MAKALAH KIMIA ANALITIK II

“Kromatografi Cair Kinerja Tinggi”

Dosen Pengampu: Sri Haryati, S.Pd, M.Si

Disusun Oleh: Kelompok 6

Huswatun Hasanah : (1705111044)

Masfril Sinaga : (1705114272)
Rizky Hajj Pertiwi : (1705114187)
Sri Wati Anggreswara : (1705111088)
Wilda Andriyani : (1705122821)

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN KIMIA

JURUSAN PENDIDIKAN MIPA

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN

UNIVERSITAS RIAU

2019
 KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa yang telah memberikan
rahmat serta, taufik dan hidayah-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan
makalah dengan judul “Kromatografi Cair Kinerja Tinggi” tepat pada waktunya.
Makalah ini disusun guna memenuhi tugas mata kuliah Kimia Analitik 2, Fakultas
Keguruan Dan Ilmu Pendidikan Universitas Riau.
Penulis mengucapkan terimakasih kepada Dosen Pembimbing. Dalam
pembuatan makalah ini penulis menyadari bahwa masih banyak terdapat
kekurangan, karena keterbatasan kemampuan dan pengetahuan yang ada pada diri
penulis sehingga jauh dari harapan.
Oleh karena itu, penulis sangat mengharapkan saran dan kritik yang
membangun demi kesempurnaan tugas ini. Semoga makalah ini dapat bermanfaat
bagi para pembaca pada khususnya dan masyarakat pada umumnya.

Pekanbaru, 28 April 2019

Penulis

i
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR .............................................................................................i

DAFTAR ISI ............................................................................................................ii
BAB I PENDAHULUAN
1.1.Latar Belakang ..............................................................................................1
1.2.Rumusan Masalah .........................................................................................2
1.3.Tujuan ............................................................................................................2

BAB II PEMBAHASAN

2.1.Pengertian dan Prinsip Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ............................3

2.2.Jenis dan Kelebihan/Kekurangan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ............4
2.3.Instrumen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dan Fungsi nya .......................6
2.4.Cara Kerja Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.................................. .............25
2.5.Kelebihan dan Kekurangan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi....... ..............26
2.6.Aplikasi Kromatografi Cair Kinerja Tinggi................................... ................27

BAB III PENUTUP

3.1.Kesimpulan ..................................................................................................30
3.2.Saran ............................................................................................................30

DAFTAR PUSTAKA ..............................................................................................31

ii
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

lstilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-
daerah yang berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada waktu yang
hampir bersamaan, D.T. Day juga menggunakan kromatografi untuk
memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah yang pertama diakui
sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi.
Penyelidikan tentang kromatografi kendor untuk beberapa tahun sampai
digunakan suatu teknik dalam bentuk kromatografi padatan cair (LSC).
Kemudian pada akhir tahun 1930 an dan permulaan tahun 1940 an,
kromatografi mulai berkembang. Dasar kromatografi lapisan tipis (TLC)
diletakkan pada tahun 1938 oleh Izmailov dan Schreiber, dan kemudian
diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil karya yang baik sekali dari
Martin dan Synge pada tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan Nobel)
tidak hanya mengubah dengan cepat kroinatografi cair tetapi seperangkat
umum langkah untuk pengembangan kromatografi gas dan kromatografi
kertas. Pada tahun 1952 Martin dan James mempublikasikan makalah
pertama mengenai kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir tahun
1960 an kromatografi gas dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang
canggih.
Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas
berdiameter besar, pada dasamya dibawah kondisi atmosfer. Waktu analisis
lama dan segala prosedur biasanya sangat membosankan. Pada akhir tahun
1960 an, semakin banyak usaha dilakukan untuk pengembangan kromatografi
cair sebagai suatu teknik mengimbangi kromatografi gas. High Performance
Liquid Chromatography (KCKT) atau Kromatografi Cair Penampilan Tinggi
atau High Preformance = Tekanan atau Kinerja Tinggi, High Speed =
Kecepatan Tinggi dan Modern = moderen) telah berhasil dikembangkan dari
usaha ini. Kemajuan dalam keduanya instrumentasi dan pengepakan kolom

1
 terjadi dengan cepatnya sehingga sulit untuk mempertahankan suatu bentuk
hasil keahlian membuat instrumentasi dan pengepakan kolom dalam keadaan
tertentu. Tentu saja, saat ini dengan teknik yang sudah matang dan dengan
cepat KCKT mencapai suatu keadaan yang sederajat dengan kromatografi
gas.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang masalah yang telah dijelaskan, dapat diajukan
beberapa rumusan masalah yang akan dibahas dalam makalah ini, sebagai berikut:
1. Apakah pengertian dan prinsip dari Kromatografi Cair Kinerja Tinggi?
2. Apa saja jenis Kromatografi Cair Kinerja Tinggi?
3. Apa saja intrumen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dan fungsinya?
4. Bagaimana cara kerja Kromatografi Cair Kinerja Tinggi?
5. Apa kelebihan dan kelemahan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi?
6. Bagaimana aplikasi Kromatografi Cair Kinerja Tinggi?

1.3 Tujuan
Berdasarkan rumusan masalah yang telah diambil, terdapat beberapa tujuan
dari pengkajian makalah yang kami tulis, yaitu :
1. Untuk mengetahui pengertian dan prinsip dari Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi?
2. Untuk mengetahui jenis Kromatografi Cair Kinerja Tinggi?
3. Untuk mengetahui intrumen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dan
fungsinya?
4. Untuk mengetahui cara kerja Kromatografi Cair Kinerja Tinggi?
5. Untuk mengetahui kelebihan dan kelemahan Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi?
6. Untuk mengetahui aplikasi Kromatografi Cair Kinerja Tinggi?

2
 BAB II
PEMBAHASAN

2.1 Pengertian Dan Prinsip Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ((Inggris) : high performance liquid

chromatography, KCKT) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair
yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. Seperti teknik kromatografi pada
umumnya, KCKT berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan
afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan
fase cair dan zat padatnya merupakan fase diam (stasioner). Teknik ini sangat
berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa
mempunyai afinitas selektif antara fase diam tertentu dan fase gerak tertentu.
Dengan bantuan detektor serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram.
Kromatorgram memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa.

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan metode yang tidak

destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif.
KCKT paling sering digunakan untuk :

1. Menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-

asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis
2. Menetukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses
sintesis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi.

Komatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan teknik pemisahan

senyawa dengan cara melewatkan senyawa melalui fase diam (stationary phase)
dengan menggunakan fase gerak (mobile phase) mengaliri semua ini. Senyawa
dalam kolomakan . keluar dari kolom atas dasar kepolaran yang berbeda, sehingga
akan mempengaruhi kekuatan interaksi senyawa dengan fase diam dan fase gerak.

3
Prinsip Dasar Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Kerja KCKT pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan

kepolarannya. Alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu
sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan KCKT dengan kromatografi
lainnya adalah pada KCKT digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa
gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya dan kecepatannya
untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati
pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah.
Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon <
senyawa terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton <
golongan alkohol < golongan asam.
Prinsip dasar KCKT dalam teknik pemisahan adalah pemisahan komponen
terjadi karena kekuatan interaksi antara solute-solut terhadap fase diam. Pada
kerjanya, KCKT menggunakan fase gerak untuk memisahkan komponen dari
sebuah campuran komponen. Pemisahan setiap komponen dalam sampel terjadi
berdasarkan kepolarannya. Campuran komponen akan terpisah berdasarkan
kepolarannya dan waktu retensinya akan berbeda, hal ini akan teramati pada
spektrum yang puncak-puncaknya terpisah. KCKT berbeda dari kromatografi
kolom cairan konvensional dalam penggunaan bahan pengisi kolom yang berupa
partikel sangat kecil berukuran 3-5 µm, sehingga diperlukan adanya tekanan
tinggi hingga 20.000 Kpa untuk mengalirkan fase gerak melalui kolom tersebut.
Bahan pengisi kolom yang lebih kecil menyebabkan KCKT memiliki kecepatan
analisis yang lebih baik dan memiliki daya pisah tinggi.

2.2 Jenis-jenis Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ( KCKT )

a. Kromatogarafi padat-cair

Teknik ini tergantung pada teradsorpsinya zat padat pada adsorben yang
polar seperti silika gel atau alumina.Kromatografi lapisan tipis (TLC) adalah
salah satu bentuk dari LSC.Dalam KCKT kolom dipadati atau dipak dengan
partikel-partikel micro or macro particular (berkulit tipis 37-44µ).Sebagian

4
besar dari KCKT sekarang ini dibuat untuk mencapai partikel-partikel
microparticulate lebih kecil 20µ.Teknik ini biasanya digunakan untuk zat padat
yang mudah larut dalam pelarut organik dan tidak terionisasi.Teknik ini
terutama sangat kuat untuk pemisahan isomer-isomer.

b. Kromatografi partisi

Teknik ini bergantung pada partisi zat padat diantara dua pelaru yang
tidak dapat bercampur salah satu diantranya bertindak sebagai rasa diam dan
yang lainnya sebagai fase gerak.Pada keadaan awal dari kromatografi cair
(LSC),rasa diamnya dibuat dengan cara yang sama seperti pendukung pada
kromatografi gas (GC).Fasa diam (polar atau non polar) dilapisi pada suatu
pendukung inert dan dipakai kedalam sebuah kolom.Kemudian rasa gerak
dilewatkan melalui kolom.Bentuk kromatografi partisi ini disebut kromatografi
cair-cair (LLC).

Untuk memenuhi kebutuhan akan kolom-kolom yang dapat lebih tahan

lama, telah dikembangkan pengepakan fase diam yang berikatan secara kimia
dengan pendukung inert. Bentuk kromatografi partisi ini disebut kromatografi
fase terikat (BPC = Bonded Phase Chromatography). BPC dengan cepat
menjadi salah satu bentuk yang paling populer dari KCKT. Kromatografi
partisi (LLC dan BPC), disebut "fase normal" bila fase diam lebih polar dari
fase gerak dan "fase terbalik" bila fase gerak lebih polar dari pada fase diam.

c. Kromatografi penukar ion

Teknik ini tergantung pada penukaran (adsorpsi) ion-ion di antara fase

gerak dan tempat-tempat berion dari pengepak. Kebanyakan mesin-mesin
berasal dari kopolimer divinilbenzen stiren dimana gugus-gugus fungsinya
telah ditambah. Asam sulfonat dan amin kuarterner merupakan jenis resin
pilihan paling baik untuk digunakan Keduanya, fase terikat dan resin telah
digunakan. Teknik ini digunakan secara luas dalam life sciences dan dikenal

5
 untuk pemisahan asam-asam amino. Teknik ini dapat dipakai untuk keduanya
kation dan anion.

2.3 Instrumen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dan Fungsinya

a. Fase gerak

Fase gerak dalam KCKT adalah berupa zat cair dan disebut juga dengan
eluen atau pelarut. Fase gerak di dalam KCKT selain berfungsi sebagai
pembawa komponen-komponen campuran menuju detektor, fase gerak dapat
berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fase gerak dalam merupakan
salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan (Hendayana, 2006).
Sebelum digunakan, fase gerak harus dihilangkan gasnya terlebih dahulu
(degassing) untuk menghindari berkumpulnya gas dengan komponen lain pada
pompa dan detektor. Fase gerak juga harus disaring untuk menghindari
partikel-partikel kecil yang dapat terkumpul dalam kolom atau tabung yang
sempit sehingga mengakibatkan kekosongan pada kolom atau tabung tersebut.

Zat cair yang akan digunakan sebagai fase gerak harus memenuhi
beberapa persyaratan, antara lain:
(1) Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk sampel yang akan
dianalisis
(2) Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang
dapat mengganggu interpretasi kromatogram
(3) Zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada
kolom.
(4) Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak
beracun
(5) Zat cair tidak kental. Umumnya tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise)
(6) Sesuai dengan detektor yang berfungsi untuk mendeteksi solut-solut yang
keluar dari kolom analitik.
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat
bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi.

6
Daya elusi dan resolusi ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas
fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Fase normal (fase diam
lebih polar dari pada fase gerak) kemampuan elusi meningkat dengan
meningkatnya polaritas pelarut dan untuk fase terbalik (fase diam kurang polar
dari pada fase gerak) kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya
polaritas pelarut. Penentuan untuk pemilihan fase gerak dapat berdasarkan
deret eluotropik (Tabel 1.).

Elusi pada KCKT dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi

fase gerak tetap sama selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi
fase gerak berubah-ubah selama elusi). Elusi bergradien digunakan untuk
meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel
mempunyai kisaran polaritas yang luas.
Tabel 1. Deret eluotropik pelarut-pelarut untuk KCKT

Parameter Parameter
kekuatan kekuatan UV cut-off
Pelarut pelarut pelarut (nm)
(adsorpsi) (partisi)

n-heksana 0,01 0,1 195

Sikloheksana 0,04 -0,2 200
tertaklorometan 0,18 1,6 265
Metilbenzen 0,29 2,4 285
triklorometan 0,40 4,1 245
Diklorometan 0,42 3,1 230
tertahidrofuran 0,56 4,0 212
Propanon 0,56 3,9 330
Asetonitril 0,65 5,8 190
iso-propanol 0,82 3,9 205
Etanol 0,88 4,3 205
Metanol 0,95 5,1 205
asam etanoat >1 4,4 255
Air >1 10,2 170
(Gandjar and Rohman, 2007)

Dilihat dari jenis fase diam dan fase gerak, KCKT (kolomnya) dibedakan
menjadi:

7
a. Kromatografi fase normal Kromatografi dengan kolom konvensional dimana
terdiri atas :
Fase diam : normal (bersifat polar), misalnya Silika gel
Fase gerak : bersifat non polar Contohnya adalah sebuah kolom sederhana diisi
dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan.
Senyawa-sen\yawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih
lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar.
Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati
kolom.
b. Kromatografi fase terbalik Kromatografi fase terbalik terdiri atas :
Fase diam yang sifatnya non polar, misalnya Silika gel direaksikan dengan
klorosilan,
Fase gerak yang bersifat polar Contoh kasusnya yaitu silika yang dimodifikasi
menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada
permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18.
Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol
seperti metanol. Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut
polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang
terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang
berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan.
Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan
waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut. Senyawa-senyawa non
polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus
hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini
juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan
hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam
molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-
senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat
dalam kolom. Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih
cepat melalui kolom. Keuntungan kromatografi fase terbalik :

8
a) Senyawa yang polar akan lebih baik pemisahannya
b) Senyawa ionic dapat dipisahkan
c) Air dapat digunakan sebagi pelarut

b. Pompa

Pompa dalam KCKT dapat dianalogikan dengan jantung pada manusia

yang berfungsi untuk mengalirkan fase gerak cair melalui kolom yang berisi
serbuk halus. Pompa yang dapat digunakan dalam KCKT harus memenuhi
persyaratan antara lain menghasilkan tekanan sampai 6000 psi, kecepatan alir
berkisar antara 0,1-10 ml/menit, dan bahan tahan korosi.

Terdapat 2 jenis pompa yang banyak digunakan dalam KCKT :

1. Pompa tekanan tetap (costant pressure)

a. Pompa tekanan langsung

Pada pompa jenis ini, gas bertekanan tinggi didesak ke dalam bagian atas
pompa. Gas ini mendesak eluen dalam tabung ke atas. Pompa tekanan
langsung adalah jenis pompa yang paling murah. Kekurangan utamanya ialah
bahwa gas melarut dalam pelarut. Jika pelarut yang jenuh mencapai detektor,
banyaknya gas yang terlarut dalam pelarut lebih besar daripada banyaknya gas
yang setimbang pada tekanan detektor. Hal ini sering sekali menyebabkan
terjadinya gelembung gas dalam sel detektor, yang menimbulkan noise yang
berlebihan pada detektor. Karena adanya masalah yang berkaitan dengan gas
yang terlarut dalam eluen, tekanan kerja maksimum pompa tekanan langsung
biasanya sekitar 1000 psi.

b. Pompa tekanan tetap menengah

Pompa ini lebih mahal sedikit daripada pompa tekanan langsung, tetapi
banyak dipakai pada kromatografi cair. Pompa ini tidak dapat membentuk
elusi gradient. Sebaliknya pompa ini mampu menghasilkan laju aliran yang
sangat tinggi yang diperlukan dalam pemakaian preparatif.

9
2. Pompa pendesakan tetap (constant displacement)

a. Pompa bolak-balik (reciprocating pump)

Keuntungan utama pompa bolak-balik adalah harganya murah. Selain itu

tendon pelarut dapat lebih besar dari pada tendon pelarut yang terdapat pada
pompa tekanan tetap atau pompa semprit pendesakan tunggal. Akan tetapi
pompa bolak balik mempunyai beberapa kekurangan. Pompa ini tampaknya
mudah berongga (atau hilang tenaganya) jika memakai pelarut yang mudah
menguap. Hal ini dapat membatasi kegunaannya dengan pelarut seperti
metilena klorida, etil eter atau pentana. Masalah lain pada pompa bolak-balik
adalah jika pengedap torak aus, partikel bahan pengedap dapat masuk ke katup
pengendali. Selain itu pendenyutan yang disebabkan oleh pompa bolak-balik
terdeteksi sebagai garis alas yang berubah-ubah.

b. Pompa pendesakan tunggal (pompa syringe) Pompa syringe menghasilkan

aliran pelarut yang seragam melalui kolom dan ke detektor, dan ini
menghasilkan noise terendah pada detektor yang peka terhadap aliran. Selain
itu pompa dapat dengan mudah digunakan pada sistem gradien.

Reciprocating pump

10
 Pompa syringe

c. Penyuntikan sampel pada KCKT

Penyuntikan sampel ke dalam kolom terkadang merupakan suatu

masalah karena tekanan tinggi dari KCKT (Munson, 1991). Faktor
ketidaktepatan pengukuran KCKT dapat disebabkan pada keterulangan
pemasukan sampel ke dalam kolom. Pemasukan sampel yang banyak dapat
menyebabkan band broadening (pelebaran pita). Oleh karena itu, sampel yang
dimasukkan harus sekecil mungkin, dan diusahakan tekanan tidak menurun
ketika memasukkan sampel ke dalam fase gerak.

Terdapat tiga tipe dasar injector yang bias digunakan dalam KCKT :

A. Injektor septum

Penyuntikan cuplikan dengan memasukkan cuplikan itu ke dalam syringe

dan menusukkan jarum syringe melalui septum elastomer merupakan cara
penyuntikan pada kolom yang paling sederhana. Injektor septum pada
kromatografi cair merupakan injektor paling murah, tetapi memerlukan
perhatian yang lebih. Septum berkontak dengan pelarut bertekanan tinggi,
karena itu kita harus memilih bahan septum yang tidak termakan oleh pelarut.

B. Penyuntikan aliran henti

11
 Penyuntikan pada bagian atas kolom menghasilkan kromatografi yang
sangat efisien. Injektor aliran henti dirancang untk memungkinkan
penempatan cuplikan langsung pada bagian atas (pangkal) kolom. Volum
penyuntikan harus kecil untuk mencegah agar proses kromatografi tidak
dimulai dengan pita yang lebar.

C. Katup kitar atau pipa dosis (loop valve)

Prinsip kerja katup kitar, dimana pada saat awal sampel akan masuk
memenuhi volume loop terlebih dahulu dan akhirnya segera masuk menuju
kolom pemisahan dengan volume yang tidak berkurang sedikitpun. Pada saat
sampel diinjeksikan maka sampel tidak langsung masuk ke dalam kolom, tapi
akan memenuhi pipa dosis, terlebih dahulu. Pipa dosis ini mempunyai ukuran
volum yang bermacam- macam dari 5 ul – 2000ul. Volum sampel yang
diinjeksikan sebaiknya 5 kali dari volum pipa dosisnya.

Gambar 29. Loop sampel untuk HPLC Autoinjektor

d. Kolom

Kolom KCKT biasanya terbuat dari stainless steel. Kolom utama berisi
fase diam, tempat terjadinya pemisahan campuran menjadi komponen-
komponennya. Terdapat dua jenis kolom yang sering digunakan dalam KCKT
yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.

12
 Gambar 30. Kolom KCKT

Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok yaitu :

1. Kolom analitik

Kolom analitik digunakan untuk penentuan jenis dan jumlah analit yang
diperiksa. Ditinjau dari ukurannya (panjang dan diameternya) kolom KCKT
dibagi menjadi beberapa bagian sebagaimana terlihat pada Tabel 1.

Tabel 1. Macam-macam kolom KCKT

Jenis kolom Panjan Diamete dp

g (cm) r (mm) (um)
Konvensional 10 – 20 4,5 10

Microbore 10 2,4 5
High Speed 6 4,6 3

Kolom mikrobor/High Speed mempunyai 3 keuntungan yang utama

dibanding dengan kolom konvensional, yaitu:

13
1. Jumlah fase gerak yang dibutuhkan pada pemisahan menggunakan kolom
mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom
konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih
kecil (10 -100 μl/menit).

2. Aliran fase gerak yang lebih kecil membuat kolom mikrobor lebih ideal
jika digabung dengan spektrometer massa.

3. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat,

karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas
misal sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan

kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.

Adapun tujuan kolom dibuat dengan diameter internal sangat kecil (kolom
mikro) adalah sebagai berikut:

1. Kepekaan menjadi lebih teliti

2. Mencegah difusi fase gerak

3. Memperluas kemampuan detector

4. Sampel yang dianalisis sedikit

Sedangkan tujuan kolom dibuat pendek (high speed) adalah:

1. Menghasilkan resolusi yang baik

2. Memperkecil harga diameter rata-rata partikel fasa diam

3. Waktu retensi (tR) menjadi singkat

Kolom mikro / high speed dengan dp = 5 dan dp = 3 harus diperhatikan

lebih teliti dibandingkan dengan kolom konvensional dp = 10, sebab sela-sela
partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran. Jadi harus seringkali dicuci dan
kemurnian fase gerak harus dijaga.

14
 2. Kolom Preparatif

Kolom preparative digunakan untuk memisahkan komponen-komponen

analit dalam jumlah besar. Biasanya pada kromatografi preparative kita dapat
mengumpulkan tiap-tiap eluate yang keluar dari kolom. Karena sampel yang
dipisahkan pada kromatografi preparative biasanya dalam jumlah yang
relative lebih besar, maka kolom preparative biasanya juga memiliki diameter
dalam dan panjang relative lebih besar dari kolom analitik. Umumnya kolom
preparative memiliki diameter dalam 6 mm atau lebih dan panjang 25-100 cm

Gambar 31. Perbedaan diameter dan panjang dari kolom analitik dan kolom
preparative

15
 Pompa preparatif

TIPE-TIPE KOLOM BERDASARKAN JENIS-JENIS HPLC :

1. HPLC Fase Normal (Normal Phase HPLC)

Pemisahan komponen sampel pada fase normal dan fase terbalik

dilakukan berdasarkan polaritas. Pada jenis HPLC ini, fase diamnya bersifat
polar dan fase geraknya bersifat non polar. Fase diam yang digunakan
biasanya berisikan silika murni atau gugus senyawa organik seperti amino
atau siano yang terikat pada basis silika. Sedangkan fase geraknya biasanya
merupakan senyawa non polar seperti heksana atau heptana yang sedikit
dicampur dengan senyawa polar seperti metanol, etanol, ataupun isopropanol.

Kolom fase normal berisi silika

2. HPLC Fase Terbalik (Reverse Phase HPLC)

Sesuai namanya, jenis HPLC ini merupakan kebalikan dari HPLC Fase
Normal. Pada jenis ini, fase diam yang digunakan bersifat non-polar dan fase
geraknya bersifat polar. Fase diam yang digunakan pada fase ini biasanya
merupakan hidrokarbon alkil non polar seperti rantai C-8 atau C-18 yang
terikat pada basis silika. Kolom C18 atau Oktadesil Silika (ODS) merupakan
jenis yang paling populer digunakan dalam HPLC. Fase gerak yang kerap

16
digunakan pada fase terbalik adalah campuran air dengan pelarut polar lain
seperti Metanol, Asetonitril, atau Tetrahidrofuran.

Kolom fase terbalik berisi C18 yang terikat pada silika

3. HPLC Eksklusi Ukuran (Size-exclusion HPLC)

Pada jenis HPLC ini, pemisahan dilakukan berdasarkan perbedaan

ukuran molekul masing-masing komponen sampel. Kolom yang digunakan
berisikan packing material yang memiliki ukuran pori yang sudah diatur.
Komponen sampel dengan ukuran molekul yang lebih kecil akan terserap
masuk ke dalam pori packing material sehingga membutuhkan waktu yang
lebih lama untuk melewati kolom dibanding dengan komponen dengan ukuran
molekul yang besar.

Kolom eksklusi ukuran dengan ukuran pori 300Å

4. HPLC Pertukaran Ion (Ion Exchange HPLC)

Jenis HPLC ini digunakan untuk sampel yang bersifat ionik atau dapat
diubah menjadi ionik. Fase diamnya memiliki permukaan bermuatan ionik
yang berlawanan dengan sampel. Semakin kuat muatan komponen sampelnya,
maka komponen tersebut akan tertarik pada permukaan fase diam sehingga
akan membutuhkan waktu yang lebih lama untuk melewatinya.

17
 Kolom pertukaran ion dengan Polyethyleneimine sebagai fase diam

e. Fase diam

Fase diam dalam KCKT berupa silika. Silika dapat dimodifikasi

dengan menggunakan reagen-reagen. Silika yang dimodifikasi mempunyai
karakteristik kromatografi dan selektifitas yang berbeda jika dibandingkan
dengan silika yang tidak dimodifikasi. Oktadesil silika (ODS atau C18)
merupakan fase diam yang sering digunakan karena mampu memisahkan
senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang maupun tinggi.

f. Detektor

Detektor yang digunakan dalam KCKT dapat dikelompokkan menjadi

dua golongan yaitu detektor universal dan detektor spesifik. Detektor
universal mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan
tidak bersifat selektif seperti detektor indeks bias dan detektor
spektrofotometri massa. Detektor spesifik hanya mendeteksi analit secara
spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan
elektrokimia.

Secara umum detektor yang ideal untuk kromatografi cair harus memiliki
semua karakteristik berikut :

18
 a. Memiliki sensitifitas yang memadai. Kisaran umum sensitifitas
berkisar dari 10-8 hingga 10- 15gram zat terlarut per pembacaan

b. Stabil dan memiliki keterulangan yang baik

c. Respon yang linear terhadap kenaikan konsentrasi

d. Waktu respon yang singkat

e. Kemudahan pada penggunaan

f. Memiliki volume internal yang kecil untuk mengurangi pelebaran

puncak

Detektor yang digunakan dalam KCKT dapat dikelompokkan menjadi

dua golongan yaitu detektor universal dan detektor spesifik.

1. Detektor Universal

Dibagi menjadi 2 yaitu :

a. Detektor Indeks Bias

Detektor indeks bias merupakan detector yang bersifat universal yang

mampu memberikan respon (signal) pada setiap zat terlarut. Detektor ini
akan merespon setiap perbedaan indeks bias antara analit (zat terlarut)
dengan pelarutnya (fase gerak). Kelemahan yang utama detector ini adalah
bahwa indeks bias dipengaruhi oleh suhu, oleh karena itu suhu fase gerak,
kolom, dan detector harus dikendalikan secara seksama.

Penggunaan detector ini terutama untuk senyawa-senyawa yang tidak

mempunyai kromofor. Sebagai contoh penggunaannya adalah untuk
deteksi karbohidrat baik dalam bahan tambahan tablet atau dalam bahan
makanan serta untuk deteksi asetilkolin dalam setiap optalmik.

19
 Detektor indeks bias

b. Detektor Spektrometri Massa

Sejumlah fraksi kecil cairan dari kolom dimasukkan ke dalam

spektrometer massa pada kecepatan alir 10 – 50 μl per menit atau
menggunakan termospray. Analat akan diionisasikan, dipisahkan pada
analisator, dibaca oleh detektor dan menghasilkan spektrum massa.

Detektor spektrometri massa

2. Detektor Spesifik

Terbagi menjadi :

a) Detektor Fluoresensi

Banyak senyawa yang mampu mengabsorpsi radiasi UV dan

kemudian mengeluarkan suatu radiasi emisi pada panjang gelombang yang
lebih jauh. Emisi dapat terjadi pada saat itu juga yang disebut peristiwa
“fluoresensi” ataupun pada saat yang tertunda yang disebut sebagai
peristiwa “fosforisensi”.

20
 Senyawa-senyawa yang mempunyai sifat pendar fluor secara alamiah
mempunyai struktur siklis yang terkonjugasi, misalnya hidrokarbon
aromatis polisiklis. Senyawa yang tidak berpendar fluor dapat juga dirubah
menjadi senyawa yang berpendar fluor dengan mereaksikan suatu reagen
tertentu.

Kelebihan detektor fluor dari pada detektor lainnya :

- batas deteksi lebih rendah yaitu 1 pg

- lebih selektif dan sensitif

- lebih baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif

Kelemahan detector ini adalah terkait dengan rentang linieritasnya

yang sempit yakni antara 10–100. Pemilihan fase gerak pada deteksi
dengan fluoresensi ini sangat penting karena karena fluoresensi sangat
sensitive terhadap peredam fluresensi. Pelarut-pelarut yang sangat polar,
buffer- bufer, dan ion-ion halide akan meredam fluoresensi. pH fase gerak
juga juga penting terkait dengan efisiensi fluoresensi. Sebagai contoh kinin
dan kuinidin hanya menunjukkan fluoresensi dalam medium yang sama,
sementara oksibarbiturat akan berfluoresensi dalam medium yang bersifat
basa.

Detektor fluoresensi

b) Detektor UV-Vis

21
 Detektor UV merupakan detector yang paling banyak digunakan
sebagai detektor pada HPLC. Detektor UV memiliki sensitivitas dan
reliabilitas yang baik serta cocok digunakan pada banyak golongan analit,
meskipun faktanya detector UV kurang sensitive terhadap senyawa-
senyawa non polar dan senyawa yang tidak memiliki gugus kromofor.
Pada umumnya analit menyerap sinar UV pada panjang gelombang 200-
350oA, analit ini biasanya memiliki satu atau lebih ikatan rangkap
(elektron π) atau semua analit yang memiliki electron sunyi (olefin,
aromatik dan semua senyawa yang mengandung gugus fungsi –CO, -
CS,N=O dan N=N)

Hubungan antara kosentrasi analit dan besarnya sinar yang

ditransmisikan sel diberikan oleh hukum Beer

𝐼𝑇 = 𝐼0𝑒−𝑘𝐿𝑐

Dimana :

I0 = Intensitas sinar dating

IT = Intensitas sinar yang diteruskan L = panjang sel

c = kosentrasi analit

k = konstanta ekstingsi Molar analit untuk panjang gelombang tertentu

UV

atau

ln 𝐼𝑇 = ln 𝐼0 − 𝑘𝐿𝑐

Sehingga

𝐼𝑇 = 𝐼010−𝑘𝐿𝑐

Dari persamaan diatas terlihat bahwa sensitivitas detector

ditentukan oleh besarnya koefisien ekstingsi molar analit pada panjang

22
gelombang yang digunakan. Sehingga kosentrasi minimum yang masih
bisa dideteksi (LOD) dapat berubah sesuai dengan panjang gelombang
sumber sinar yang digunakan. Sensitivitas detector juga ditentukan oleh
panjang sel yang digunakan. Tetapi penambahan panjang sel tidak bisa
dilakukan untuk meningkatkan sensitivitas, karena sel yang panjang akan
berakibat terjadinya pelebaran puncak yang berlebihan sehingga akan
menurunkan resolusi.

Ada 2 tipe detektor UV-Vis yang dapat digunakan yaitu :

a. Detektor Fixed Wavelength

Detetktor ini terdiri dari sel silinder kecil (dengan volume 2 – 10

uL) yang dilewati oleh aliran eluent dari kolom. Sinar UV melewati sel
dan jatuh pada sensor UV photo elektrik. Panjang gelombang cahaya
tergantung pada jenis lampu yang digunakan. Tersedia beberapa jenis
lampu yang dapat memberikan sinar UV pada panjang gelombang 210 -
280 nm. Sumber sinar yang paling popular adalah lampu uap mercury,
karena lampu uap mercury dapat memancarkan sinar dengan panjang
gelombang dimana banyak analit dapat dianalisis pada panjang gelombang
tersebut. Fixed Wavelength adalah detektor yang relative murah harganya
dimana detector ini beroperasi pada satu panjang gelombang tertentu
dengan intensitas sinar yang sangat tinggi sehingga detector ini memiliki
sensitivitas intrinsic lebih baik dari pada detector Multiply Wavelenght.

23
 Gambar 33. Diagram Detektor UV Fixed Wafelangth

b. Detektor Multy Wafelanght

Pada detektor ini langsung dilakukan penghambatan pada rentang 3

panjang gelombang sekaligus, yaitu panjang gelombang analitik,
konfirmasi dan pembanding sehingga dapat mempercepat proses
deteksinya pada rentang spektrum yang luas dan lebih untuk deteksinya.

Photodiode Array

Walaupun detektor UV absorpsi banyak dipakai, namun karena analit

yang diukur banyak maka cendrung timbul kemungkinan akan adanya
puncak-puncak kromatogram yang tidak terdeteksi dan terjadi pergeseran
puncak-puncak kromatogram.

c) Detektor Elektro Kimia

Banyak senyawa organic dapat dioksidasi atau direduksi secara

elektrokimia pada elektroda yang cocok. Arus yang dihasilkan pada proses
ini dapat diperkuat hingga memberikan respon yang sesuai. Kepekaan
detector elektrokimia pada umumnya tinggi. Detektor elektrokimia yang
paling banyak digunakan adalah detector konduktivitas dan detector
amperometri.

Fase gerak yang digunakan ketika menggunakan detector ini harus

mengandung elektrolit pendukung sehingga fase geraknya harus yang
bersifat polar. Keuntungan detector ini adalah terkait dengan kepekaannya
yang tinggi. Pendeteksian jenis ini telah digunakan, misalnya untuk

24
 neurotransmitter dan metabolit mereka di dalam fluida ekstra seluler dari
jaringan otak hewan.

2.4 Mekanisme Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Dengan bantuan pompa, fase gerak di alirkan melalui kolom ke detektor.
Sample yang dilarutkan dalam solvent, dimasukkan kedalam aliran fase gerak
dengan cara injeksi. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen
campuran berdasarkan perbedaan kekuatan interaksi analat (solut-solut)
dengan stationary phase pada kolom.
Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dnegan fase diam akan keluar
dari kolom terlebih dahulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi
dengan fase diam maka solut-solut tersebut akan keluar dari kolom lebih lama.
Setiap komponen campuran yang keluar dari kolom di deteksi oleh detektor
kemudian di rekam dalam bentuk kromatogram. Kromatoram KCKT serupa
dengan kromatogram GC dimana jumlah peak menyatakan jumlah komponen;
luas area peak menyatakan konsentrasi dalam campuran. Sistem KCKT dapat
dihubungkan dengan software pada komputer dan di operasikan.

Pengolahan Data (Data Handling)

Hasil dari pemisahan kromatografi biasanya ditampilkan dalam bentuk
kromatogram pada rekorder. Suatu tipe Kromatogram dapat dilihat pada
Gambar berikut ini

25
 Dari Gambar waktu retensi dan volume retensi dapat diketahui /dihitung.
Ini bisa digunakan untuk mengidentifikasi secara kualitatif suatu komponen,
bila kondisi kerja dapat dikontrol. Lebar puncak dan tinggi puncak sebanding
atau proporsional dengan konsentrasi dan dapat digunakan untuk memperoleh
hasil secara kuantitatif.
2.5 Kelebihan dan Kekurangan
Banyak analisis yang mengutamakan penggunaan KCKT dalam proses
kerja mereka,hal ini dikarenakan KCKT mempunyai beberapa kelebihan
dibidang metode kromatografi lainnya,diantaranya :
1. Cepat : waktu analisis umumunya kurang dari 1 jam.Banyak analisis yang
dapat diselesaikan sekitar 15-30 menit.Untuk analisis yang tidak rumit
(uncomplicated),waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai. Berbeda
dengan kromatografi lainnya, contohnya pada kromatografi kertas yang
membutuhkan waktu semalaman.
2. Selektif : sifatnya memilih jenis sampel yang digunakan, berbeda dengan
KG(Kromatografi Gas ). Pada KG, gas interaksi dengan zat padat terutama
pada fase diam saja, sedangkan KCKT berinteraksi dengan fase diam dan
fase gerak sehingga parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang
diinginkan.
3. Peka : KCKT sangat sensitif, yaitu dapat memisahkan senyawa yang
memiliki konsentrasi yang sangat kecil. Sehingga memang benar-benar
harus memilih komponen yang akan di pisahkan atau dimurnikan.
4. Kolom dapat dipakai lagi : Berbeda dengan kolom kromatografi
klasik,kolom KCKT dapat digunakan kembali (reusable). Sedangkan pada
kolom kromatografi harus ditukar. Karena pada KCKT tidak terjadi
kerusakan pada alat-alat KCKT salah satunya kolom.
5. Mudah memperoleh kembali sampel : Umumnya setektor yang digunakan
dalam KCKT tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen
sampel yang diperiksa,oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat
dengan mudah disimpulkan setelah melewati detektor. Solvennya dapat
dihilangkan dengan menguapkan kecuali untuk kromatogarafi penukar ion
memerlukan prosedur khusus.

Namun, terdapat pula beberapa kekurangan KCKT yang

membuatnya tidak efisien untuk digunakan,yaitu :
1. Sulit untuk mengidentifikasi senyawa karena sampel yang digunakan
sedikit dan harus memakai spectrometer massa , tidak dapat di deteksi
secara lnngsung.

26
 2. Resolusi yang baik sulit diperoleh, karena sampelnya dipilih selektif.
3. Mahal
4. Sampel yang digunakan jumlahnya sedikit, karena kolom yang dipakai
berukuran sangat kecil.
5. Perlu tenaga ahli untuk mengoperasikan. Yaitu butuh operator untuk
membantu dalam proses kromatografi.

2.6 Aplikasi Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

1. Menganalisis hidroklorotiazid, furosemid, dan spironolakton dalam urin.
Saat ini, obat golongan diuretik sering disalahgunakan oleh atlet olahraga
dalam berbagai event olah raga, terutama pada cabang olahraga dengan
parameter berat badan sebagai acuan perlombaan. Beberapa atlet
menurunkan berat badan secara cepat dengan mengkonsumsi senyawa-
senyawa diuretik dengan tujuan agar dapat masuk ke dalam klasifikasi
berat badan yang diinginkan. Disamping bertujuan menurunkan berat
badan, beberapa atlet olahraga menggunakan senyawa diuretik untuk
menutupi penggunaan doping, dengan mengencerkan sehingga konsentrasi
senyawa doping menjadi sangat rendah dan tidak terdeteksi saat
pemeriksaan urin.
Komisi Medik IOC (International Olympic Commitee) melarang
penggunaan senyawasenyawa diuretik dalam setiap pertandingan
olimpiade. Kemudian WADA (World AntiDoping Agency), yang
diprakarsai oleh IOC, dibentuk dengan tujuan untuk memerangi
penyalahgunaan obat-obatan dalam olahraga, dan membantu federasi-
federasi olahraga untuk melakukan prosedur pengujian, serta menerbitkan
daftar yang berisi zat yang dilarang untuk dikonsumsi seorang atlet.
Diuretik adalah zat-zat yang dapat meningkatkan atau
memperbanyak pengeluaran air kemih (diuresis) melalui kerja langsung
terhadap ginjal. Diuretik pada umunya diklasifiskasikan dalam kelompok
loop diuretik (furosemid), derivat tiazid (hidroklorotiazid), serta diuretik
hemat kalium (spironolakton). Beberapa peneliti telah berhasil
mengembangkan metode analisis yang dapat digunakan untuk pengujian
hidroklorotiazid, furosemid, dan spironolakton dalam urin. Namun
demikian metode tersebut masih memiliki keterbatasan sehingga peluang
pengembangan metode analisis zat ini masih terbuka. Penggunaan suatu
metode standar yang telah tervalidasi akan memberikan data analisis yang
akurat dan presisi dalam waktu yang relatif singkat.
Dilatarbelakangi oleh beberapa hal di atas, penelitian ini bertujuan
untuk mendapatkan suatu metode kromatografi cair kinerja tinggi
(KCKT), yang dapat digunakan untuk menganalisis hidroklorotiazid,
furosemid, dan spironolakton dalam urin secara simultan.

27
2. Kckt untuk farmasi
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan suatu
metoda pemisahan canggih dalam analisis farrnasi yang dapat digunakan
sebagai uji identitas, uji kemumian dan penetapan kadar. Titik beratnya
adalah untuk analisis senyawasenyawa yang tidak mudah menguap dan
tidak stabil pada suhu tinggi, yang tidak bisa dianalisis dengan
Kromatografi Gas. Banyak senyawa yang dapat dianalisis, dengan KCKT
mulai dari senyawa ion anorganik sampai senyawa organik makromolekul.
Untuk analisis dan pemisahan obat /bahan obat campuran rasemis optis
aktif dikembangkan suatu fase pemisahan kiral (chirale Trennphasen) yang
mampu menentukan rasemis dan isomer aktif. Pada Farmakope Indonesia
Edisi III Tahun 1979 KCKT belum digunakan sebagai suatu metoda
analisis baik kualitatif maupun kuantitatif. Padahal di Farmakope negara-
negara maju sudah lama digunakan, seperti Farmakope Amerika Edisi 21
(United State of Pharmacopoeia XXI), Farmakope Jerrnan Edisi 10
(Deutches Arzneibuch 10). Pada Farmakope Indonesia Edisi IV Tahun
1995 sudah digunakan KCKT dalam analisis kualitatif maupun kuantitatif
dan uji kemumian sejumlah 277 (dua ratus tujuh puluh tujuh) obat/bahan
obat. Perubahan yang sangat spektakuler dari Farmakope Indonesia Edisi
IV Tahun 1995 ini menunjukkan bahwa Pemerintah Indonesia melalui
Departemen Kesehatan Republik Indonesia dan Direktorat Jenderal
Pengawasan Obat dan Makanan benar-benar telah mengikuti
perkembangan dan kemajuan ilmu pengetahuan dan teknologi canggih
dalam bidang analisis obat. Walaupun disadari biaya yang dibutuhkan
untuk analisis dengan KCKT sangat mahal, namun metoda ini tetap dipilih
untuk digunakan menganalisis 277 jenis obat / bahan obat karena hasil
analisis yang memiliki akurasi dan presisi yang tinggi, waktu analisis
cepat. Pada Tabel 4.1 dapat dilihat Daftar Obat-obat yang Penetapan
Kadamya dengan KCKT yang tercantum dalam Farmakope Indonesia
Edisi IV Tahun 1995.
1. Tablet Asetazolamida
2. Asetilsistein
3. Larutan Asetilsistein
4. Sisplatin
5. Sisplatin untuk Injeksi
6. Tablet Klemastin Fumarat
7. Kelindamisin Hidroklorida
8. Kapsul Klindamisin Hidroklorida

28
 Dari contoh di atas dapat diketahui bahwa : 1. Penetapan Kadar
obat / Bahan ohat baik dalam bentuk murni maupun dalam bentuk
sediaannya ditetapkan dengan KCKT 2. Penetapan kadar Obat / Bahan
Obat dalam bentuk murni dilakukan dengan metoda lain seperti Titrasi
Bebas Air, Nitrimetri, lodo-i/metri dan lain-lain, I sedangkan Penetapan
Kadar sediaannya menggunakan KCKT. 3. Khusus untuk beberapa
Antibiotik dalam bentuk murninya dilakukan Penetapan Potensinya,
namun dalam bentuk sediaannya dilakukan Penetapan kadar dengan
KCKT. Namun ada juga Antibiotik baik bentuk murninya dan sediaannya
ditetapkan kadarnya dengan KCKT 4. Beberapa senyawa Sulfonamida
dalam bentuk murninya ditetapkan kadarnya dengan nitrimetri tetapi
dalam bentuk sediaannya dengan KCKT.

29
 BAB III
PENUTUP

3.1 Kesimpulan
Kesimpulan dari Kromatografi Cair Tingkat Tinggi ialah :
1) Jenis-jenis KCKT antara lain kromatografi padatan cair, kromatografi
partisi, kromatografi penukar ion (IEC), kromatografi eksklusi,
kromatografi pasangan ion (IPC) 3.
2) Instrumentasi pada KCKT terdiri atas : pompa, injector, kolom, detector,
system penyuntik, tendon pelarut. 4.
3) Prinsip kerja KCKT adalah pemisahan analit-analit berdasarkan
kepolarannya. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya,
dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan
berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya
terpisah. 5.
4) KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi
cair klasik, antara lain: Cepat, Resolusi, Sensitivitas detector, Kolom yang
dapat digunakan kembali, Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik,
Mudah rekoveri sampel.

3.2 Saran
Saran yang dapat kami ajukan melalui makalah singkat kami ini ialah agar
proses pembelajaran berjalan lancar, sebaiknya para mahasiswa menggunakan
KCKT ketika praktikum di laboratorium, tidak hanya sebatas pengetahuan materi
saja namun juga penerapan KCKT sehingga lebih dipahami lagi.

30
 DAFTAR PUSTAKA

Gandjar dan Rohman, 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar,

Yogyakarta.

Meri Susanti dan Dachriyanus, 2017, Kromatografi Cair Kinerja Tinggi, LPTIK,
Padang.

Putra L.,2004, Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi, Jurnal
Perpustakaan Digital, USU.

Sastrohamidjojo Harjono, 2005, Kromatografi. Universitas Gadjah Mada,

Yogyakarta.

Sri Wahyuni, 2014, Validasi Metode Penetapan Kadar Aliskiren dalam Plasma
Darah Secara In Vitro Menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
(KCKT), Skripsi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Jakarta.

Sumar Hendayana, 2006, Kimia Pemisahan (Metode Kromatografi dan

Elektroforesis Modern), Rosda, Bandung.

31