MAKALAH KIMIA PEMISAHAN

Dosen pengampu: Drs. Jasmidi, M.Si

KROMATOGRAFI KERTAS DAN LAPIS TIPIS

DISUSUN OLEH:

KELOMPOK 3

DESIMA SAMOSIR (4191131009)

SHINTIA TRI SHIFA (4191131017)
REZKI EKA RAMADHANI (4193131042)
STEVEN FIRNANDI HUTAPEA (4192431013)

KELAS: PSPK 19E

FAKULTAS MATEMATKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS NEGERI MEDAN

2021
 KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa, karena
atas berkatnya Penulis masih dapat masih dapat menyelesaikan tugas mini riset ini
dengan tepat waktu. Mini riset ini dibuat untuk memenuhi tugas mata kuliah
Pengelolaan Laboratorium.

Penulis mengetahui makalah ini masih memiliki banyak kekurangan dan

penulis mengharapkan kritik dan saran dari para pembaca agar makalah ini dapat
diperbaiki dan menjadi contoh untuk pembuatan makalah selanjutnya. Penulis juga
berharap agar isi dari makalah ini dapat menambah informasi serta juga pengetahuan
baru terhadap para pembacanya.

Penulis juga ingin mengucapkan terimakasih atas semua pihak yang terkait
dalam penyusunan makalah ini terutama kepada Bapak dosen Drs. Jasmidi, M.Si,
yang telah memberikan bimbingan kepada penulis sehingga penulis dapat memahami
mata kuliah ini dengan baik serta ucapan terima kasih kepada teman teman dan juga
orang tua penulis yang sudah memberikan dukungan kepada penulis untuk
menyelesaikan mini riset ini secara tepat waktu. Dan semoga makalah penulis dapat
menjadi lebih baik lagi.

Medan, 18 Oktober 2021

Kelompok 3

i
 DAFTAR ISI

KATA PENGHANTAR ..........................................................................................i

DAFTAR ISI ............................................................................................................ii

BAB I PENDAHULUAN ........................................................................................1

A. Latar Belakang ..............................................................................................1

BAB II PEMBAHASAN..........................................................................................3

A. Definisi Kromatografi Lapis Tipis.................................................................3

B. Kelebihan dan Kekurangan Kromatografi Lapis Tipis..................................5
C. Prinsip Kerja Kromatografi Lapis Tipis.........................................................6
D. Pembuatan Lapis Tipis ..................................................................................6
E. Definisi Kromatogram...................................................................................8
F. Fase Diam dan Fase Gerak.............................................................................9
G. Prosedur Kerja dengan Kromatografi Lapis Tipis.........................................11
H. Instrument Kromatografi Lapis Tipis.............................................................13

BAB III PENUTUP .................................................................................................18

A. Kesimpulan ...................................................................................................18
B. Saran ..............................................................................................................18

DAFTAR PUSTAKA ..............................................................................................19

LAMPIRAN .............................................................................................................20

ii
 BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Lelakang

Didalam sebuah produk seperti cairan vitamin atau obat sejenis serta produk
pangan lainnya terkadang sulit untuk membedakan dengan benar tentang unsur / zat
yang terkandung didalamnya. Dengan adanya kemajuan teknologi dibidang
elektrokimia saat ini telah memiliki peranan penting dalam menentukan berbagai
kandungan / unsur zat didalam cairan. Adapun teknologi yang masih digunakan saat
ini seperti penerapan metode kromatografi.

Kromatografi ( Chromatography ) sebenarnya secara harfiah berasal dari nama

"warna menulis", namun tak ada hubungan secara langsung kecuali senyawa pertama
yang mengalami pemisahan dengan cara ini adalah pigmen hijau tumbuhan, seperti
klorofil. Kromatografi adalah suatu nama yang diberikan untuk teknik pemisahan
tertentu. Pada dasarnya semua cara kromatografi menggunakan dua fasa yaitu yang
pertama, fasa tetap ( Stationary Phase ) dan kedua, fasa bergerak ( Mobile Phase ).
Dengan adanya penelitianpenelitian baru yang memungkinkan untuk menerapkan
prinsip kromatografi pada senyawa-senyawa yang tak berwarna termasuk gas.

Kromatografi adalah suatu metode pemisahan berdasarkan perbedaan

perpindahan dari komponenkomponen senyawa diantara dua fase yaitu fase diam
(dapat berupa zat cair atau zat padat) dan fase gerak (dapat berupa gas atau zat cair)
(Depkes RI, 1995). Sedangkan pada kromatografi lapis tipis, fase geraknya berupa
lempeng tipis. Kromatografi lapis tipis merupakan metode pemisahan fisikokimia.
Lapisan pemisah terdiri atas bahan berbutir-butir (fase diam) yang pada umumnya
dilapisi dengan silika gel. , ditempatkan pada penyangga berupa plat gelas, logam atau
lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisah berupa larutan yang ditotolkan baik
berupa bercak ataupun pita. Setelah plat atau lapisan dimasukkan ke dalam bejana
tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok (fase gerak), pemisahan
terjadi selama perambatan kapiler (pengembangan). Selanjutnya senyawa yang tidak
berwarna harus ditampakkan (Stahl, 1985).

Adapun perkembangan pesat dari beberapa jenis sistem kromatografi

diantaranya adalah ; Kromatografi kertas, kromatografi lapisan tipis ( Thin Layer

1
Chromatography ), kromatografi gas ( Gas Chromatography ), dan kromatografi cair
kinerja tinggi ( High Performance Liquid Chromatography ).

Pada kromatografi lapisan tipis, terdapat lapisan tipis ( tebal 0.1-2 mm ) yang

terdiri atas bahan padat yang dilapiskan kepada permukaan penyangga datar ( plat ),
yang biasanya terbuat dari kaca, tetapi dapat pula terbuat dari plat polimer atau logam.
Lapisan yang melekat pada permukaan dengan bantuan bahan pengikat, biasanya
kalsium sulfat dan kromatografi lapisan tipis dapat digunakan untuk keperluan yang
luas dalam pemisahanpemisahan. Seperti halnya, kromatografi lapisan tipis yang
banyak digunakan akhir-akhir ini oleh sebagian besar laboratorium di Indonesia
menggunakan alat berupa TLC Scanner 3 merk CAMAG ( Made in Switzerland )
dengan metode kromatografi lapisan tipis, yang mana proses pengambilan sample
yang berada pada permukaan plat (tempat sample yang telah dilakukan pemisahan)
menggunakan scanner didalam alat tersebut kemudian hasilnya ditransfer ke PC dan
dilakukan proses selanjutnya. Dan kelebihan dari TLC Scanner 3 CAMAG sendiri
adalah mampu menganalisa senyawa berwarna dan tak berwarna, membutuhkan
waktu yang relatif cepat.

2
 BAB II

PEMBAHASAN

A. Definisi Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) pertama kali dikembangkan oleh Izmailoff

dan Schraiber pada tahun 1938. KLT merupakan bentuk kromatografi planar , yang
fase diamnya berupa lapisan seragam (uniform) pada permukaan bidng datar yang
didukung oleh lempeng kaca, plat aluminium, atau plat plastik (Gandjar dan Rohman,
2007).

KLT merupakan salah satu metode isolasi yang terjadi berdasarkan perbedaan
daya serap (adsorpsi) dan daya partisi serta kelarutan dari komponen-komponen kimia
yang akan bergerak mengikuti kepolaran eluen. Oleh karena daya serap adsorben
terhadap komponen kimia tidak sama, maka komponen bergerak dengan kecepatan
yang berbeda sehingga hal inilah yang menyebabkan pemisahan (Hostettmann et al,
1995).

Pada proses adsorpsi senyawa kimia dapat terpisah-pisah disebabkan oleh

daya serap adsorban terhadap tiap-tiap komponen kimia tidak sama. Sedangkan partisi
adalah kelarutan tiap-tiap komponen kimia dalam cairan pengelusi (eluen) tidak sama
dimana arah gerakan eluen disebabkan oleh gaya sentrifugal sehingga komponen
kimia dapat bergerak dengan kecepatan yang berbeda-beda.

Kromatografi lapis tipis merupakan jenis kromatografi yang dapat digunakan

untuk menganalisis senyawa secara kualitatif maupun kuantitatif. Lapisan  yang
memisahkan terdiri atas bahan berbutir (fase diam) ditempatkan pada penyangga
berupa pelat gelas, logam, atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisah
berupa larutan, ditotolkan berupa bercak atau pita, setelah pelat/lapisan ditaruh dalam
bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok (fase
gerak). Pemisahan terjadi setelah perambatan kapiler (pengembangan), selanjutnya
senyawa yang tidak berwarna harus ditampakkan/dideteksi. Deteksi dilakukan dengan
menggunakan sinar UV (Sudjadi, 1988).

Teknik ini dikembangkan tahun 1938 Ismailoff dan Schraiber. Adsorbent

dilapiskan pada lempeng kaca yang bertindak sebagai penunjang fase diam. Fase

3
bergerak akan menyerap sepanjang fase diam dan terbentuklah kromatogram. Ini di
kenal  juga sebagai kromatografi kolom terbuka. Metode ini sederhana, cepat dalam
pemisahan dan sensitif. Kecepatan pemisahan tinggi dan mudah untuk memperoleh
kembali senyawa-senyawa yang terpisahkan.

Biasanya yang sering digunakan sebagai materi pelapisnya adalah silika gel,
tetapi kadang kala bubuk selulosa dan tanah diatome juga dapat digunakan. Untuk
fase diam hidrofilik dapat digunakan pengikat seperti semen Paris, kanji, disperse
koloid plastic, silica terhidrasi. Untuk meratakan pengikat dan zat pada pengadsorbsi
digunakan suatu aplikator. Sekarang inin telah banyak tersedia kromatografi lapisan
tipis siap pakai yang dapat berupa gelas kaca yang telah terlapisi, kromatotube, dan
sebagainya. Kadar air dalam lapisan ini harus terkendali agar didapat hasil analisis
yang reprodusibel.

Pemilihan sistem pelarut dan komposisi lapisan tipis ditentukan oleh prinsip
kromatografi yang akan digunakan. Untuk meneteskan sampel yang akan dipisahkan
digunakan suatu mikro-syringe (penyuntik berukuran mikro). Sample diteteskan pada
salah satu bagian tepi pelat kromatografi. Pelarut harus nonpolar dan mudah
menguap. Kolom-kolom dalam pelat dapat diciptakan dengan mengerok lapisan
vertical searahgerakan pelarut. Teknik ascending  digunakan untuk melaksanakan
pemisahan yang dilakukan pada temperature kamar, sampai permukaan pelarut
mencapai tinggi 15-18 cm. waktu yag diperlukan antara 20-40 menit. Semua teknik
yang digunakan untuk kromatografi kertas dapat di pakai juga untuk kromatografi
lapis tipis. Resolusi KLT juah lebih tinggi daripada kromatografi kertas karena laju
difusi yang luar biasa kecilnya pada lapisan pengadsorpsi. RRPC dapat juga dilakukan
pada kromatografi lapisan ini, dengan menggunakan lapisan yang sudah dicelupkan
lebih dahulu pada perafin, minyak silikon, dan lain-lain. Pelarut yang digunakan
adalah CH3COOH atau asetonitril. Kadangkala untuk RPPC, waktu yang diperlukan
cukup lama.

Zat-zat warna dapat terlihat langsung, tetapi dapat juga digunakan reagent
penyemprot untuk melihat bercak suatu zat. Asam kromat sering digunakan untuk zat
organic. Demikian juga penandaan secara radiokomia juga dapat digunakan. Untuk
menempatkan posisi suatu zat, reagent dapat juga disemprotkan pada bagian tepi saja.

4
Bagian yang lainnya dapat diperoleh kembali tanpa pengotoran dari reagent dengan
pengerokan setelah pemisahan selesai.

Untuk analisis kuatitatif dapat digunakan plot fotodensitometri. Analisisnya

dapat dilakukan dengan spektrofotometer UV, sinar tampak, IR atau flourosens atau
dengan reaksi kolorimeter dengan reagent kromogenik.

Aplikasi KLT sangatlah luas. Senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap

serta terlalu labil untuk kromatografi cair dapat dianalisis dengan KLT. Ia dapat pula
untuk memeriksa adanya zat pengotor dalam pelarut. Ahli kimia foresik
menggunakan KLT untuk bermacam pemisahan. Pemisahan berguna dari plasticizer,
antioksidan, tinta dan formulasi zat pewarna dapat ditentukan dengan KLT.
Pemakaiannya juga meluas dalam pemisahan anorganik.

B. Kelebihan dan Kekurangan Kromatografi Lapis Tipis

Beberapa kelebihan KLT yaitu:

 KLT lebih banyak digunakan untuk tujuan analisis

 Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna,
fluoresensi, atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.
 Dapat dilakukan elusi secara mekanik (ascending), menurun (descending),
atau dengan cara elusi 2 dimensi.
 Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan
ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.
 Hanya membutuhkan sedikit pelarut.
 Biaya yang dibutuhkan terjangkau.
 Jumlah perlengkapan sedikit.
 Preparasi sample yang mudah
 Dapat untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipid dan hidrokarbon) yang
dengan metode kertas tidak bisa

Adapun kekurangan KLT  yaitu:

 Butuh ketekunan dan kesabaran yang ekstra untuk mendapatkan bercak/noda

yang diharapkan.
 Butuh sistem trial and eror untuk menentukan sistem eluen yang cocok.

5
  Memerlukan waktu yang cukup lama jika dilakukan secara tidak tekun.

C. Prinsip Kerja Kromatografi Lapis Tipis

Pada dasarnya KLT digunakan untuk memisahkan komponen-komponen

berdasarkan perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase diam di bawah gerakan pelarut
pengembang (Watson, 2010). KLT sangat mirip dengan kromatografi kertas, terutama
pada cara pelaksanaannya. Perbedaan nyata terlihat pada fase diamnya atau media
pemisahnya, yakni digunakan lapisan tipis adsorben sebagai pengganti kertas.

Pada proses pemisahan dengan kromatografi lapis tipis, terjadi hubungan

kesetimbangan antara fase diam dan fasa gerak, dimana ada interaksi antara
permukaan fase diam dengan gugus fungsi senyawa organik yang akan diidentifikasi
yang telah berinteraksi dengan fasa geraknya. Kesetimbangan ini dipengaruhi oleh 3
faktor, yaitu : kepolaran fase diam, kepolaran fase gerak, serta kepolaran dan ukuran
molekul.

D. Pembuatan Lapisan Tipis

Penyerap dituangkan diatas permukaan plat yang kondisi bentuknya baik,

biasanya digunakan plat kaca / aluminium. Ukuran yang digunakan tergantung pada
jenis dari pemisahan yang akan dilakukan dan jenis dari bejana kromatografi.
Seringkali bentuk plat kaca  / aluminium dijual dengan ukuran 20 x 5 cm atau 20 x 20
cm, dua ukuran ini dianggap sebagai “standard”.  Hal yang penting yaitu bahwa
permukaan dari plat harus rata.  Plat -plat kaca / aluminium sebelum dipakai dicuci
terlebih dahulu dengan air dan detergent kemudian dikeringkan. Terakhir, dapat
dicuci dengan aseton, tetapi hal ini tidak mesti dilakukan. Satu hal yang perlu
diperhatikan jangan menyentuh permukaan dari plat yang bersih dengan jari tangan
karena bekas jari tangan yang menempel akan merubah tebal dari permukaan
penyerap pada plat.

Untuk membuat penyerap, pertama bahan penyerap dicampur dengan air

sampai menjadi bubur, biasanya dengan perbandingan x gram penyerap dan 2x ml air.
Bubur diaduk sampai rata dan dituangkan diatas plat dengan berbagai cara. Tebal
lapisan merupakan faktor yang paling penting dalam kromatografi lapisan tipis. Tebal

6
standard adalah 250 mikron. Lapisan-lapisan yang lebih tebal ( 0.5  -  2.0 mm )
digunakan untuk pemisahan-pemisahan yang sifatnya besar, dengan menggunakan
penyerap  hingga 250 mg untuk plat dengan ukuran 20 x 20 cm. Salah satu kesukaran
dengan lapisan tebal ialah adanya tendensi mengelupas bila kering. 

Tabel 2.2 Perbandingan untuk membuat bubur penyerap

Penyerap Medium bubur penyerap Perbandingan, gram

dalam ml

Silika gel Metilena klorida : methanol 35 gr dalam 100 ml

(2:2, v/v)

Serbuk selulosa Metilena klorida : methanol 50 gr dalam 100 ml

(50:50, v/v)

Alumina Metilena klorida : methanol 60 gr dalam 100 ml

(70:30, v/v)

Sifat yang terpenting dari penyerap adalah besar partikel bubur penyerap dan
homogenitasnya, karena adhesi terhadap plat sangat tergantung pada kedua sifat
tersebut. Besarnya partikel yang biasa digunakan adalah 1  –  25 mikron. Partikel
yang butirannya sangat kasar tidak akan memberikan hasil yang memuaskan dan
salah satu alasan untuk menaikkan hasil pemisahan adalah menggunakan penyerap
yang butirannya halus. Sedangkan dalam kolom partikel yang sangat halus akan
mengakibatkan aliran  pelarut menjadi lambat, pada lapisan tipis butiran yang halus
memberikan aliran pelarut yang lebih cepat.  Beberapa contoh penyerap yang
digunakan untuk pemisahan-pemisahan dalam kromatografi lapisan tipis adalah
sebagai berikut :  

Tabel 2.3 Macam-macam penyerap untuk kromatografi lapisan tipis

Zat padat Digunakan untuk memisahkan

Silika Asam- asam amino, alkaloid, gula,

7
 asam-asam lemak, lipida, minyak

esensial, anion, dan kation organic,

sterol, terpenoid.

Alumina Alkaloid, zat warna, fenol, steroid,

vitamin-vitamin, karoten, asam-asam

amino

Kieselguhr Gula, oligosakarida, asam- asam

lemak, trigliserida, asam -asam

amino, steroid.

Bubuk selulosa Asam-asam amino, alkaloid, nukleotida

Pati Asam-asam amino

Sephadex Asam-asam amino, protein

E. Definisi Kromatogram

Kromatogram adalah output visual yang diperoleh dari hasil pemisahan.

Sebuah garis menggunakan pinsil digambar dekat bagian bawah lempengan dan
setetes pelarut dari campuran pewarna ditempatkan pada garis itu. Diberikan
penandaan pada garis di lempengan untuk menunjukkan posisi awal dari tetesan. Jika
ini dilakukan menggunakan tinta, pewarna dari tinta akan bergerak selayaknya
kromatogram dibentuk.

Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan ditempatkan dalam

sebuah gelas kimia bertutup berisi pelarut dalam jumlah yang tidak terlalu banyak.
Perlu diperhatikan bahwa batas pelarut berada di bawah garis dimana posisi bercak
berada.

Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bawah kondisi
dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini,

8
dalam gelas kimia biasanya ditempatkan beberapa kertas saring yang terbasahi oleh
pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut.

Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-komponen yang

berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan
tampak sebagai perbedaan bercak warna.

Gambar menunjukkan lempengan setalah pelarut bergerak setengah dari

lempengan. Pelarut dapat mencapai sampai pada bagian atas dari lempengan. Ini akan
memberikan pemisahan maksimal dari komponen-komponen yang berwarna untuk
kombinasi tertentu dari pelarut dan fase diam.

F. Fase Diam dan Fase Gerak

Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil
dengan diameter partikel antara 10-30 µm (Gandjar dan Rohman, 2007). Semakin
kecil ukuran rata-rata partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase
diam, maka semakin baik kinerja KLT dalam hal efisiensi dan resolusinya.

Silika gel salah satu contoh fase diam yang  terbentuk dari silikon dioksida (silika).
Atom silikon dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar.
Namun, pada permukaan silika gel, atom silikon berlekatan pada gugus -OH. Jadi,
pada permukaan jel silika terdapat ikatan Si-O-H selain Si-O-Si.

Permukaan silika gel sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk
ikatan hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya, sebagaimana
halnya gaya van der Waals dan atraksi dipol-dipol.

Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina dari aluminium
oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Pada dasarnya
sifat serta penggunaannya mirip silika gel.

Tabel 1. Fase diam yang sering digunakan pada KLT (Kealey dan Haines, 2002)

Fasa Diam Mekanisme Sorpsi Penggunaan

Silika gel Adsorpsi Asam amino, hidrokarbon, vitamin,

alkaloid

9
 Serbuk selulosa Partisi Asam amino, nukleotida,
karbohidrat

Selulosa penukar Pertukaran ion Asam nukleat, nukleotida, halida

ion dan ion-ion logam

Gel sephadex Eksklusi Polimer, protein, kompleks logam

Β-siklodekstrin Interaksi adsorpsi Campuran enansiomer

stereospesifik

Adsorben yang sering digunakan antara lain :

a) Silika gel
Yang paling banyak digunakan dalam pengujian, bersifat asam lemah, sering
ditambah CaSO4 (gibs) sebagai pengikat agar melekat kuat pada penyangga.
Penambahan ini juga mempercepat mengeringnya lapis tipis. Juga dapat
ditambahkan indicator fluoresensi yang akan berfluoresensi di bawah sinar
UV pada 254 nm, hingga noda yang mengabsorpsi pada frekuensi ini menjadi
sangat kontras terhadap latar belakang yang berfluoresensi hijau kuning. Silica
gel sangat higroskopis, pada humaditas relative 45 – 75% akan menarik air
sampai 7 – 20%. Derajat diaktivasinya ditentukan oleh kelembaban ruangan
dimana pemisahan akan dilakukan atau tempat penyimpanan lapis tipisnya.
Kemurnian juga penting karena dapat mempengaruhi watak kromatografi
beberapa senyawa tertentu. Pencemar dalam adsorben ini dapat juga
menyebabkan dekomposisi senyawa yang hendak dianalisa.
b) Alumina
Bersifat basa lemah. Tidak sebaik silica gel dan lebih relative secara kimia
hingga untuk senyawa yang sensitive dapat terdegrasi. Juga dapat ditambah
Ca2SO4 dan indicator fluoresensi.
c) Kieselguhr (tanah diatome)
Merupakan adsorben netral dengan aktivitas rendah. Daya resolusinya juga
kecil. Dapat ditambahkan sebagai campuran pada silikagel yang akan

10
 memberikan adsorben campur yang kurang aktif. Juga dapat ditambah
Ca2SO4.
d) Selulosa
Dengan menggunakan selulosa sebagai adsorben akan didapat lapis tipis yang
sifatnya analog dengan kromatografi kertas. Memberikan lapis tipis yang baik
tanpa pengikat. Adsorben ini dapat ditambah indicator fluoresensi atau Ca
asetat. Kerugian penggunaan selulosa ini ialah tidak dapat digunakannya
pereaksi yang korosif seperti asam sulfat atau pereaksi destruktif lainnya.
e) Poliamida
Merupakan magnesium silikat. Daya melekatnya tidak sebaik adsorben
lainnya. Biasanya ditambahkan pengikat seperti selulosa atau amilum.
Mempunyai kapasitas yang besar dan banyak digunakan untuk pemisahan
fenol.

Selain fasa diam, dalam KLT juga diperlukan fasa gerak/eluent yang berperan
penting pada proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fasa diam
(adsorbent). Interaksi antara adsorbent dengan eluent sangat menentukan terjadinya
pemisahan komponen. Oleh sebab itu pemisahan komponen secara  kromatografi
dipengaruhi oleh laju alir eluent dan jumlah umpan. Eluent dapat digolongkan
menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut atau campuran pelarut tersebut pada
adsorben dan dalam hal ini yang banyak digunakan adalah jenis  adsorben alumina
atau sebuah lapis tipis silika. Suatu pelarut yang bersifat larutan relatif polar, dapat
mengusir pelarut yang tak polar dari ikatannya dengan alumina (gel silika). Semakin
dekat kepolaran antara senyawa dengan eluen maka senyawa akan semakin terbawa
oleh fase gerak tersebut. Hal ini berdasarkan prinsip “like dissolved like” .

G. Prosedur Kerja dengan Kromatografi Lapis Tipis

Pada KLT, fasa diam berupa plat yang biasanya disi dengan silica gel. Sebuah
garis pensil digambar dekat bagian bawah fasa diam dan setetes larutan sampel
ditempatkan di atasnya. Sampel ditotol dengan bantuan pipa kapiler. Garis pada fasa
diam berguna untuk menunjukkan posisi asli sampel. Pembuatan garis harus
menggunakan pensil karena jika semua ini dilakukan dengan tinta, pewarna dari tinta
juga akan bergerak sebagai kromatogram berkembang. Ketika titik campuran kering,
fasa diam diletakkan berdiri dalam gelas tertutup yang telah berisi fasa gerak dengan

11
posisi fasa gerak di bawah garis. Digunakan gelas tertutup untuk memastikan bahwa
suasana dalam gelas jenuh dengan uap pelarut.

Pelarut (fasa gerak) perlahan-lahan bergerak naik. Komponen-komponen yang

berbeda dari campuran berjalanan pada tingkat yang berbeda dan campuran
dipisahkan memiliki warna yang berbeda. Diagram menunjukkan plat setelah pelarut
telah bergerak sekitar setengah jalan. Pelarut diperbolehkan untuk naik hingga hampir
mencapai bagian atas plat yang akan memberikan pemisahan maksimal dari
komponen-komponen pewarna untuk kombinasi tertentu dari pelarut dan fase diam.

Identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah pada lapisan tipis lebih baik
dikerjakan dengan pereaksi kimia dan reaksi-reaksi warna. Untuk identifikasi
menggunakan harga Rf meskipun harga-harga Rf dalam lapisan tipis kurang tepat bila
dibandingkan pada kertas. Seperti halnya pada kertas harga Rf didefinisikan sebagai
berikut: Harga-harga Rf untuk senyawa-senyawa murni dapat dibandingkan dengan
harga-harga standard. Perlu diperhatikan bahwa harga-harga Rf yang diperoleh
berlaku untuk campuran tertentu dari pelarut dan penyerap yang digunakan, meskipun
daftar dari harga-harga Rf untuk berbagai campuran dari pelarut dan penyerap dapat
diperoleh (Gritter et al, 1991).

Ada dua cara untuk menyelesaikan analisis sampel yang tidak berwarna, yaitu:

1. Menggunakan pendarflour
Fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis seringkali memiliki substansi
yang ditambahkan kedalamnya, supaya menghasilkan pendaran flour ketika
diberikan sinar ultraviolet (UV). Itu berarti jika sinar UV disinarkan, maka
sampel akan berpendar.
Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada,
meskipun bercak-bercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata.
Itu berarti bahwa jika disinarkan sinar UV pada lempengan, akan timbul
pendaran dari posisi yang berbeda dengan posisi bercak-bercak. Bercak
tampak sebagai bidang kecil yang gelap. Sementara UV tetap disinarkan pada
lempengan,, kita harus menandai posisi-posisi dari bercak-bercak dengan
menggunakan  pensil dan melingkari daerah bercak-bercak itu. Karena jika
kita  mematikan sinar UV tersebut, bercak-bercaknya tidak tampak kembali.
2. Penunjukkan bercak secara kimia

12
 Dalam beberapa kasus, dimungkinkan untuk membuat bercak-bercak menjadi
tampak dengan cara mereaksikannya dengan zat kimia sehingga menghasilkan
produk yang berwarna. Sebuah contoh yang baik adalah kromatogram yang
dihasilkan dari campuran asam amino. Kromatogram dapat dikeringkan dan
disemprotkan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan asam
amino menghasilkan senyawa-senyawa berwarna, umumnya coklat atau ungu.
Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian
ditempatkan pada wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan gelas
arloji) bersama dengan kristal iodium. Uap iodium dalam wadah dapat
berekasi dengan bercak pada kromatogram, atau dapat dilekatkan lebih dekat
pada bercak daripada lempengan. Substansi yang dianalisis tampak sebagai
bercak-bercak kecoklatan.

H. Instrument Kromatografi Lapis Tipis

1. Detektor
Detektor pada alat TLC Scanner 3 CAMAG menggunakan
photomultipliers. Komponen didalam phot omultipier (PMT) sendiri
adalah photomultiplier tube (tabung vakum photomultiplier), photocathode
(katoda metalik yang terbuat dari bahan logam multi alkali), struktur
dynode (berbentuk lempengan cekung) dan anoda (memilki spectral
sensitivity 185-850 nm). 
Prinsip kerja dari PMT adalah permukaan logam katoda  disinari dengan
seberkas cahaya dan sejumlah elektron terpancar dari permukaannya, yang
biasa disebut dengan efek fotoelektrik dengan kondisi hampa udara.
Elektron yang terpancar dan terlepas karena adanya sekumpulan energi
yang timbul dan dikuatkan oleh susunan komponen dynode (linier -
focused type) secara berurutan dan keluar mengenai anoda. Elektron
tersebut terikat dalam logam dengan energi W (eV), yang dikenal sebagai
fungsi kerja (work function), logam yang berbeda memilki fungsi kerja
yang berbeda pula. Dan logam katoda yang digunakan sebagai permukaan
fotosensitif, dibawah panjang gelombang pancung  (cutoff  wavelength) 
λc, sembarang sumber cahaya, selemah apapun, akan menyebabkan
terjadinya pemancaran fotoelektron.    

13
 Cahaya yang masuk difokuskan dengan melewati focusing electrode dan
elektron mengenai dynode pertama kemudian dipantulkan dan dipancarkan
ke dynode kedua sampai ke dynode yang terakhir (proses pengalian)
sehingga terjadi muatan elektron yang lebih besar dan timbul tegangan.  
2. Monokromator
Monokromator adalah alat yang paling umum dipakai untuk menghasilkan
berkas radiasi dengan satu panjang gelombang. Monokromator untuk
radiasi ultra violet, sinar tampak dan infra merah adalah serupa, yaitu
mempunyai celah (slit), lensa, cermin dan prisma atau grating. Terdapat 2
macam monokromator yaitu monokromator prisma Bunsen dan
monokromator grating Czerney-Turney
Fungsi prisma adalah untuk memisahkan sinar polikromatis dari sumber
cahaya menjadi sinar monokromatis.   Bila seberkas cahaya dilewatkan
melalui sebuah prisma, maka cahaya tersebut akandiuraikan menjadi
beberapa warna (terdapat berbagai warna merah, jingga, hijau, biru,  dan
lain-lain).
3. Absorbansi
Penyerapan hanya terjadi jika energi foton yang datang cocok dengan
energy yang diperlukan untuk memindahkan satu elektron terluarnya dari
tingkat dasar ke tingkat tereksitasi (atau dari pita valensi ke pita konduksi
di dalam zat padat).   Dengan spektroskopi dari cahaya transmisi bisa
diketahui tingkat/pita energi dari suatu atom/molekul/zat padat.
Berkas radiasi elektromagnet bila dilewatkan pada sampel kimia maka
sebagian akan terabsorpsi. Energi elektromagnet yang ditransfer ke
molekul sampel akan menaikan tingkat energi (tingkat tereksitasi).
Molekul akan dieksitasi sesuai dengan panjang gelombang yang
diserapnya.  

Rumus yang digunakan untuk menghitung besarnya energi yang diserap:

E = h x ν = h x C /λ = h x C / v

dimana, E = energi yang diserap  

                        h = tetapan Planck = 6,626 x 10-34

14
                        v = frekuensi 

                        C = kecepatan cahaya = 2,998 x 108 m/det 

                        λ = panjang gelombang  

                        ν = bilangan gelombang 

Absorbansi dengan simbol A dari suatu larutan merupakan logaritma dari 1/T atau
logaritma Io/It.

A = log (1/T) = log (Io/It) = -  log (T)

            dimana, A  = Absorbansi / serapan 

                          Io = Intensitas sinar yang datang 

                          It = Intensitas sinar yang diteruskan

                          T = Transmitance / transmitansi   

4. Transmitansi
Apabila suatu berkas sinar radiasi dengan intensitas Io dilewatkan melalui
suatu larutan dalam wadah transparan maka sebagian radiasi akan diserap
sehingga intensitas radiasi yang  diteruskan It menjadi lebih kecil dari Io. 
Transmitansi dengan simbol T dari larutan merupakan fraksi dari radiasi
yang diteruskan atau ditansmisikan oleh larutan, yaitu : T = It/Io.
Transmitansi biasanya dinyatakan dalam persen (%).

Faktor – Faktor yang Mempengaruhi Kromatografi Lapis Tipis

Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatografi lapisan

tipis yang juga mempengaruhi harga Rf  adalah :

1. Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan.

2. Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya.
Biasanya aktifitas dicapai dengan pemanasan dalam oven, hal ini akan
mengeringkan molekul-molekul air yang menempati pusat-pusat serapan
dari penyerap. Perbedaan penyerap akan memberikan perbedaan yang

15
 besar terhadap harga  Rf meskipun menggunakan fase bergerak dan zat
terlarut yang sama tetapi hasil akan dapat diulang dengan hasil yang
sama,   jika menggunakan penyerap yang sama, ukuran partikel tetap  dan
jika pengikat (kalau ada) dicampur hingga homogen.
3. Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap.
Pada prakteknya tebal lapisan tidak dapat dilihat pengaruhnya, tetapi perlu
diusahakan tebal lapisan yang rata. Ketidakrataan akan menyebabkan
aliran pelarut menjadi tak rata pula dalam daerah yang kecil dari plat.
4. Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase bergerak.
Kemurnian dari pelarut yang digunakan sebagai fase bergerak dalam
kromatografi lapisan tipis adalah sangat penting dan bila campuran pelarut
digunakan maka perbandingan yang dipakai harus betul-betul
diperhatikan.
5. Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang digunakan.
6. Teknik percobaan.
Arah pelarut bergerak di atas plat. (Metoda aliran penaikan yang hanya
diperhatikan, karena cara ini yang paling umum meskipun teknik aliran
penurunan dan mendatar juga digunakan).
7. Jumlah cuplikan yang digunakan.
Penetesan cuplikan dalam jumlah yang berlebihan memberikan hasil
penyebaran noda-noda dengan kemungkinan terbentuknya ekor dan efek
tak kesetimbangan lainnya, hingga akan mengakibatkan kesalahan-
kesalahan pada harga-harga Rf.

8. Suhu.
Pemisahan-pemisahan sebaiknya dikerjakan pada suhu tetap, hal ini
terutama untuk mencegah perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut
yang disebabkan oleh penguapan atau perubahan-perubahan fase.
9. Kesetimbangan.
Ternyata bahwa kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih penting dalam
kromatografi kertas, hingga perlu mengusahakan atmosfer dalam bejana
jenuh dengan uap pelarut. Suatu gejala bila atmosfer dalam bejana tidak
16
 jenuh dengan uap pelarut, bila digunakan pelarut campuran, akan terjadi
pengembangan dengan permukaan pelarut yang berbentuk cekung dan fase
bergerak lebih cepat pada bagian tepi-tepi  dan keadaan ini harus dicegah.

I. Aplikasi KLT Pada Bidang Pangan

Pada penelitian analisis kualitastif pewarna rhodamin B dalam sampel saus

tomat. Sampel dianalisis dengan metode Kromatografi Lapis Tipis. Zat warna dari
sampel saus tomat ditarik kedalam benang wol bebas lemak dalam suasana asam
sampai benang wol tersebut terwarnai oleh pewarna saus tomat.

Setelah benang wol terwarnai oleh pewarna saus tomat, pewarna tersebut
dilepaskan ke dalam larutan basa. Larutan basa tersebut selanjutnya akan digunakan
sebagai cuplikan sampel pada analisis Kromatografi Lapis Tipis. Noda totolan sampel
dibandingkan dengan noda totolan baku standar rhodamin B yang telah dieluasi
bersama-sama dan dilihat di bawah lampu UV pada λ 366 dan λ 254 nm, apabila
terdapat zat pewarna rhodamin B dalam sampel maka noda pada lempeng KLT akan
berflouresensi di lampu UV pada λ 366 nm dan tidak berflorousensi dilampu UV pada
λ 254 nm, pada penelitian ini noda totolan sampel pada lempeng KLT tidak
menunjukan flouresensi di lampu UV pada λ 366 nm, sehingga dapat disimpulan
bahwa pada sampel saus tomat ini tidak terkandung zat pewarna rhodamin B.

17
 BAB III

PENUTUP

A. Kesimpulan
Kromatografi Lapis Tipis Yaitu kromatografi yang menggunakan
lempeng gelas atau alumunium yang dilapisi dengan lapisan tipis alumina,
silika gel, atau bahan serbuk lainnya. Kromatografi lapis tipis pada umumnya
dijadikan metode pilihan pertama pada pemisahan dengan kromatografi.
Prinsip kerja Kromatografi Lapis Tipis memisahkan sampel
berdasarkan perbedaan kepolaran antara sampel dengan pelarut yang
digunakan. Teknik ini biasanya menggunakan fase diam dari
bentuk plat silika dan fase geraknya disesuaikan dengan jenis sampel yang
ingin dipisahkan. Larutan atau campuran larutan yang digunakan
dinamakan eluen Semakin dekat kepolaran antara sampel dengan eluen maka
sampel akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut.
Cara Kerja Kromatografi Lapis Tipis
 Sebuah garis menggunakan pinsil digambar dekat bagian bawah
lempengan dan setetes pelarut dari campuran pewarna ditempatkan
pada garis itu.
 Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan ditempatkan
dalam sebuah gelas kimia bertutup berisi pelarut dalam jumlah yang
tidak terlalu banyak. Perlu diperhatikan bahwa batas pelarut berada di
bawah garis dimana posisi bercak berada.
 Menutup gelas kimia untuk meyakinkan bawah kondisi dalam gelas
kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi
ini, dalam gelas kimia biasanya ditempatkan beberapa kertas saring
yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan
uap mencegah penguapan pelarut.
B. Saran
Penulis menyadari bahwa makalah ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena
itu penulis sangat mengharapkan saran dan kritik yang sifatnya membangun
agar dalam pembuatan makalah selanjutnya bias lebih baik lagi, atas
perhatiannya penulis ucapkan terimakasih.

18
 DAFTAR PUSTAKA

Rubianto, Dwiarso. 2017. Metode Kromatografi Prinsip Dasar, Praktikum dan

Pendekatan Pembelajaran Kromatografi.Deepublish : Yogyakarta.

Sudarwati, Tri P. L., dan Fernanda, M. A. H. F.2019. Aplikasi Pemanfaatan DAUN

PEPAYA (Carica papaya) Sebagai Biolarvasida Terhadap Larva Aedes
Aegypti.Graniti : Gresik.

Wulandari, Lestyo. 2011. Kromatografi Lapis Tipis.PT. Taman Kampus Presindo:

Jember.

19
LAMPIRAN

20
21