LAPORAN PRAKTIKUM METODE FISIKOKIMIA

“PENENTUAN KADAR PARACETAMOL DENGAN METODE HIGH

PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)”

Dosen Pembimbing : Sri Wardatun, M.Farm., Apt.

Zaldy Rusli, M.Farm

Penyusun : Fauzan Irsalina Shani 066118221

LABORATORIUM FARMASI

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS PAKUAN

BOGOR

2020
 2

DAFTAR ISI

Daftar Isi...................................................................................................................2

Daftar Tabel .............................................................................................................3

Daftar Gambar ..........................................................................................................4

Daftar Lampiran .......................................................................................................5

BAB I PENDAHULUAN ........................................................................................6

1.1 Latar Belakang................................................................................................6
1.2 Tujuan Penelitian ............................................................................................6

BAB II Tinjauan Pustaka .........................................................................................7

BAB III Metode Kerja ...........................................................................................11

3.1 Alat dan Bahan .............................................................................................11
1 Alat ..............................................................................................................11
2 Bahan ...........................................................................................................11
3.2 Prosedur Kerja ..............................................................................................11
1 Tahapan Preparasi Fase Gerak.....................................................................11
2 Pembuatan Larutan Uji Standar ...................................................................12
3. Pembuatan Larutan Sampel Sirup Paracetamol ..........................................12

BAB IV Hasil dan Pembahasan .............................................................................13

1.1 Pembahasan ..................................................................................................13
1.2 Preparasi Standar ..........................................................................................14
1.3 Sampel ..........................................................................................................15
1.4 Kadar ............................................................................................................15

BAB V Kesimpulan ...............................................................................................16

Daftar Pustaka ........................................................................................................17

Lampiran ................................................................................................................18
1. Perhitungan .....................................................................................................18
2. Data Percobaan ...............................................................................................21
3. Gambar ...........................................................................................................33
 3

DAFTAR TABEL

4.2 Preparasi Standar .............................................................................................14

4.3 Sampel .............................................................................................................15

4.4 Kadar ...............................................................................................................15

 4

DAFTAR GAMBAR

2. Data Percobaan ..................................................................................................21

3. Gambar ..............................................................................................................33
 5

DAFTAR LAMPIRAN

1. Perhitungan .......................................................................................................18

2. Data Percobaan ..................................................................................................21

3. Gambar ..............................................................................................................33
 6

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Analisis kualitatif bertujuan untuk mengetahui keberadaan suatu unsur atau
senyawa kimia, baik organik maupun inorganik, sedangkan analisis kuantitatif
bertujuan untuk mengetahui jumlah suatu unsur atau senyawa dalam suatu
sampel.
Kromatografi atau High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) adalah suatu teknik pemisahan
molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase
diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan.
Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan
fase diam. Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan
cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah.
Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan
pergerakan pada kolom.
Kromatografi digunakan untuk memisahkan campuran dari substansinya
menjadi komponen-komponennya.. Seluruh bentuk kromatografi memiliki fase
diam (berupa padatan atau cairan yang didukung pada padatan) dan fase gerak
(cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa
komponen-komponen dari campuran bersama-sama. Komponen-komponen
HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk
analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah
bidang, antara lain: farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer, dan industri-
industry makanan.
1.2 Tujuan Penelitian
1. Mampu memahami prinsip kerja HPLC.
2. Mengetahui cara penggunaan alat HPLC
3. Mampu mengetahui kadar Paracetamol dengan menggunakan metode
HPLC.
 7

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

KCKT adalah instrument untuk pemisahan sejumlah senyawa organik,

anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidak murnian (impurities) dan
analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap (nonvolatil). KCKT paling
sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-
asam amino,asam-asam nukleat dan protein-protein dalam cairan fisiologis,
menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat dan lain-lain (Cresswell, 2005)

Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika

KCKT dihubungkan dengan spektrometer massa (MS). Keterbatasan lainnya
adalah jika sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh.
Berikut skema kerja alat yang digunakan dalam HPLC (Supardani 2011)

Larutan sampel yang akan dianalisis diinjeksi kemudian sampel akan turun ke
dalam kolom dan di elusi oleh eluen yang disediakan. Lalu detector akan
mendeteksi waktu retensi dalam bentuk kromatogram. Dari kromatogram itu kita
dapat meganalisis sampel (Ibnu Ghalib, 2012)

HPLC memiliki kekuatan pemisahan yang sangat ampuh bahkan untuk

komponen-komponen yang berhubungan sangat erat; pemisahan penukar ion yang
sukses dari logam tanah yang langka dan asam-asam amino telah memperlihatkan
ini. Komposisi fase gerak dalam HPLC memberikan suatu dimensi untuk
memanipulasi eksperimen yang tidak dijumpai dalam kromatografi gas. Dalam
kromatografi gas faktor pemisahan untuk sepasang komponen sampel tergantung
pada sifat dasar stationer, sedangkan dalam HPLC faktor itu juga bergantung pada
fase gerak. Seringkali pelarut campuran merupakan fase gerak yang lebih baik
daripada cairan murni untuk memisahkan campuran yang rumit dan
pengoptimasian komposisi pelarut dengan cara coba-coba dapat menjadi lebih
rumit (Khopkar, 1990)

Pemilihan detektor pada HPLC umumnya didasarkan pada persyaratan

sensitivitas, jenis senyawa yang ada di dalam sampel dan faktor lainnya seperti
 8

biaya. Detector yang paling umum didasarkan pada indeks bias dan eluat kolom,
karena hampir semua zat terlarut akan menghasilkan larutan dengan indeks bias
yang berbeda dengan indeks bias pelarut murni (Day, 2002)

Pada dasarnya instrumen HPLC terdiri dari tandon (reservoir) cairan fase gerak,
pompa, injector, kolom, detektor dan rekorder.

1. Tandon (Reservoir)
Reservoir yang baik disertai degessing system yang berfungsi untuk
mengusir gas-gas terlarut dalam solvent. Degassing dilakukan dengan
mengalirkan gas inert dengan kelarutan yang sangat kecil, misalnya helium.
Degassing dapat juga dibuat sendiri dengan erlermeyer yang dilengkapi
dengan pengaduk magnet, pemanas dan pompa vacum.
2. Pompa
Fungsi pompa adalah untuk memompa fase gerak (solvent) ke dalam
kolom dengan aliran yang konstan dan reproducible. Pompa harus memenuhi
persyaratann seperti dapat memberi tekanan sampai 6000 psi (360 atm),
tekanan yang dihasilkan bebas pulsa, dapat mengalirkan fase gerak dengan
kecepatan 0,1 sampai 10 ml/ menit, dapat mengalirkan fase gerak dengan
reprodusibilitas yang tinggi, tahan terhadap korosi (biasanya terbuat dari baja
atau teflon). Ada beberapa jenis pompa, antara lain:
a. Reciprocating pump
b. Displacement Pump
c. Pneumatic Pump
3. Katup Injector
Bagian ini merupakan tempat dimana sampel diinjeksikan untuk
selanjutnya dibawa oleh fase gerak ke dalam kolom.
4. Kolom (Column)
Kolom merupakan jantung dari HPLC, sebab kunci keberhasilan analisis
sangat tergantung pada efisiensi kolom sebagai alat untuk memisah-misahkan
senyawa dalam campuran yang kompleks. Kolom terbuat dari stainless steel
yang dibor halus atau dari gelas. Ada dua jenis packing kolom yang telah
 9

digunakan dalam kromatografi cair. yaitu berupa partikel porous dan partikel
pelliculer.

5. Detektor
Setelah sampel melewati kolom maka komponen-komponennya akan
terpisah-pisah dan keluar dari kolom dengan waktu yang berbeda-beda.
Komponen yang sudah terpisah ini secara berturut-turut akan melewati suatu
detektor dan akan dibaca kadarnya. Detektor yang digunakan harus sesuai
dengan jenis zat yang dianalisis.
A. Detektor UV
Prinsip kerja detektor ini adalah spektrophotometri abssorbsi.
Sampel yang dianalisis harus menyerap sinar UV. Panjang gelombang
sinar UV yang biasa digunakan adalah 254 nm.
B. Detektor Fluoresensi
Prinsip kerja detektor ini adalah spektrophotometri. Detektor ini
lebih sensitif daripada detektor UV. Pemakaian sumber sinar laser
akan memberikan sensitivitas yang sangat tinggi. Derivatisasi sering
dilakukan terhadap asam amino.
C. Detektor Indeks Refraksi (Refraksi Index Detector = RID)
Detektor ini bekerja atas dasar perbedaan indeks refraksi sampel
dengan solvent. Semua larutan suatu zat mempunyai indeks bias yang
spesifik, oleh karena itu detektor ini dapat digunakan untuk hampir
semua zat.
6. Recorder
Hasil pembacaan detektor kemudian diolah oleh suatu processor kemudian
dikirim ke recorder. Recorder akan membuat suatu tampilan. Dalam
kromatografi tampilan ini disebut chromathogram. Untuk HPLC dilengkapi
seperangkat software yang dapat menghitung luas kromatogram dan bahkan
sekaligus menghitung kadarnya.
HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif
pada obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk
 10

degradasi dalam sediaan farmasi. Keterbatasan metode HPLC ini adalah

untuk identifikasi senyawa, kecuali jika HPLC dihubungkan dengan
spektometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah sampel sangat
kompleks maka resolusi yang baik sulit diperoleh.
Parasetamol adalah senyawa yang memiliki sifat polar dan gugus
kromofor yang dimilikinya menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar
UV. Karakteristik senyawa ini memungkinkan analisis dengan teknik HPLC
menggunakan kolom nonpolar seperti C-18 dan fasa gerak polar seperti
methanol/ air. Parasetamol diabsorbsi cepat dan sempurna melalui saluran
cerna. Konsentrasi tertinggi plasma dicapai dalam waktu ½ jam dan masa
paruh plasma antara 1-3 jam. Obat ini tersebar ke seluruh tubuh. Dalam
plasma, 25% parasetamol terikat protein plasma. Parasetamol digunakan
sebagai analgesik dan antipiretik (Sumar, 1994)
 11

BAB III

METODE KERJA

3.1 Alat dan Bahan

1. Alat 2. Bahan
- Alat degassing - Air
- Aluminium Foil - Aquadest
- Beker glass - Asetaminofen
- Bulp - Parasetamol
- Corong - Metanol
- Erlenmeyer
- Kaca arloji
- Labu ukur
- Mikropipet
- Pipet gondok
- Pipet kaca
- Timbangan analitik
- Syringe filtrer

3.2 Prosedur Kerja

1. Tahapan preparasi fase gerak air:metanol (3:1) sebanyak 600 mL Air
sebanyak 450 ml
- Dicuci semua alat
- Metanol sebanyak 150 ml
- Dihomogenisasi fase gerak menggunakan sonicator
- Disaring fase gerak menggunakan penyaring vakum
- Dibilas penampung hasil penyaringan fase gerak
- Dibilas penampung eluen
 12

2. Pembuatan larutan uji standar

- Ditimbang asetaminofen std sebanyak 52 mg
- Dilarutkan menggunakan fase gerak dlm labu 50 ml, karena masih ada
partikel yg besar maka dibantu dgn sonikator
- Di add dengan fase gerak dan dipipet 500 mikro ke dlm 50 ml
- Di add dengan fase gerak
- Disaring menggunakan syringe filter 0.45 mikro
- 10 mL awal dibuang lalu Sisanya disaring
- Degassing larutan sample

3. Pembuatan larutan sampel sirup PCT

- Etiket: tiap 5 mL mengandung 120 mg parasetamol
- Dipipet 2 mL sampel sirup PCT ke dalam labu 50 ml. lalu di add
menggunakan fase gerak. Kemudian dihomogenkan
- Dipipet 500 mikro ke labu 50 mL. lalu diadd menggunakan fase gerak
kemudian homogenkan
- Disaring menggunakan syringe filter 0.45 mikro
- 10 mL awal dibuang dan sisanya disaring
- Degassing larutan sample
 13

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4. 1 Pembahasan

Pada percobaan kali ini dilakukan analisis kualitatif dan kuantitatif

terhadap tablet parasetamol dengan menggunakan Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi. Analisis ini bertujuan untuk mengetahui mutu sediaan dari tablet
parasetamol. Prinsip kerja dari KCKT adalah pemisahan suatu senyawa
berdasarkan sifat kepolarannya.

Sistem kromatografi yang digunakan pada percobaan ini yaitu fase balik,
dimana fase diam yang digunakan bersifat non polar sedangkan fase geraknya
bersifat polar. Fase diam yang digunakan adalah ODS atau Okta Desil Silica.
ODS merupakan kolom berisi silika yang bersifat polar yang kemudian
ditambahkan 18 atom C sehingga ODS bersifat non polar. ODS banyak
digunakan karena mampu memisahkan senyawa dari tingkat kepolaran
terendah hingga tertinggi. ODS digunakan karena parasetamol bersifat polar
sehingga senyawa parasetamol tidak akan tertahan pada fase diam tetapi ikut
keluar bersama fase gerak yaitu methanol : air.

Pengujian tablet parasetamol diawali dengan penginjeksian sampel uji

yang telah disaring dengan membran filter PTFE, penyaringan ini dilakukan
agar tidak terjadi penyumbatan didalam kolom. Dengan bantuan pompa
bertekanan tinggi, sampel masuk ke dalam kolom. Di dalam kolom, komponen-
komponen sampel dipisahkan berdasarkan kepolarannya. Parasetamol yang
bersifat polar akan keluar lebih dulu bersama fase gerak dan eksipien lain yang
bersifat non polar akan tertahan di dalam kolom.

Pada pengujian ini detektor yang digunakan adalah detektor UV 243 nm

karena parasetamol memiliki gugus kromofor yang dapat terbaca oleh detektor
UV. Panjang gelombang yang digunakan 243 nm karena merupakan panjang
gelombang maksimal dari parasetamol, dimana pada panjang gelombang
 14

maksimal, kepekaannya juga maksimal dan memenuhi hukum Lambert-Beer,

selain itu jika dilakukan pengulangan maka kesalahannya akan kecil.

Dari hasil pengamatan, setelah dilakukan analisis standar dan sampel pada
HPLC %Kadar Paracetamol dan dihitung kadar Paracetamol berturut – turut
yaitu 98,0421%, 109,687%, 106,936%, 102,7946%, 98,4990%, dan
102,2138% memenuhi syarat. Karena berdasarkan Farmakope Indonesia IV,
kadar parasetamol dalam tablet tidak boleh < 90% dan >110

Pada kromatogram yang terbentuk, terdapat tailing factor dari setiap

konsentrasi. Tailing factor ini disebabkan oleh beberapa faktor antara lain:

1. Guard column yang sudah mulai rusak

2. Fase gerak yang sudah mulai rusak
3. Partikel silika yang dipakai di dalam bahan pendukung bukanlah
partikel silika yang baik
4. Adanya komponen lain yang keluar tepat setelah peak
5. Sampel bereaksi dengan gugus silanol pada partikel silika.
6. pH fase gerak yang tidak tepat.
7. Pemilihan kolom yang tidak teapat dengan senyawa yang menjadi
target analisa.
8. Pelarut yang digunakan untuk melarutkan sampel tidak kompatibel
dengan fase gerak.

4.2 Preparasi Standar

Standar Konsentrasi (ppm) Waktu Retensi (tR) Area (μV-sec)

1. 10,4 4,358 menit 765242
2. 10,4 4,350 menit 737000
3. 10,4 4,350 menit 763425
4. 10,4 4,342 menit 765031
5. 10,4 4,342 menit 764375
6. 10,4 4,333 menit 761726
 15

4.3 Sampel

No. Sampel Waktu Retensi (tR) Area (μV-sec)

1. Sampel 1 4,358 menit 692547
2. Sampel 2 4,333 menit 746210
3. Sampel 3 4,358 menit 753579
4. Sampel 4 4,350 menit 725918
5. Sampel 5 4,350 menit 694986
6. Sampel 6 4,342 menit 718698

4.4 Kadar

Konsentrasi Konsentrasi Faktor

Luas area Luas area
standar sampel Pengenceran Kadar (%)
sampel standar
(ppm) (mg/50 ml) (fp)
692547 765242 10,4 47,0602 100 98,0421%
746210 737000 10,4 52,6498 100 109,687%
753579 763425 10,4 51,3293 100 106,936%
725918 765031 10,4 49,3414 100 102,7946%
694986 764375 10,4 47,2795 100 98,4990%
718698 761726 10,4 49,0626 100 102,2138%
 16

BAB V

KESIMPULAN

Dari percobaan yang sudah dilakukan dapat diambil kesimpulan :

- HPLC atau High Performance Liquid Chromatography adalah instrument

untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa
biologis, analisis ketidak murnian (impurities) dan analisis senyawa-senyawa
yang tidak mudah menguap (nonvolatil).
- Dari hasil pengamatan, setelah dilakukan analisis standar dan sampel pada
HPLC % Kadar paracetamol dan dihitung kadar paracetamol memenuhi
syarat. Karena berdasarkan Farmakope Indonesia IV, kadar parasetamol
dalam tablet tidak boleh < 90% dan >110
 17

DAFTAR PUSTAKA

Cresswell, Clifford.J. 2005. Analisis Spektrum Senyawa Organik. Bandung: ITB

Hayun, Ibnu Ganjar Dan Abdul Rahman. 2006. Kimia Farmasi Analisis.
Yogyakarta: Pustaka Belajar

Ibnu Ghalib. 2012. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Belajar

Khopkar, S.M. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI Press

R.A.Day, Dr Jan Dan Al-Underwood. 2002. Analitik Kimia Kuantitatif. Jakarta:

Erlangga

Sumar, Hendayana. 1994. Parasetamol. Jakarta: UI Press

Supardani. 2011. Ilmu Kimia Analitik Dasar. Jakarta: PT Gramedia

 18

LAMPIRAN

1. Perhitungan
1. Preparasi fase gerak air dan metanol (3 : 1) 600ml
600ml = air (450ml) + metanol (150ml)

2. Pembuatan larutan standar

C1 = 1040 ppm
V1 = 0,5ml
V2 = 50ml
52 𝑚𝑔 1040 𝑚𝑔
Standar = = = 1040 ppm
50 𝑚𝑙 1000 𝑚𝑙
50 𝑚𝑙
FP = 0,5 𝑚𝑙 = 100
𝑉1 0,5
C2 = 𝑉2 × 𝐶1 = × 1040
50

= 10,4 ppm

3. Kadar Paracetamol
Diketahui: 5ml ~120mg
2ml ~ 48mg

Ditanya: Kadar sampel

𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
a. Csampel = 𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑙 × 𝐶𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 × 𝑓𝑝
692547
= 765242 × 10,4 × 100

= 941,2041 ppm

= 0,09412041 Kg/100ml ~ 47,0602 mg/50ml

47,0602
%Kadar = × 100%
48

= 98,0421%
 19

𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
b. Csampel = 𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑙 × 𝐶𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 × 𝑓𝑝
746210
= 737000 × 10,4 × 100

= 1052,996 ppm

= 0,1052996 Kg/100ml ~ 52,6498mg/50ml

52,6498
%Kadar = × 100%
48

= 109,687%

𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
c. Csampel = 𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑙 × 𝐶𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 × 𝑓𝑝
753579
= 763425 × 10,4 × 100

= 1026,5869 ppm

= 0,10265869 Kg/100ml ~ 51,3293mg/50ml

51,3293
%Kadar = × 100%
48

= 106,936%

𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
d. Csampel = 𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑙 × 𝐶𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 × 𝑓𝑝
725918
= 765031 × 10,4 × 100

= 986,8289 ppm
= 0,0986828289 Kg/100ml ~ 49,3414mg/50ml
49,3414
%Kadar = × 100%
48

= 102,7946%

𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
e. Csampel = 𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑙 × 𝐶𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 × 𝑓𝑝
694986
= 764375 × 10,4 × 100

= 945,5901 ppm
= 0,09455901 Kg/100ml ~ 47,2795mg/50ml
 20

47,2795
%Kadar = × 100%
48

= 998,4990%

𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
f. Csampel = 𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑙 × 𝐶𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 × 𝑓𝑝
718698
= 761726 × 10,4 × 100

= 981,2529 ppm
= 0,09812529 Kg/100ml ~ 49,0626mg/50ml
49,0626
%Kadar = × 100%
48

= 102,2138%
 21

2. Data Percobaan
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
 33

3. Gambar

Timbangan Analitik Alat Pengukur Ph Syringe Filter

Alat HPLC
 34

Ilustrasi alat HPLC