Deteksi Lipid

Deteksi lipid dibagi menjadi 2 cara analisis, yakni analisis kualitatif dan analisis kuantitatif.
Analisis kualitatif terbagi atas metode Bligh/Dyer, metode deteksi dengan HPLC, uji kelarutan,
uji Salkowsi, dan uji reaksi. Analisis kuantitatif terbagi menjadi uji angka asam, uji angka sabun,
uji angka Reichert-Meissl, uji angka Polenski, uji angka Iod, uji Liebermand-Burchard dan
metode analisis dengan menggunakan ESI-MS.
A. Analisis Kualitatif
a. Metode Bligh Dyer
Bligh/Dyer adalah metode ekstraksi dan purifikasi lipid yang didapatkan melalui
studi dekomposisi lipid dari ikan yang telah dibekukan. Prosedur ini dapat
dilakukan hanya dalam waktu singkat, sehingga sangat efisien, mudah untuk
direproduksi, dan bebas dari manipulasi.
Prinsip kerja metode ini adalah dengan menghomogenisasi jaringan basah dengan
menggunakan campuran kloroform dan metanol, sehingga terbentuk sistem
campuran yang homogen dengan air dalam jaringan. Pengenceran dengan
kloroform dan air akan menyeparasikan jaringan yang telah terhomogenisasi
tersebut menjadi dua lapisan, dimana lapisan kloroform akan mengandung semua
lipid/lemak non polar, sementara lapisan metanol akan mengandung semua
senyawa non-lemak atau senyawa lipid polar.
b. Metode deteksi dengan HPLC
Pada dasarnya HPLC adalah versi improvisasi dari Column Chromatography,
dimana ketinggian kolom dikurangi, sehingga jumlah piringannya bertambah
menjadi 100.000 piringan per meter (normal : 40.000 hingga 60.000 piringan per
meter) dan ditambahkan tekanan pada proses penghantaran fase bergerak (mobile
phase) melewati fase stasioner (stationary phase) yang rapat dengan kecepatan
yang sesuai (tidak terlalu cepat dan tidak terlalu lambat, biasanya antara 0,5
hingga 4 mL/menit). Karena ketinggian kolom pada HPLC diperkecil, maka
ukuran partikel yang terdapat pada kolom juga lebih kecil (3 - 5 m). Ukuran
partikel yang kecil ini memberikan luas kontak yang lebih besar, sehingga proses
separasi yang terjadi lebih efisien daripada kromatografi kolom biasa. Selain itu,
keuntungan lain dari penggunaan HPLC adalah menghemat penggunaan pelarut

pada

kolom.

Bagian-bagian dari HPLC :

1. Pompa
Pompa yang digunakan adalah pompa piston 2 arah, pompa screw-driven
syringe atau pompa pneumatic constant-pressure. Pompa-pompa tersebut
haruslah mampu memompa dengan tekanan hingga 6000 psi.
2. Sample Injection System
Kebanyakan sample injection system sudah dibuat otomatis, dengan sistem
Loop. Sistem ini memungkinkan injeksi berkala sample dengan volume
tertentu yang diinginkan
3. Kolom
Dibedakan menjadi :
a. Normal Phase Column
Adalah kolom dengan fase stasioner berupa senyawa polar,
menggunakan fase stasioner berupa silika. Cocok digunakan untuk
mendeteksi kandungan senyawa non polar. Contoh senyawa yang
umunya dideteksi oleh dengan menggunakan kolom ini adalah
heksana, sikloheksana, karbon tetraklorida, kloroform, benzena dan
toluena.
b. Reverse Phase Column
Kebalikan dari Normal Phase Column, fase stasioner yang digunakan
pada kolom adalah senyawa non-polar, menggunakan fase stasioner
berupa senyawa rantai karbon yang non-polar. Cocok digunakan untuk
mendeteksi kandungan senyawa polar. Contoh senyawa yang

umumnya dideteksi dengan menggunakan kolom ini adalah air,

methanol, asetonitril (CH3CN) dan larutan buffer asam asetat.
c. Adsorption Column
Isi kolomnya menggunakan silika atau alumunium oksida. Seperti
namanya, kolom jenis ini memanfaatkan prinsip adsorpsi dalam
memisahkan komponen-komponen dalam senyawa
d. Ion Exchange dan Size Exclusion Column
Ion Exchange Column menggunakan solid resin particles yang
memiliki muatan positif atau negatif pada bagian permukaannya,
dimana ion-ionnya bertukar dengan ion-ion pada fase bergerak. Cation
Exchange Resin (SCX) memiliki sisi negatif sebagai merupakan
tempat pertukaran kation, sementara Anion Exchange Resin memiliki
sisi positif sebagai merupakan tempat pertukaran anion.
Berikut adalah penentuan penggunaan kolom berdasarkan sifat komponen
yang akan dianalisis :

4. Detektor
Ada beberapa jenis detektor yang digunakan, antara lain :
a. UV Absorption
Memanfaatkan prinsip absorpsi cahaya komponen. Absorbansi
komponen

kemudian

dideteksi

oleh

kromatogram.

Walaupun

sensitivitasnya tinggi, detektor UV Absorption jarang digunakan

karena kekurangannya yakni, komponen yang dideteksi harus mampu

menyerap cahaya (komponen harus memiliki warna)
b. Diode Array (UV-Vis)
Memanfaatkan cahaya yang didispersikan dengan grating, yang
kemudian dideteksi oleh photodiodides. Sensitivitas dari detektor ini
cukup tinggi, dan hasil deteksinya cukup akurat
c. Fluorescence
Detektor jenis ini mendeteksi intensitas fluorescence suatu komponen
yang berelusi dari kolom
d. Refractive Index
Memanfaatkan prinsip refraksi cahaya oleh fluida. Alat detektor
refraksinya dinamakan refractometer. Detektor ini banyak digunakan,
walaupun kurang sensitif dan hasil deteksinya kurang akurat
e. Elektrokimia
Dibagi lagi menjadi:
i. Detektor Konduktifitas (banyak digunakan untuk senyawasenyawa ionic)
ii. Detektor Amperometrik (memanfaatkan prinsip oksidasireduksi elektrokimia)
f. LC-MS dan LC-IR
LC (Liquid Chromatography) yang dipadukan dengan MS (Mass
Spectrometry) dan IR (Infra Red) mampu memberikan hasil deteksi
yang lebih akurat dengan data fingerprint, berbeda dengan detektordetektor HPLC lainnya. Kombinasi dengan MS mampu memberikan
data berupa berat molekul dari senyawa yang dideteksi. Prinsip
pendeteksiannya secara sederhana : komponen yang telah mengion
dipisahkan oleh mass analyzer kemudian di deteksi oleh ion detector
c. Uji Salowski
Uji Salkowski merupakan uji kualitatif yang dilakukan untuk mengidentifikasi
keberadaan kolesterol. Jika sterol dengan konfigurasi tidak jenuh di dalam
molekulnya direaksikan dengan asam kuat (biasanya asam sulfat pekat) dalam
kondisi bebas air, maka akan memberikan warna yang khas. Reaksi positif yang
menandakan adanya kolesterol untuk uji Salkowski yaitu timbul warna merah

dibagian kloroform sedangkan dibagian asam berwarna kuning. Kolesterol

dilarutkan dengan kloroform anhidrat lalu dengan volume yang sama
ditambahkan asam sulfat. Penambahan asam sulfat pekat berfungsi sebagai
pemutus

ikatan

ester

lipid.

d. Uji Kelarutan
Uji ini terdiri atas analisis kelarutan lipid maupun derivat lipid terhadap berbagai
macam pelarut. Dalam uji ini kelarutan lipid ditentukan oleh sifat kepolaran
pelarut. Sesuai dengan sifat laruttan, apabila larutan non-polar dilarutkan ke
dalam larutan polar, maka kedua larutan tidak akan menyatu, apabila lipid
dilarutkan ke dalam pelarut polar maka hasilnya tidak akan larut. Hal tersebut
karena lipid memiliki sifat nonpolar sehingga hanya akan larut pada pelarut yang
sama-sama nonpolar.
Uji kelarutan lipid hampir semua jenis lipid, yaitu lemak dan minyak tidak larut
dalam pelarut polar seperti air, namun larut dalam pelarut non polar seperti
kloroform, eter, dan benzene.
e. Uji Reaksi
Uji reaksi pada prinsipnya menguji ada tidaknya kandungan minyak dengan
reaksi-reaksi kimia, kemudian mengamati produk hasil reaksi yang terbentuk. Uji
reaksi terdiri dari uji reaksi dengan oksidasi, ozonisasi dan hidrolisis.
i. Oksidasi

Oksidasi asam lemak merupakan penambahan bilangan oksidasi. Lemaklemak di dalam tubuh akan dipecah menjadi asam lemak yang selanjutnya
akan didegradasi melalui oksidasi dan oksidasi . Oksidasi akan
mendegradasi asam lemak menjadi molekul dengan 1 atom C, sedangkan
oksidasi mendegradasi asam lemak menjadi molekul dengan 2 atom C.
ii. Ozonisasi

Ozonisasi merupakan reaksi ozon dan lipid tak jenuh menghasilkan lipid
peroksida. Dimana lipid terdegradasi oleh ozon
iii. Hidrolisis
Hidrolisis merupakan reaksi pemecahan oleh air, lipid di pecah menjadi
gliserol dan alcohol, dengan menggunakan panas, asam, alkali/ enzim.
O
CH2 O C R1

O
R2

C O C H

Lipase or Acid

O
CH2 O C R3

Triacylglycerol

3 H2O

H2C
HO C
H2C

OH
H

O
R1 C OH
O

+ R C OH
2

OH

R3

O
C OH

Glycerol Free fatty acids

B. Analisis Kuantitatif
a. Uji Angka Asam
Angka asam adalah jumlah mg KOH yang diperlukan untuk menetralkan asam
lemak bebas yang terdapat dalam 1 g lemak/ minyak. Uji ini dilakukan dengan
cara mentitrasi suatu larutan yang akan diuji dengan menggunakan KOH. Angka
asam dapat dihitung dengan rumus :

AV =
N = Normality of KOH

ml of KOH x N x 56
Weight of Sample

= mg of KOH

Dan persentase asam lemak bebas dapat dihitung dengan rumus :

% Free Fatty Acid (FFA) = AV x 0.503
b. Uji Angka Sabun
Angka Sabun adalah banyaknya mg KOH yang diperlukan untuk menetralkan
asam bebas dan untuk mensapoifikasi ester dalam 1 g lemak/minyak. Uji ini
dilakukan dengan menghidrolisis asam lemak meggunakan KOH. Mekanisme
reaksi yang terjadi adalah :

H2 C

HC

H2 C

O
C
O
C
O
C

R
R

3 KOH

H2 C

OH

HC

OH

H2 C

OH

+ 3R

O
C OK

Angka sabun dapat dihitung dengan rumus :

56.1 ( BS ) x N HCl
SP =
Gram of Sample
Dengan :
B : mL of HCl required by Blank
S : mL of HCl required by Sample
Jenis lemak yang berbeda akan memberikan angka sabun yang berbeda. Berikut
beberapa jenis lemak dan angka sabunnya
Fat or oil

Saponification Value

Milk fat

210-233

Coconut oil

250-264

Cotton seed oil

189-198

Soybean oil

189-195

lard

190-202

Butter fat and vegetable fats

220 250

c. Uji Angka Reichert-Meissl

Angka Reichert Meissl adalah nilai dalam millimeter dari 0.1 N alkali yang
dibutuhkan untuk menetralisasi larutan 5 gr asam lemak yang volatil dari minyak
atau lemak.
Digunakan untuk mengetahui komposisi lemak dan untuk mendeteksi pemalsuan
lemak dengan rantai karbon lebih dari 10. Metode ini memanfaatkan keberadaan
gliserida yang volatile dari asam terlarut dengan jumlah karbon sedikit dalam
lemak butter. Metode ini kemudian dipadukan dengan teknik sapoifikasi dengan
larutan NaOH.
Metode ini dapat digunakan untuk mendeteksi pemalsuan butter. Butter biasanya
mengandung asam volatile dengan 4 hingga 14 atom karbon, sedangkan coconut

oil mengandung asam dengan 6 hingga 14 atom karbon.

d. Uji Angka Polenski
Bilangan ini menentukan kadar asam lemak yang volatil, tetapi tidak larut dalam
air, yaitu asam lemak C8 hingga C14. Bilangan polenski adalah jumlah milliliter
(ml) 0,1 N larutan alkali yang dibutuhkan untuk menetralkan asam lemak C8C14 yang terdapat dalam 5 gram sampel. BP juga dapat digunakan untuk menguji
pemalsuan terhadap mentega. Metode ini merupakan pengembangan dari metode
Reichert-Meissl, dimana metode ini dapat mendeteksi asam volatil yang dapat
larut dan yang tidak dapat larut dalam air.
e. Uji Angka Iod
Angka Iod mengukur derajat ketidakjenuhan dari asam lemak penyusun minyak
dan lemak. Asam lemak tidak jenuh mampu mengikat Iod dan membentuk
senyawaan yang jenuh. Banyaknya Iod yang diikat menunjukkan banyaknya
ikatan rangkap. Angka Iod dinyatakan sebagai banyaknya gram Iod yang diikat
oleh 100 gram minyak atau lemak.
Semakin banyak angka iod yang terukur, maka semakin banyak pula kandungan
asam lemak tak jenuh dalam minyak yang mengindikasikan bahwa semakin baik
kualitas minyak tersebut. Drying oil ang banyak digunakan dalam produk cat
memiliki angka iod yang tinggi (sekitar 190), Semidrying oil seperti minya
kacang kedelai memiliki angka iod yang sedang (sekitar 130), sedangkan
Nondrying oil seperti olive oil memiliki angka iod yang rendah (sekitar 80)
Prinsip analisis bilangan iod adalah gliserida tak jenuh minyak mempunyai
kemampuan mengadsorpsi sejumlah iod, khususnya apabila dibantu dengan iodinklorida atau iodin bromida membentuk senyawa yang jenuh. Jumlah iod yang
teradsorpsi menunjukkan ketidakjenuhan minyak. Minyak dilarutkan dalam
khloroform

kemudian

ditambahkan

larutan

iodin

bromide

(atau

iodin

monochloride). Akan terjadi pengikatan iodin oleh minyak pada ikatan

rangkapnya. Iodin sisa dititrasi dengan Natrium tiosulfat 0,1 N menggunakan
indikator amilum, akhir titrasi ditandai dengan hilangnya warna biru. Titrasi
sampel misal x ml. Untuk mengetahui iodin mula-mula dalam reagen maka

dilakukan perlakuan blanko dengan jalan yang sama yaitu titrasi blanko misal y
ml.
f. Uji Angka Liebermand-Burchard
Uji Lieberman Buchard selain dapat digunakan sebagai uji kualitatif juga dapat
digunakan sebagai uji kuantitatif untuk kolesterol. Prinsip uji ini adalah
mengidentifikasi adanya kolesterol dengan penambahan asam sulfat pekat ke
dalam campuran kolesterol dalam kloroform dan sedikit asam asetat pekat.
Mekanisme yang terjadi dalam uji ini adalah ketika asam sulfat ditambahkan ke
dalam campuran yang berisi kolesterol, maka molekul air berpindah dari gugus
C3 kolesterol, kolesterol kemudian teroksidasi membentuk 3,5-kolestadiena.
Produk ini dikonversi menjadi polimer yang mengandung kromofor yang
menghasilkan warna hijau. Warna hijau ini menandakan hasil yang positif. Reaksi
positif uji ini ditandai dengan adanya perubahan warna dari terbentuknya warna
pink kemudian menjadi biru-ungu dan akhirnya menjadi hijau tua. Reaksi yang
terjadi pada uji Lieberman Buchard dapat dilihat pada gambar dibawah

Berdasarkan percobaan yang dilakukan bahan uji positif kolesterol dengan

perubahan warna pada larutan menjadi hijau sesuai dengan literatur. Warna hijau
yang terjadi sebanding dengan konsentrasi kolesterol. Percobaan dilakukan
dengan menggunakan asam asetat pekat sedangkan secara teoritis pereaksi
Lieberman Burchard merupakan campuran antara asam asetat anhidrat dan asam
sulfat pekat. Asam asetat anhidrat berfungsi untuk membentuk turunan asetil dari
steroid yang akan membentuk turunan asetil di dalam kloroform. Alasan
penggunaan kloroform anhidrat sebagai pelarut karena kolesterol paling larut baik
dalam pelarut ini dan yang paling mendasar adalah tidak mengandung molekul
air. Jika dalam larutan uji terdapat molekul air maka asam asetat anhidrat akan
berubah menjadi asam asetat sebelum reaksi berjalan dan turunan asetil tidak akan

terbentuk. Sehingga dengan digantinya asam asetat anhidrat dengan asam asetat
pekat tidak akan memengaruhi hasil yang diinginkan selama larutan uji tersebut
tidak mengandung air.
g. Uji dengan ESI-MS
ESI adalah metode ionisasi umum dalam MS untuk analisis lipid dari cairan
tubuh, sel, bakteria, virus, dan jaringan. ESI-MS bergantung pada pembentukan
ion gas dari molekul polar, labil secara termal dan non-volatil sehingga cocok
untuk mendeteksi berbagai jenis lipid dengan akurat. ESI-MS memiliki sifat
ionisasi halus yang tidak mengganggu sifat kimia dari analit sebelum
dilakukannya MS. Berbagai macam metode ESI-MS telah dikembangkan untuk
analisis berbagai kelas dan subkelas lipid dari ekstrak biologis.
Keuntungan besar dari penggunaan ESI-MS adalah keakuratannya yang tinggi,
sensitif, dapat direproduksi, dan aplikatif untuk larutan kompleks tanpa perlu
derivatisasi.
Dalam penerapannya, ESI-MS biasanya digabungkan dengan LC. Tujuannya,
untuk melakukan pemisahan senyawa yang polar dan non-polar terlebih dahulu
sebelum masuk ke ESI-MS. Penggunaan LC meminimalisir efek supresi ion.
Selain itu, waktu retensi dalam kolom LC dapat juga digunakan sebagai parameter
lain untuk identifikasi senyawa (selain dari sinyal MS).
Prosedur ESI-MS dalam deteksi lipid secara singkat

i.

Sampel
diekstrak
terlebih

dahulu (dengan menggunakan berbagai metode ekstraksi yang ada,

misalkan Bligh-Dyer)
ii. Ekstrak diinjeksi ke dalam kolom LC (HPLC, dll)
iii. Sampel akan bergerak ke dalam perangkat ESI untuk disemprotkan
elektron, kemudian elektron akan diterima oleh detector untuk dibaca
iv. Sampel kemudian akan bergerak ke spectrometer massa untuk kemudian
dilihat hasil spektrumnya.

Referensi :

Pratt Pandjiwidjaja. 1992. Teknologi Minyak dan Lemak I. Bogor: IPB Press.

Wirahadikusumah M. 1985. Biokomia: Metabolisme Energi, Karbohidrat, dan Lipid.

Bandung: ITB Press.

Hawab HM. 2004. Pengantar Biokimia. Malang: Bayumedia.

Poedjiadi Anna. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: UI Press.

Bligh, E.G., dan W.J. Dyer. 1959. A Rapid Method of Total Lipid Extraction and
Purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology Vol. 37, No. 8: 911-917.

Dewi, Mega Twilana Indah, dan Nurul Hidajati. 2012. Peningkatan Mutu Minyak Goreng
Curah Menggunakan Adsorben Bentonit Teraktivasi. UNESA Journal of Chemistry Vol. 1,
No. 2: 47-53.

Sastrohamidjojo, Hardjono. 2009. Kimia Organik. Yogyakarta: Gadjah Mada University

Press.

vlab.amrita.edu,. (2011). Estimation of Saponification Value of Fats/Oils.. Retrieved 27

February 2016, from vlab.amrita.edu/?sub=3&brch=63&sim=688&cnt=2

Kenkel, John. 2003. Analytical Chemistry for Technicians 3rd Ed. CRC Press LLC. USA

Skoog, Douglas A. , et.al. 2004. Analytical Chemistry 8th Ed. Thomson Inc. Canada

Clark, Jim. 2007. High Performance Liquid Chromatography HPLC. [ONLINE]

Available at http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/hplc.html. Accessed
on 18 February 2016.

Li, Lin, et al. Mass Spectrometry Methodology in Lipid Analysis. International Journal of
Molecular Sciences, 2014, 15, 10492-10507

Anonym. No Date. Iodine value. [ONLINE].

http://www.britannica.com/science/iodine-value. Accessed on 6 March 2016