posisi-
posisi dari bercak bercak dengan menggunakan pensil dan melingkari daerah bercak-
bercak itu. Karena jika kita mematikan sinar UV tersebut, bercak-bercaknya tidak
tampak kembali.

2. Penunjukkan bercak secara kimia

 Dalam beberapa kasus,
dimungkinkan untuk membuat bercak-bercak menjadi tampak dengan cara
mereaksikannya dengan zat kimia sehingga menghasilkan produk yang berwarna.
Sebuah contoh yang baik adalah kromatogram yang dihasilkan dari campuran asam
amino. Kromatogram dapat dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin.
Ninhidrin bereaksi dengan asam amino menghasilkan senyawa-senyawa berwarna,
umumnya coklat atau ungu.

Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian

ditempatkan pada wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan gelas arloji)
bersama dengan kristal iodium. Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan
bercak padakromatogram, atau dapat dilekatkan lebih dekat pada bercak daripada
lempengan. Substansi yang dianalisis tampak sebagai bercak-bercak kecoklatan.

9. Instrument Kromatografi Lapis Tipis

1. Detektor

Detektor pada alat TLC Scanner 3 CAMAG menggunakan photomultipliers.

Komponen didalam phot omultipier (PMT) sendiri adalah photomultiplier tube
(tabung vakum photomultiplier), photocathode (katoda metalik yang terbuat dari
bahan logam multi alkali), struktur dynode (berbentuk lempengan cekung) dan
anoda (memilki spectral sensitivity 185-850 nm).

Prinsip kerja dari PMT adalah permukaan logam katoda disinari dengan
seberkas cahaya dan sejumlah elektron terpancar dari permukaannya, yang biasa
disebut dengan efek fotoelektrik dengan kondisi hampa udara.
 Elektron yang terpancar dan terlepas karena adanya sekumpulan energi yang
timbul dan dikuatkan oleh susunan komponen dynode (linier -focused type) secara
berurutan dan keluar mengenai anoda. Elektron tersebut terikat dalam logam dengan
energi W (eV), yang dikenal sebagai fungsi kerja (work function), logam yang
berbeda memilki fungsi kerja yang berbeda pula. Dan logam katoda yang digunakan
sebagai permukaan fotosensitif, dibawah panjang gelonmbang pancung (cutoffT
wavelength) c, sembarang sumber cahaya, selemah apapun, akan menyebabkan
terjadinya pemancaran fotoelektron.

Cahaya yang masuk difokuskan dengan melewati focusing electrode dan

elektron mengenai dynode pertanma kemudian dipantulkan dan dipancarkan ke
dynode kedua sampai ke dynode yang terakhir (proses pengalian) sehingga terjadi
muatan elektron yang lebih besar dan timbul tegangan.

2. Monokromator

Monokromator adalah alat yang paling umum dipakai untuk menghasilkan

berkas radiasi dengan satu panjang gelombang. Monokromator untuk radiasi ultra
violet, sinar tampak dan infra merah adalah serupa, yaitu mempunyai celah (slit),
lensa, cermin dan prisma atau grating. Terdapat 2 macam monokromator yaitu
monokromator prisma Bunsen dan monokromator grating Czerney-Turney Fungsi
prisma adalah untuk memisahkan sinar polikromatis dari sumber cahaya menjadi
sinar monokromatis. Bila seberkas cahaya dilewatkan melalui sebuah prisma, maka
cahaya tersebut akandiuraikan menjadi beberapa warna (terdapat berbagai warna
merah, jingga, hijau, biru, dan lain-lain).

3. Absorbansi

Penyerapan hanya terjadi jika energi foton yang datang cocok dengan energy
yang diperlukan untuk memindahkan satu elektron terluarnya dari tingkat dasar ke
tingkat tereksitasi (atau dari pita valensi ke pita konduksi di dalam zat padat).
Dengan spektroskopi dari cahaya transmisi bisa diketahui tingkat/pita energi dari
suatu atom/molekul/zat padat.

Berkas radiasi elektromagnet bila dilewatkan pada sampel kimia maka sebagian akan
terabsorpsi. Energi elektromagnet yang ditransfer ke molekul sampel akan menaikan tingkat
energi (tingkat tereksitasi). Molekul akan dieksitasi sesuai dengan panjang gelombang yang
diserapnya.

Rumus yang digunakan untuk menghitung besarnya energi yang diserap:

E=hxv=hxC Ih=hx C/v

dimana, E- energi yang diserap

h=tetapan Planck =6,626 x 1034

v= frekuensi

C=kecepatan cahaya = 2,998 x 108 m/det

A= panjang gelombang

v= bilangan gelombang

Absorbansi dengan simbol A dari suatu larutan merupakan logaritma dari 1/T

atau logaritma lo/It.

A = log (1i/T) = log (Io/lt) = - log (T) (1.4)

dimana, A = Absorbansi / serapan

Io = Intensitas sinar yang datang

It = Intensitas sinar yang diteruskan

T= Transmitance / transmitansi

4. Transmitansi

Apabila suatu berkas sinar radiasi dengan intensitas lo dilewatkan melalui suatu
larutan dalan wadah transparan maka sebagian radiasi akan diserap sehingga intensitas
radiasi yang diteruskan It menjadi lebih kecil dari lo. Transmitansi dengan simbol T dari
larutan merupakan fraksi dari radiasi yang diteruskan atau ditansmisikan oleh larutan,
yaitu : T = It/lo. Transmitansi biasanya dinyatakan dalam persen (%). 10 Faktor - Faktor
yang Mempengaruhi Kromatografi Lapis Tipis Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan
noda dalam kromatografi lapisan tipis yang juga mempengaruhi harga Rr adalah :

1. Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan.

2. Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya.

Biasanya aktifitas dicapai dengan pemanasan dalam oven, hal ini akan
mengeringkan molekul-molekul air yang menempati pusat-pusat serapan dari
penyerap. Perbedaan penyerap akan memberikan perbedaan yang besar terhadap
harga Rr meskipun menggunakan fase bergerak dan zat terlarut yang sama tetapi
hasil akan dapat diulang dengan hasil yang sama, jika menggunakan penyerap yang
sama, ukuran partikel tetap dan jika pengikat (kalau ada) dicampur hingga homogen.

3. Tebal dan kerataan dari lapısan penyerap.

Pada prakteknya tcbal lapisan tidak dapat dilihat pengaruhnya, tetapi perlu
diusahak an tebal lapisan yang rata. Ketidakrataan akan menycbabkan aliran pelarut
menjadi tak rata pula dalam dacrah yang kecil dari plat.

4. Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase bergerak.

Kemurnian dari pelarut yang digunakan sebagai fase bergerak dalam

kromatografi lapisan tipis adalah sangat penting dan bila campuran pelarut digunakan
maka perbandingan yang dipakai harus betul-betul diperhatikan.

5. Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang digunakan.

6. Teknik percobaan.

Arah pelarut bergerak di atas plat. (Metoda aliran penaikan yang hanya
diperhatikan, karena cara ini yang paling umum meskipun teknik aliran penurunan dan
mendatar juga digunakan). Jumlah cuplikan yang digunakan. Penetesan cuplikan dalam
jumlah yang berlebihan memberikan hasil penycbaran noda-noda dengan kemungkinan
terbentuknya ekor dan efek tak kesetimbangan lainnya, hingga akan mengakibatkan
kesalahan-kesalahan pada harga-harga Re.

8. Suhu.

Pemisahan-pemisahan sebaiknya dikerjakan pada suhu tetap, hal ini terutama

untuk mencegah perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut yang disebabkan oleh
penguapan atau perubahan-perubahan fase.

9. Kesetimbangan.
 Ternyata bahwa kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih penting dalam
kromatografi kertas, hingga perlu mengusahakan atmosfer dalam bejana jenuh dengan
uap pelarut. Suatu gejala bila atmosfer dalam bejana tidak jenuh dengan uap pelarut,
bila digunakan pelarut campuran, akan terjadi pengembangan dengan permukaan
pelarut yang berbentuk cekung dan fase bergerak lebih cepat pada bagian tepi-tepi dan
keadaan ini harus dicegah.
 BAB III

PENUTUP
A. Kesimpulan

Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan

distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase
diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas).

KLT merupakan salah satu metode isolasi yang terjadi berdasarkan perbedaan
daya serap (adsorpsi) dan daya partisi serta kelarutan dari komponen-komponen
kimia yang akan bergerak mengikuti kepolaran cluen.

Keuntungan KLT yaitu ketepatan penentuan kadar baik karena komponen

yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak. Kerugiannya
memerlukan waktu untuk menentuan sistem eluen yang cocok.

Prinsip KLT yaitu pemisahan komponen-komponen berdasarkan perbedaan

adsorpsi atau partisi oleh fase diam dibawah gerakan pelarut pengembang.

Pembuatan lapis tipis KLT dimulai dari penyerap dituangkan diatas

permukaan plat yang kondisi bentuknya baik, biasanya digunakan plat kaca /
aluminium. Ukuran yang digunakan tergantung pada jenis dari pemisahan yang akan
dilakukan dan jenis dari bejana kromatografi. Seringkali bentuk plat kaca
/aluminium dijual dengan ukuran 20 x 5 cm atau 20 x 20 cm, dua ukuran ini
dianggap sebagai standard".

Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil
dengan diameter partikel antara 10-30 um (Gandjar dan Rohman, 2007). Fasa
gerak/eluent yang berperan penting pada proses elusi bagi larutan umpan (feed)
untuk melewati fasa diam (adsorbent).

Kerja dengan KLT dimulai dari penyiapan plat, eluen dan sampel, penotolan,
elusi, dan deteksi bercak/noda. Cara mendeteksi bercak ada 2 yaitu menggunakan
UV dan campuran zat kimia tertentu.Terdapat beberapa instrument pada
 kromatografi lapis tipis diantaranya adalah detector, monokromator, absorbansi, dan
transmitansi.

Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatografi lapisan

tipis yang juga mempengaruhi harga Re adalah :

 Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan.

 Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya.
 Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap.
 Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase bergerak.
 Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang digunakan.
 DAFTAR PUSTAKA
1. Arifin, Fury. 2012. Kromatografi Lapis Tipishttp://nonasandha.com. Diakses 03 Desember
2014

2. David G. Watson. Analis Farmasi, Buku kedokteran EGC

3. J. Bassel. Kimia kuantitatif anorganik, buku kedokteran EGC

4. Ayu. 2013. Analisa Pengukuran Kadar Larutan. http://slfarmasiayu.com. Diakses: 03

Desember 2014

5 Clark, Jim. 2007. Kromaografi Lapis Tipis. http://www.chem-is-try.org. Diakses: 03

Desember 2014

6. Khopkar, SM. 2010. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta : Universitas Indonesia