VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR LANSOPRAZOL

DALAM DARAH SECARA IN VITRO DENGAN KROMATOGRAFI CAIR

KINERJA TINGGI (KCKT)

OLEH

NAMA : WAODE NURFAHRAWATI FAHIRIN

NIM : F202001148

KELAS : A3 FARMASI

PROGRAM STUDI S1 FARMASI

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS MANDALA WALUYA

KENDARI

2023

i
 KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, rasa syukur serta pujian senantiasa kita panjatkan kehadirat

Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan hidayah-Nya serta segala
anugerah-Nya berupa kesehatan, pemikiran dan ide sehingga penulis dapat
menyelesaikan skripsi ini. Salawat serta salam semoga selalu tercurah kepada
junjungan Nabi Muhammad SAW, keluarga, para sahabat dan pengikutnya yang
senantiasa mengikuti sunnahnya hingga akhir zaman.
makalah ini saya susun untuk memenuhi salah satu syarat memenuhi
tugas validasi struktur Program Studi S1 Farmasi Universitas mandala waluya
kendari. Adapun makalh ini adalah “Validasi Metode Penetapan Kadar
Lansoprazol Dalam Darah secara In Vitro dengan Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi (KCKT)”.

Penulis menyadari bahwa dalam makalah ini terdapat banyak kekurangan

dan masih jauh dari kesempurnaan. Penulis mengharapkan kritik dan saran dari
pembaca untuk perbaikan dalam pembuatan makalah ini.

Kendari,7 Desember 2023

Penulis

ii
 DAFTAR ISI

Halaman

ABSTRAK..........................................................................................................vi
ABSTRACT........................................................................................................vii
KATA PENGANTAR.........................................................................................ii
DAFTAR GAMBAR..........................................................................................xiii
DAFTAR ISI.......................................................................................................iii

BAB I PENDAHULUAN ....................................................................... 1

1.1. Latar Belakang ...................................................................... 1
1.2. Perumusan Masalah .............................................................. 3
1.3. Tujuan Penelitian .. ................................................................ 3
1.4. Hipotesis ................................................................................ 3

BAB II TINJAUAN PUSTAKA .............................................................. 4

2.1.Lansoprazol .. .......................................................................... 4
2.2. Darah ...................................................................................... 6
2.3. Analisa Obat dalam Darah .................................................... 6
2.4.Kromatografi Cair Kinerja Tinggi........................................... 10
2.4.1. Cara Kerja KCKT ....................................................... 10
2.4.2. Wadah Fase Gerak pada KCKT ................................... 11
2.4.3. Fase Gerak pada KCKT ............................................... 11
2.4.4. Pompa pada KCKT ...................................................... 12
2.4.5. Penyuntikan Sampel pada KCKT ................................ 12
2.4.6. Kolom pada KCKT ...................................................... 12
2.4.7. Fase Diam pada KCKT ................................................ 13
2.4.8. Detektor KCKT ............................................................ 13
2.4.9. Penggunaan KCKT dalam Analisis Farmasi ............... 14
2.4.10. Keuntungan KCKT .................................................... 14
2.5. Validasi Metode Analisi......................................................... 14
2.5.1. Ketepatan (Akurasi) ..................................................... 15
2.5.2. Presisi ........................................................................... 15
2.5.3. Batas Deteksi (limit of detection, LOD)....................... 16
2.5.4. Batas Kuantifikasi (limit of quantification, LOQ) ....... 17
2.5.5. Linieritas ..................................................................... 17
2.5.6. Uji Kesesuaian Sistem ................................................ 18

BAB III METODOLOGI PENELITIAN ................................................ 19

3.1. Alur Penelitian ....................................................................... 19
3.2. Waktu dan Tempat Penelitian ............................................... 20

iii
 2
3.3. Bahan dan Alat.........................................................................20
3.3.1. Bahan.............................................................................20
3.3.2. Alat.................................................................................20
3.4. Prosedur kerja..........................................................................20
3.4.1. Pembuatan Larutan Induk Lansoprazol........................20
3.4.2. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Untuk ..
Analisis.........................................................................20
3.4.3. Penetapan Fase Gerak..................................................21
3.4.4. Uji Kesesuaian Sistem...................................................21
3.4.5. Penetapan Metode Ekstraksi........................................21
3.4.6. Validasi Metode Analisis Lansoprazol dalam Darah . 21
3.4.6.1. Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linieritas
dalam Darah In Vitro....................................................22

3.4.6.2. Limit Deteksi (LOD) dan Limit Kuantifikasi (LOQ) 22

3.4.6.3. Uji Selektifitas..............................................................22
3.4.6.4. Uji Akurasi...................................................................23
3.4.6.5. Uji Presisi.....................................................................23

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN......................................................24

4.1. Hasil.........................................................................................24
4.1.1. Penentuan Metode Analisis Lansoprazol......................24
4.1.1.1. Penetuan Panjang Gelombang Maksimum.................24
4.1.1.2. Penetapan Komposisi Fase Gerak...............................24
4.1.1.3. Uji Kesesuaian Sistem..................................................25
4.1.1.4. Penetapan Metode Ekstraksi.......................................26
4.1.2. Validasi Metode Analisis dalam Darah secara In Vitro
..................................................................................... 26
4.1.2.1. Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linieritas
dalam Darah In Vitro....................................................26

4.1.2.2. Uji Batas Deteksi dan Batas Kuantifikasi dalam

Darah In Vitro...............................................................27

4.1.2.3. Uji Selektivitas.............................................................27

4.1.2.4. Uji Akurasi...................................................................28
4.1.2.5. Uji Presisi.....................................................................28
4.2. Pembahasan.............................................................................29

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN......................................................34

5.1. Kesimpulan...............................................................................34
5.2. Saran........................................................................................34

DAFTAR PUSTAKA........................................................................................35
LAMPIRAN.......................................................................................................38
 3

DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar 2.1. Struktur Kimia Lansoprazol ......................................4

Gambar 2.2. Diagram Alir Alat KCKT..............................................................11
Gambar 4.1. Kurva Kalibrasi Lansoprazol dalam Darah....................................27
Gambar 6.1. Spektrum Panjang Gelombang Maksimum Lansoprazol dalam
Metanol pada Konsentrasi 10 µg/mL............................................38
Gambar 6.2. Alat Komatografi Cair Kinerja Tinggi Dionex Ultimate 3000......39
Gambar 6.3. Kromatogram Penetapan Fase Gerak 65:35 + TEA......................40
Gambar 6.4. Kromatogram Penetapan Fase Gerak 70:30..................................40
Gambar 6.5. Kromatogram Penetapan Fase Gerak 65:35..................................41
Gambar 6.6. Kromatogram Penetapan Fase Gerak 60:40..................................41
Gambar 6.7. Kromatogram Hasil Analisa Lansoprazol 10 ppm........................42
Gambar 6.8. Kromatogram Hasil Analisa Blanko..............................................43
Gambar 6.9. Kromatogram Hasil Analisa Lansoprazol 1 ppm dalam Darah.....44
Gambar 6.10 Kurva Kalibrasi Lansoprazol dalam Darah...................................46
 4

DAFTAR TABEL

Tabel 4.1. Penetapan fase gerak metanol:dapar fosfat........................................25

Tabel 4.2. Hasil uji rata-rata kesesuaian sistem sampel Lansoprazol................25
Tabel 4.3. Hasil penetapan pelarut pengendap protein plasma..........................26
Tabel 4.4. Hasil uji batas deteksi, batas kuantitasi.............................................27
Tabel 4.5. Hasil uji rata-rata selektivitas............................................................28
Tabel 4.6. Hasil uji rata-rata akurasi...................................................................28
Tabel 4.7. Hasil uji rata-rata presisi (intra day).................................................29
Tabel 4.8. Hasil uji rata-rata presisi (inter day)..................................................29
Tabel 6.1. Uji kesesuaian sistem.........................................................................45
Tabel 6.2. Hasil uji linearitas..............................................................................46
Tabel 6.3. Hasil uji batas deteksi, batas kuantitasi.............................................47
Tabel 6.4. Hasil uji rata-rata selektivitas............................................................48
Tabel 6.5. Hasil uji rata-rata akurasi...................................................................49
Tabel 6.6. Hasil uji rata-rata presisi....................................................................50
 5

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Lansoprazol adalah agen benzimidazol tersubstitusi untuk antisekresi
lambung, digunakan secara oral untuk pengobatan jangka pendek dan
mengurangi gejala-gejala aktif duodenum serta tukak lambung dan sebagai
terapi pemeliharaan untuk penyembuhan ulkus duodenum. Lansoprazol juga
digunakan secara oral dalam kombinasi dengan amoksisilin (terapi ganda)
atau dengan klaritromisin dan amoksisilin (terapi triple) untuk pengobatan
infeksi Helicobacter pylori. Secara struktural dan farmakologis, Lansoprazol
berkaitan dengan Omeprazol. Perbedaan secara struktural dari obat ini adalah
adanya trifluoroetoksi di posisi 4 dari cincin piridin dan tidak adanya metil
dan gugus metoksi pada cincin piridin dan benzimidazol (McEvoy, 2008).
Lansoprazole sebesar 97% terikat pada protein plasma. Pengikatan protein
plasma adalah konstan pada kisaran konsentrasi 0,05-5,0 µg/mL (Anonim,
2000).
Monitoring obat rute oral yang paling umum dilakukan adalah kuantifikasi
obat dalam plasma, oleh karena sebagian besar sel-sel jaringan diperfusi oleh
darah, maka pemeriksaan kadar obat dalam darah merupakan suatu metode
yang paling akurat untuk pemantauan pengobatan dan pengoptimalan terapi
obat (Shargel & Andrew, 2005). Untuk dapat melakukan pemantauan
terhadap suatu senyawa obat, diperlukan metode analisis yang harus
divalidasi sesuai aturan yang ditetapkan untuk validasi metode analisis.

Validasi metode analisis menurut United States Pharmacopeia (USP)

dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik,
reprodusibel, dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Suatu
metode analisis harus divalidasi untuk melakukan verifikasi bahwa
parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi problem
analisis dan menjamin bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan
penggunanya. Beberapa parameter validasi metode meliputi akurasi, presisi,
linearitas, perolehan kembali, stabilitas, limit deteksi, dan limit kuantitasi
serta selektivitas (Gandjar & Rohman, 2007).
Penetapan kadar zat aktif dalam darah membutuhkan metode analisis yang
 6
mempunyai selektivitas dan sensitifitas tinggi, dikarenakan banyaknya
komponen lain yang terdapat dalam darah dan plasma, sehingga dalam
penelitian ini digunakan metode analisis dengan menggunakan Kromatografi
Cair Kinerja Tinggi (KCKT) karena dapat menganalisis komponen dalam
sampel dengan kadar yang sangat kecil yaitu dalam jumlah nanogram (10 -9 g)
bila menggunakan detektor serapan UV, bahkan hingga dalam jumlah
pikogram (10-12 g) bila dengan detektor fluoresensi dan elektrokimia (Johnson
& Stevenson, 1991).
Penetapan kadar Lansoprazole dalam plasma manusia telah dilakukan
beberapa peneliti sebelumnya menggunakan Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi. Pada penelitian Reddy.Battu dan Reddy. G pada tahun 2009,
pemisahan kromatografi dicapai secara isokratis pada kolom C 18 (Inertsil C18,
5 µm, 150 mm x 4,6 mm) memanfaatkan fase gerak asetonitril/dapar fosfat
(70:30, v / v, pH 7,0) dengan kecepatan aliran 0,8 ml/menit dengan deteksi
UV pada 260 nm. Penelitian yang dilakukan oleh Uno et al. menggunakan
TSK-PW precolumn untuk pembersihan dan kolom C18 STR ODS-II untuk
analisis. Kemudian M.D. Karol et al, melakukan analisis Lansoprazol dengan
KCKT dengan menggunakan baku dalam. Lansoprazol, metabolitnya, dan
baku dalam (Omeprazol) diekstraksi ke dalam dietil eter-metilen klorida dan
diperoleh pemisahan menggunakan asetonitril 35% (dengan penambahan 1
ml/l n-octylamine dan NAHA) pada pH 7.0, memperoleh LLOQ (Lower
Limit of Quantification) adalah 10 ng/ml untuk semua senyawa.
Metode analisis yang telah dipublikasikan seringkali dimodifikasi untuk
menyesuaikan kondisi dengan peralatan yang tersedia di laboratorium
pengujian. Modifikasi ini harus divalidasi untuk memastikan pelaksanaan
pengujian yang sesuai dari metode analisis. Pada penelitian ini, akan
dilakukan modifikasi terhadap metode analisis yang telah dipublikasikan dan
validasi dari modifikasi tersebut. Modifikasi metode yang dilakukan pada
fase gerak yang menggunakan metanol. Hal ini didasarkan pada kelarutan
 7

Lansoprazol yang larut dalam metanol, sehingga dapat digunakan dalam

penentuan kadar Lansoprazol secara in vitro dalam darah manusia.

1.2. Perumusan Masalah

a. Bagaimanakah metode ekstraksi yang paling baik dan optimasi fase gerak
untuk penetapan kadar Lansoprazol dalam darah manusia dengan KCKT?
b. Apakah penetapan kadar Lansoprazol dalam darah in vitro secara
kromatografi cair kinerja tinggi memiliki nilai validitas yang sesuai
dengan persyaratan untuk suatu metode bioanalisis?

1.3. Tujuan Penelitian

a. Menentukan metode ekstraksi yang paling baik dan optimasi fase gerak
untuk penetapan kadar Lansoprazol dalam darah manusia dengan KCKT.
b. Memperoleh validitas metode analisis untuk penetapan kadar
Lansoprazol dalam darah manusia secara in vitro dengan kromatografi
cair kinerja tinggi.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Lansoprazol
Struktur Lansoprazol:
 8

Gambar 2.1. Struktur kimia Lansoprazole (Sweetman, 2009)

Nama kimia : 2-(2-benzimidazolylsulfinylmethyl)-3-methyl-4-(2,2,2-tri-

fluoroethoxy)pyridin
Rumus Molekul : C16H14F3N3O2S
Bobot Molekul : 369,37
Pemerian : berbentuk bubuk putih atau kecoklatan
Titik lebur : 178-182°C
Kelarutan : larut dalam metanol, sedikit larut dalam diklorometana
dan asetonitril, dan praktis tidak larut dalam air.
Penyimpanan : dalam wadah kedap udara dan terlindung dari
cahaya. (Sweetman, 2009; Anonim, 2000)

Lansoprazol adalah agen benzimidazol tersubstitusi untuk antisekresi

lambung. Lansoprazol digunakan secara oral untuk pengobatan jangka
pendek dan mengurangi gejala-gejala aktif duodenum serta tukak lambung
dan sebagai terapi pemeliharaan untuk penyembuhan ulkus duodenum.
Lansoprazol juga digunakan secara oral dalam kombinasi dengan amoksisilin
(terapi ganda) atau dengan klaritromisin dan amoksisilin (terapi triple) untuk
pengobatan infeksi Helicobacter pylori. Lansoprazol secara struktural dan
farmakologis berkaitan dengan omeprazole, perbedaan secara struktural dari
obat ini adalah dengan kehadiran sekelompok trifluoroetoksi di posisi 4 dari
cincin piridin dan tidak adanya metil dan gugus metoksi pada cincin piridin
dan benzimidazol. Obat ini secara kimia dan farmakologi tidak terkait dengan
antagonis reseptor H2, antimuskarinik, atau analog prostaglandin (McEvoy,
2008).
Lansoprazol mengikat hidrogen/kalium adenosin triphosphatase (H +K+ -
ATPase) pada sel parietal lambung, inaktivasi dari sistem enzim (juga dikenal
sebagai pompa proton, hidrogen, atau asam) menghambat langkah terakhir
dalam sekresi asam klorida oleh sel-sel ini. Oleh karena itu, agen antisekresi
lambung seperti lansoprazole dan omeprazole sering disebut sebagai inhibitor
 9
asam atau penghambat pompa proton. Lansoprazole merupakan basa lemah,
tidak secara langsung menghambat sistem enzim, tetapi sebaliknya, ia
berkonsentrasi pada kondisi asam dari sekretori kanalikuli sel parietal,
dimana obat ini mengalami penataan ulang untuk metabolit aktif sulfenamida;
metabolit aktif kemudian bereaksi dengan kelompok sulfhidril dari H+K+
-ATPase menonaktifkan pertukaran pompa proton. Karena metabolit
sulfenamida membentuk ikatan kovalen permanen pada H+K+ -ATPase,
sekresi asam dihambat sampai tambahan enzim disintesis, menghasilkan
durasi tindakan berkepanjangan (McEvoy, 2008).
Lansoprazole dengan cepat diserap setelah dosis oral, dengan konsentrasi
puncak plasma dicapai setelah sekitar 1,5 sampai 2 jam. Bioavailabilitas
dilaporkan menjadi 80% atau lebih bahkan dengan dosis pertama, meskipun
obat tersebut harus diberikan dalam bentuk salut enterik karena lansoprazole
tidak stabil pada pH asam. Makanan memperlambat penyerapan dan
mengurangi bioavailabilitas lansoprazole dengan sekitar 50%. Lansoprazol
adalah secara ekstensif dimetabolisme di hati, terutama oleh CYP2C19,
isoenzim sitokrom P450 untuk membentuk 5-hidroksi-lansoprazole dan oleh
CYP3A4 untuk membentuk lansoprazole sulfon. Metabolit diekskresikan
terutama di feses melalui empedu, hanya sekitar 15 sampai 30% dari dosis
diekskresikan dalam urin. Waktu paruh eliminasi dalam plasma adalah sekitar
1 sampai 2 jam tetapi durasi kerjanya lebih lama. Lansoprazole sekitar 97%
terikat pada protein plasma. Klirens menurun pada pasien usia lanjut, dan
dalam kerusakan hati (Sweetman, 2009; APhA, 2008).

2.2. Darah
Darah terdiri atas plasma darah dan sel-sel darah. Sebagian besar darah
terdiri atas sel darah merah atau eritrosit, sedangkan jumlah sel darah putih
atau leukosit relatif sedikit, yaitu 2 permil dari jumlah eritrosit. Disamping
eritrosit dan leukosit masih ada partikel lain yang disebut trombosit.
Trombosit ini mempunyai fungsi penting pada penggumpalan darah.
Apabila darah yang telah diberi antikoagulan diputar dengan pemusing
(sentrifuga), maka sel-sel darah akan mengendap, sedangkan plasma darah
akan berada diatasnya. Bobot jenis darah bervariasi antara 1,054-1,060,
sedangkan bobot jenis plasma darah ialah kira-kira 1,024-1,028. Viskositas
(derajat kekentalan) darah kira-kira 4,5 kali viskositas air (Pudjiadi, 1994).
 1
Volume total plasma pada orang dewasa normal sekitar 2,5 - 3 liter atau0
mencapai 55 - 58% volume darah. Plasma mengandung suatu senyawa
pembeku dan akan membeku bila terpapar oleh udara. Namun untuk
mencegah pembekuan plasma dapat ditambahkan suatu antikoagulan seperti
sitrat atau heparin (Sherwood, 1996).

2.3. Analisis Obat dalam Plasma Darah

Untuk kepentingan analisis obat, sampel plasma merupakan sampel yang
paling umum digunakan karena ada hubungan yang baik antara konsentrasi
obat dalam plasma dengan efek terapetik yang ditimbulkan (Kelly, 1992).
Dalam beberapa kasus, konsentrasi obat dalam plasma yang diukur mencapai
level mikrogram sampai nanogram atau pikogram. Untuk itu, dapat
digunakan metode KCKT karena salah satu keuntungan dari KCKT adalah
dapat menghitung sampel dengan kadar yang sangat rendah (Johnson &
Stevenson, 1991).
Namun matriks biologis seperti halnya plasma mengandung sejumlah
besar komponen endogen yang dapat mengganggu analisis. Oleh karena itu,
sampel plasma perlu diberi perlakuan sebelum diinjeksikan (pre treatment)
untuk memisahkan analit yang akan dianalisis dari komponen endogen
plasma yang dapat mengganggu analisis. Beberapa teknik penyiapan sampel
yang digunakan untuk analisis dalam matriks plasma:

a. Pengendapan protein
Pada metode ini, digunakan asam/ pelarut organik yang bercampur dengan
air untuk mendenaturasi dan mengendapkan protein. Asam seperti
trikloroasetat dan asam perklorat sangat efisien untuk mengendapkan protein
pada konsentrasi 5-20%. Pelarut organik seperti metanol, asetonitril, aseton,
dan etanol memiliki efisiensi yang relatif lebih rendah untuk mengendapkan
protein. Akan tetapi, pelarut-pelarut tersebut banyak digunakan untuk
bioanalisis karena sesuai dengan fase gerak pada KCKT dan dapat
mengekstraksi senyawa berdasarkan prinsip kepolaran. Pelarut organik akan
menurunkan solubilitas protein sehingga protein akan mengendap (Evans,
2004; Kelly, 1990).
b. Ekstraksi cair- cair
Ekstraksi cair - cair berguna untuk memisahkan analit dari pengotor
dengan menyekat sampel diantara 2 fase larutan tak tercampurkan. Fase
 1
pertama umumnya berupa fase aqueous, sedangkan fase kedua berupa fase1
organik. Analit yang akan diekstraksi harus larut diantara satu fase larutan
tersebut. Prinsip ekstraksi cair – cair ini adalah senyawa yang bersifat lebih
hidrofilik akan larut ke fase aqueous dan senyawa yang bersifat lebih
hidrofobik akan cenderung mudah ditemukan di fase organik. Analit yang
terekstraksi ke dalam fase organik akan dengan mudah diperoleh kembali
melalui penguapan, sedangkan analit yang terekstraksi ke dalam fase aqueous
dapat langsung disuntikkan ke dalam kolom KCKT fase balik. Larutan
aqueous yang dapat digunakan adalah air, larutan yang bersifat asam/basa,
garam, dan lainnya. Pelarut organik yang dapat digunakan adalah heksan, etil
asetat, toluen, dan lainnya. Kelemahan dari metode yaitu tidak dapat
diaplikasikan ke semua analit, contohnya analit yang bersifat sangat polar
sulit menggunakan metode ini (Evan, 2004; Kelly, 1990).
c. Ekstraksi fase padat
Pada ekstraksi fase padat ini digunakan kolom berukuran kecil (cartridge)
dengan adsorben yang mirip dengan yang digunakan pada saat analisis dan
biasanya disesuaikan dengan sifat analit yang diperiksa. Ekstraksi fase padat
adalah suatu teknik yang dapat mengatasi beberapa masalah yang ditemui

pada ekstraksi cair-cair. Prinsip umum dari ekstraksi ini yaitu adsorpsi obat
dari larutan ke dalam adsorben atau fase diam (Harahap, Y., 2010).
d. Ekstrasi cair- padat
Ekstraksi cair padat merupakan teknik yang sering digunakan untuk
perlakuan sampel pada KCKT. Apabila ekstraksi cair - cair merupakan proses
pemisahan satu tahap, maka ekstraksi cair - padat merupakan prosedur
pemisahan mirip kromatografi dan memiliki beberapa keuntungan
dibandingkan ekstraksi cair - cair. Keuntungan tersebut antara lain dihasilkan
ekstraksi analit yang lebih sempurna, pemisahan analit yang lebih efisien dari
pengotor, pengurangan penggunaan pelarut organik, pengumpulan fraksi
analit total yang lebih mudah, penghilangan partikulat, dan pengoperasian
yang lebih mudah. Empat tahapan pada proses ekstraksi cair – padat yaitu
pengkondisian alat, pemasukan sampel, pengaliran larutan pencuci untuk
menghilangkan pengotor, dan proses perolehan kembali analit (Evans, 2004;
Kelly, 1990).
Konsentrasi obat dalam plasma umumnya rendah pada dosis terapi, oleh
 1
karena itu diperlukan persiapan sampel khusus untuk analisis obat dalam2
plasma. Dalam plasma, obat terikat pada permukaan protein sehingga harus
dibebaskan terlebih dahulu, lansoprazol dalam plasma berikatan dengan
protein plasma sebesar ± 97% (Sweetman, 2009), sehingga diperlukan
perlakuan tertentu untuk membebaskannya sebelum dianalisis.
Beberapa metode analisis Lansoprazol dalam plasma yang telah dilakukan
oleh beberapa peneliti terdahulu yaitu:
a. Penetuan kadar Lansoprazol dalam plasma darah dan tablet dengan
menggunakan RP-HPLC.
Kondisi : Pemisahan kromatografi dicapai secara isokratis pada kolom C 18
[Inertsil C18, 5 µ, 150 mm x 4,6 mm] memanfaatkan fase gerak asetonitril /
dapar fosfat (70:30, v / v, pH 7,0) dengan kecepatan aliran 0,8 ml / menit
dengan deteksi UV pada 260 nm. Waktu retensi Lansoprazole adalah 2,53
min. Metode ini akurat (99,15-101,85%), tepat konsentrasi (0,13-1,56%
dan antar-hari variasi 0,30-1,60% intra-hari variasi) dan linier dalam
jangkauan 0,1-30 μg/ml (R2 = 0,999) dan telah berhasil digunakan dalam

pemantauan obat. yang tersisa. Batas deteksi Lansoprazole pada signal-to-

noise ratio of 3 adalah 1,80 ng/ml dalam plasma manusia sementara batas
kuantifikasi dalam serum manusia adalah 5,60 ng/ml (Reddy.Battu dan
Venkateswara, 2009).
b. Penentuan kadar Lansprazol dalam plasma darah menggunakan KCKT
column-switching.

Kondisi : metode untuk penentuan secara simultan dari Lansoprazol,

inhibitor pompa proton dan metabolit utamanya: 5-hidroksilansoprazol
dan Lansoprazole sulfon dalam plasma manusia. Senyawa uji diekstrak
dari 1 mL plasma menggunakan dietil eter-diklorometana (7:3, v / v) dan
ekstrak disuntikkan ke dalam kolom I (TSK-PW precolumn, 10 µm, 3,5
mm × 4,6 mm) untuk pembersihan dan kolom I (STR BPO-II C18 analitis
kolom, 5 pM, 150mm × 4.6mm id) untuk pemisahan. Puncaknya terdeteksi
oleh detektor ultraviolet ditetapkan pada panjang gelombang 285 nm, dan
total waktu untuk pemisahan kromatografi adalah ~ 25 menit. Metode ini
divalidasi untuk rentang konsentrasi 3-5000 ng / mL. Perolehan kembali
rata-rata adalah 74,0% untuk Lansoprazol, 68,3% untuk 5-
Hidroksilansoprazol, dan 79,4% untuk Lansoprazol sulfon. RSD dari Intra
 1
dan inter day kurang dari 6,1 dan 5,1% untuk Lansoprazol, 5,8 dan 5,8%3
untuk 5-Hidroksilansoprazol, 4,4 dan 5,9% untuk Lansoprazol sulfon,
masing-masing, pada rentang konsentrasi yang berbeda (Uno et al., 2005).
c. Penentuan kadar Lansoprazol dalam plasma darah manusia menggunakan
KCKT dengan baku dalam.
Kondisi : Lansoprazol, metabolitnya, dan baku dalam (Omeprazol)
diekstraksi ke dalam dietil eter-metilen klorida (7:3, v/v) dan disentrifugasi
pada 2000 rpm; 6OC selama 10 menit dan diperoleh pemisahan
menggunakan kolom fase terbalik dalam kondisi isokratik. Metode ini
memiliki deteksi ultraviolet pada 285 nm monokromatik, dan ekstraksi
tunggal, penguapan penanganan sampel tunggal. Batas bawah kuantisasi,
berdasarkan baku yang dapat diterima dengan koefisien variasi, adalah 10
ng / ml untuk semua senyawa. Tidak ada senyawa endogen ditemukan
telah menginterferensi (Karol et al. 1995).

2.4. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kromatografi cair kinerja tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut
dengan HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dikembangkan
pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, KCKT
merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas dan paling cepat
berkembang untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu
sampel.
Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa
organik, anorganik, maupun senyawa biologis; analisis ketidakmurnian
(impurities); analisis senyawa-senyawa tidak mudah menguap (non-volatil);
penentuan molekul-molekul netral, ionik, maupun zwitter ion; isolasi dan
pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir
sama; pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit (trace elements),
dalam jumlah banyak, dan dalam skala proses industri. KCKT merupakan
metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis
kualitatif maupun kuantitatif (Gandjar & Rohman, 2007; Harmita, 2006).
2.4.1. Cara Kerja KCKT
Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut
terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati
suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi
 1
solut dalam fase gerak dan fase diam. Penggunaan kromatografi cair secara4
sukses terhadap suatu masalah yang dihadapi membutuhkan penggabungan
secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom,
fase gerak, panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu
kolom, dan ukuran sampel.
Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas delapan komponen pokok,
yaitu: wadah fase gerak, sistem penghantaran fase gerak, alat untuk
memasukkan sampel, kolom, detektor, wadah penampung buangan fase
gerak, tabung penghubung, dan suatu komputer atau integrator atau perekam
(Gandjar & Rohman, 2007).
Keterangan : 1 = Tempat fase gerak + penyaring; 2 = saluran penghubung dengan frit; 3 =
pompa; 4 = injektor sampel (autosampler); 5 = kolom; 6 = detektor; 7 = pembuangan; 8 =
pengolah data

Gambar 2.2. Diagram Alir Alat KCKT (Meyer, V., 2010)

2.4.2. Wadah Fase Gerak pada KCKT
Wadah fase gerak harus bersih dan lembab (inert). Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah
ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase
gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang
ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen
lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis
(Gandjar & Rohman, 2007).
2.4.3. Fase Gerak pada KCKT
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat
bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi.
Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut,
polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sample. Untuk fase
normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi
meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase
 1
terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi5
menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut (Gandjar & Rohman, 2007).
2.4.4. Pompa pada KCKT
Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang
mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus
inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah
gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan
sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu
mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 ml/menit. Untuk tujuan
preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak
dengan kecepatan 20 ml/menit (Gandjar & Rohman, 2007).
2.4.5. Penyuntikan Sampel pada KCKT
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase
gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat
penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang
dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.
Pada saat pengisian sampel sampel digelontor melewati keluk sampel dan
kelebihannya dikeluarkan ke pembuang. Pada saat penyuntikan, katup diputar
sehingga fase gerak mengalir melewati keluk sampel dan menggelontor
sampel ke kolom. Presisi penyuntikan dengan keluk sampel ini dapat
mencapai nilai RSD 0,1%. Penyuntik ini mudah digunakan untuk otomatisasi
dan sering digunakan untuk autosampler pada KCKT (Gandjar & Rohman,
2007).
2.4.6. Kolom pada KCKT
Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom
mikrobor. Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama
dibandingkan dengan kolom konvensional, yakni:
a. Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil
dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor
kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10-100 µl/menit).
b. Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor
lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
 1
c. Sensitifitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat,6
karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas
misal sampel klinis.
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan
kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin (Gandjar &
Rohman, 2007).
2.4.7. Fase Diam Pada KCKT
Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara
kimiawi, silica yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan
divinilbenzen. Permukaan silica adalah polar dan sedikit asam karena adanya
residu gugus silanol (Si-OH).
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-
reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus
silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain. Hasil
reaksi yang diperoleh disebut dengan silika fase terikat yang stabil terhadap
hidrolisis karena terbentuk ikatan-ikatan siloksan (Si-O-O-Si). Silika yang
dimodifikasi ini mempunyai karakteristik kromatografik dan selektifitas yang
berbeda jika dibandingkan dengan silika yang tidak dimodifikasi (Gandjar &
Rohman, 2007).
2.4.8. Detektor KCKT
Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor
universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik,
dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor
spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan
mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis,
detektor fluoresensi, dan elektrokimia.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:
a. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel,
b. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut
pada kadar yang sangat kecil,
c. Stabil dalam pengoperasiannya,

d. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan

pelebaran pita. Untuk kolom konvensional, selnya bervolume 8 µl atau
 1
lebih kecil, sementara kolom mikrobor selnya bervolume 1 µl atau lebih7
kecil lagi,
e. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solute pada
kisaran yang luas (kisaran dinamis linier), dan
f. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase
gerak (Gandjar & Rohman, 2007).
2.4.9. Penggunaan KCKT Dalam Analisis Farmasi
Metode KCKT merupakan metode yang sangat populer untuk menetapkan
kadar senyawa obat baik dalam bentuk sediaan maupun dalam sampel hayati.
Hal ini disebabkan KCKT merupakan metode yang memberikan sensitifitas
dan spesifisitas yang tinggi (Gandjar & Rohman, 2007).
2.4.10. Keuntungan KCKT
KCKT mempunyai banyak keuntungan jika dibandingkan dengan KC
(Kromatografi Cair) tradisional, yaitu:
a. Kecepatan waktu analisis,
b. Daya pisahnya baik dan selektif,
c. Peka, karena detektor dapat mendeteksi konsentrasi yang kecil,
d. Kolom dapat dipakai kembali,
e. Ideal untuk molekul besar dan ion, dan
f. Mudah memperoleh kembali
cuplikan. (Johnson & Stevenson, 1991).

2.5. Validasi Metode Analisis

Validasi merupakan suatu proses yang terdiri atas paling tidak 4 langkah
nyata, yaitu: (1) validasi perangkat lunak (software validation), (2) validasi
perangkat keras/instrument (instrument/hardware validation), (3) validasi
metode, dan (4) kesesuaian sistem (system suitability).

Validasi metode analisis menurut United States Pharmacopeia (USP)

dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik,
reprodusibel, dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis.

Suatu metode analisis harus divalidasi untuk melakukan verifikasi bahwa

parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi problem
analisis, karenanya suatu metode harus divalidasi, ketika:
 1
a. Metode baru dikembangkan untuk mengatasi problem analisis tertentu. 8
b. Metode yang sudah baku direvisi untuk menyesuaikan perkembangan
atau karena munculnya suatu problem yang mengarahkan bahwa metode
baku tersebut harus direvisi.
c. Penjaminan mutu yang mengindikasikan bahwa metode baku telah
berubah seiring dengan berjalannya waktu.
d. Metode baku digunakan di laboratorium yang berbeda, dikerjakan oleh
analis yang berbeda, atau dikerjakan dengan alat yang berbeda.
e. Untuk mendemonstrasikan kesetaraan antar 2 metode, seperti antara
metode baru dan metode baku.
(Gandjar & Rohman, 2007).
2.5.1. Ketepatan (akurasi)
Akurasi merupakan ketelitian metode analisis atau kedekatan antara nilai
terukur dengan nilai yang diterima baik nilai konvensi, nilai sebenarnya, atau
nilai rujukan. Akurasi diukur sebagai banyaknya analit yang diperoleh
kembali pada suatu pengukuran dengan melakukan spiking pada suatu
sampel. Untuk pengujian senyawa obat, akurasi diperoleh dengan
membandingkan hasil pengukuran dengan bahan rujukan standar (standard
reference material, SRM). Suatu metode dikatakan tepat jika ia menghasilkan
hasil yang sama dalam sederet penentuan ulangan (Gandjar & Rohman, 2007;
Johnson & Stevenson, 1991).
2.5.2. Presisi
Presisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis dan biasanya
diekspresikan sebagai simpangan baku relatif dari sejumlah sampel yang
berbeda signifikan secara statistik. Sesuai dengan ICH (International
Conference on Harmanization), presisi harus dilakukan pada 3 tingkatan yang
berbeda yaitu: keterulangan (repeatibility), presisi antara (intermediate
precision) dan ketertiruan (reproducibility).
 1
9

a. Keterulangan yaitu ketepatan (precision) pada kondisi percobaan yang

sama (berulang) baik orangnya, peralatannya, tempatnya, maupun
waktunya.
b. Presisi antara yaitu ketepatan (precision) pada kondisi percobaan yang
berbeda, baik orangnya, peralatannya, tempatnya, maupun waktunya.
c. Ketertiruan merujuk pada hasil-hasil dari laboratorium yang lain.
Dokumentasi presisi seharusnya mencakup: simpangan baku, simpangan
baku relatif (RSD) atau koefisien variasi (CV), dan kisaran kepercayaan.
Pengujian presisi pada saat awal validasi metode seringkali hanya
menggunakan 2 parameter yang pertama, yaitu: keterulangan dan presisi
antara. Reprodusibilitas biasanya dilakukan ketika akan melakukan uji
banding antar laboratorium. Presisi seringkali diekspresikan dengan SD atau
standar deviasi relatif (RSD) dari serangkaian data.
Data untuk menguji presisi seringkali dikumpulkan sebagai bagian kajian-
kajian lain yang berkaitan dengan presisi seperti linearitas atau akurasi.
Biasanya replikasi 6-15 dilakukan pada sampel tunggal untuk tiap-tiap
konsentrasi. Pada pengujian dengan KCKT, nilai RSD antara 1-2% biasanya
dipersyaratkan untuk senyawa-senyawa aktif dalam jumlah yang banyak;
sedangkan untuk senyawa-senyawa dengan kadar sekelumit, RSD berkisar
antara 5-15% (Gandjar & Rohman, 2007).
2.5.3. Batas Deteksi (limit of detection, LOD)
Batas deteksi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam
sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dapat
dikuantifikasi. LOD merupakan batas uji yang secara spesifik menyatakan
apakah analit di atas atau di bawah nilai tertentu. Definisi batas deteksi yang
paling umum digunakan dalam kimia analisis adalah bahwa batas deteksi
merupakan kadar analit yang memberikan respon sebesar respon blangko (y b)
ditambah dengan 3 simpangan baku blangko (3Sb).
LOD seringkali diekspresikan sebagai suatu konsentrasi pada rasio signal
terhadap derau (signal to noise ratio) yang biasanya rasionya 2 atau 3
dibanding 1. ICH mengenalkan suatu konversi metode signal to noise ratio
ini, meskipun demikian ICH juga menggunakan 2 metode pilihan lain untuk
 2
0

menentukan LOD yakni: metode non instrumental visual dan dengan metode
perhitungan. Metode non instrumental visual digunakan pada teknik
kromatografi lapis tipis dan pada metode titrimetri. LOD juga dapat dihitung
berdasarkan pada standar deviasi (SD) respon dan kemiringan (slope, S)
kurva baku pada level yang mendekati LOD sesuai dengan rumus, LOD = 3
(SD/S). Standar deviasi respon dapat ditentukan berdasarkan pada standar
deviasi blanko, pada standar deviasi residual dari garis regresi, atau standar
deviasi intersep y pada garis regresi (Gandjar & Rohman, 2007).
2.5.4. Batas Kuantifikasi (limit of quantification, LOQ)
Batas kuantifikasi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam
sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima
pada kondisi operasional metode yang digunakan. Sebagaimana LOD, LOQ
juga diekspresikan sebagai konsentrasi (dengan akurasi dan presisi juga
dilaporkan). Kadang-kadang rasio signal to noise 10:1 digunakan untuk
menentukan LOQ. Perhitungan LOQ dengan rasio signal to noise 10:1
merupakan aturan umum, meskipun demikian perlu diingat bahwa LOQ
merupakan suatu kompromi antara konsentrasi dengan presisi dan akurasi
yang dipersyaratkan. Jadi, jika konsentrasi LOQ menurun maka presisi juga
menurun. Jika presisi tinggi dipersyaratkan, maka konsentrasi LOQ yang
lebih tinggi harus dilaporkan.
ICH mengenalkan metode rasio signal to noise ini, meskipun demikian
sebagaimana dalam perhitungan LOD, ICH juga menggunakan 2 metode
pilihan lain untuk menentukan LOQ yaitu: (1) metode non instrumental visual
dan (2) metode perhitungan. Sekali lagi, metode perhitungan didasarkan pada
standar deviasi respon (SD) dan slope (S) kurva baku sesuai rumus: LOQ =
10 (SD/S). Standar deviasi respon dapat ditentukan berdasarkan standar
deviasi blanko pada standar deviasi residual garis regresi linier atau dengan
standar deviasi intersep-y pada garis regresi (Gandjar & Rohman, 2007).
2.5.5. Liniearitas
Linieritas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-
hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada
kisaran yang diberikan. Linieritas suatu metode merupakan ukuran seberapa
 2
1

baik kurva kalibrasi yang menghubungkan antara respon (y) dengan

konsentrasi (x). Linieritas dapat diukur dengan melakukan pengukuran
tunggal pada konsentrasi yang berbeda-beda. Data yang diperoleh selanjutnya
diproses dengan metode kuadrat terkecil, untuk selanjutnya dapat ditentukan
nilai kemiringan (slope), intersep, dan koefisien korelasinya (Gandjar &
Rohman, 2007).
2.5.6. Uji Kesesuaian Sistem
Seorang analis harus memastikan bahwa sistem dan prosedur yang
digunakan harus mampu memberikan data yang dapat diterima. Hal ini dapat
dilakukan dengan percobaan kesesuaian sistem yang didefinisikan sebagai
serangkaian uji untuk menjamin bahwa metode tersebut dapat menghasilkan
akurasi dan presisi yang dapat diterima. Persyaratan-persyaratan kesesuaian
sistem biasanya dilakukan setelah dilakukan pengembangan metode dan
validasi metode.
United States Pharmacopeia (USP) menentukan parameter yang dapat
digunakan untuk menetapkan kesesuaian sistem sebelum analisis. Parameter-
parameter yang digunakan meliputi: bilangan lempeng teori (N), faktor
tailing, kapasitas (k’ atau α) dan nilai standar deviasi relatif (RSD) tinggi
puncak dan luas puncak dari serangkaian injeksi. Pada umumnya, paling tidak
ada 2 kriteria yang biasanya dipersyaratkan untuk menunjukkan kesesuaian
sistem suatu metode. Nilai RSD tinggi puncak atau luas puncak dari 5 kali
injeksi larutan baku pada dasarnya dapat diterima sebagai salah satu kriteria
baku untuk pengujian komponen yang jumlahnya banyak (komponen mayor)
jika nilai RSD ≤ 1% untuk 5 kali injeksi. Sementara untuk senyawa-senyawa
dengan kadar sekelumit, nilai RSD dapat diterima jika antara 5-15% (Gandjar
& Rohman, 2007).
 BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

5.1. Alur Penelitian

Lansoprazole (LPZ) digunakan secara luas sebagai antiulcer dan produk

obat yang beredar harus diyakini keefektivitasannya secara
farmakologi

Dilakukan penetapan kadar Lansoprazole secara in vitro

dalam

Pembuatan larutan induk

Lansoprazol

Pengukuran λ maksimum LPZ dengan spektrofotometer UV-Visible

Metode ekstraksi LPZ Validasi metode

dalam darah

Penetapan
metode
Limit deteksi dan
Liniearitas Akurasi limit kuantitasi
Presisi Peroleha
Selektivitas n
5.2. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Kimia Medisinal (PMC),
Laboratorium Bioavailabilitas dan Bioekivalensi (PBB), dan Laboratorium
Bahan Alam (PNA) Program Studi Farmasi FKIK Universitas Islam Negeri
Syarif Hidayatullah Jakarta pada September 2012 sampai Januari 2013.

5.3. Bahan dan Alat

5.3.1. Bahan
Lansoprazol BPFI (BPOM), metanol (Merck), kalium dihidrogenfosfat
(Merck), natrium hidroksida (Merck), trietilamin, dietil eter (Merck), metilen
klorida (Merck), darah (PMI DKI Jakarta), aquabidest (Ikapharmindo
Putramas), gas nitrogen.
5.3.2. Alat
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (Dionex UltiMate ® 3000) yang terdiri
dari; pompa, autosampler, kolom Acclaim® Polar Advantage II (C18; 3 µm;
4,6 x 150 mm), detektor DAD (Diode Array Detector), program komputer PC
(Chromeleon®). Spektrofotometer Ultraviolet-Visibel (Hitachi U-2910),
vorteks, sentrifugator dengan tabung sentrifugasi, timbangan analitik, alat-alat
gelas, mikropipet, lemari pendingin, dan evaporator (TurboVap® LV)

5.4. Prosedur Kerja

5.4.1. Pembuatan Larutan Induk Lansoprazol
Ditimbang sebanyak 20,1 mg Lansoprazole. Dilarutkan ke dalam metanol
hingga volume akhir 100 mL. Diencerkan menjadi konsentrasi 100 µg/mL
dalam 50 ml. Konsentrasi 100 µg/mL digunakan sebagai larutan induk.
5.4.2. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum untuk Analisis
Dibuat spektrum serapan ultraviolet larutan Lansoprazol dengan
konsentrasi 10 µg/mL dalam metanol pada panjang gelombang 200 – 400 nm
menggunakan Spektrofotometer UV-Visibel, ditentukan panjang gelombang
maksimumnya.
5.4.3. Penetapan Fase Gerak
Larutan standar Lansoprazol pada konsentrasi 10 g/mL diinjeksikan
sebanyak 10 µL pada komposisi fase gerak methanol:dapar fosfat pada
perbandingan 70:30, 65:35, dan 60:40 (pH 7) serta perbandingan 65:35
dengan penambahan trietilamin (TEA) sampai pH 7,4 dan kecepatan alir 0,8–
1,2 mL/menit dan dideteksi pada panjang gelombang terpilih, kemudian
dicatat waktu retensi, luas puncak, dihitung jumlah plat teoritis, HETP
(Height Equivalent Theoritical Plate), faktor kapasitas, dan asimetrisitas.
5.4.4. Uji Kesesuaian Sistem
Larutan Lansoprazole pada konsentrasi 10 g/mL diinjeksikan sebanyak
10 L ke alat KCKT dengan fase gerak terpilih, diulangi sebanyak enam kali.
Kemudian dihitung jumlah plat teoritis, HETP (Height Equivalent Theoritical
Plate), faktor kapasitas, asimetrisitas, dan %RSD (Relative Standard
Deviation).

5.4.5. Penetapan Metode Ekstraksi (Evans,1994; Kelly,1990)

Ke dalam tabung sentrifus dimasukkan 1,05 ml darah + 0,1 mL EDTA
10% disentrifugasi selama 10 menit pada 2500 rpm. Kemudian diambil
supernatan (plasma) dan dicampur metanol dengan perbandingan 1:2, 1:3,
dan 1:4 pada tabung sentrifugasi. Kemudian dikocok dengan vorteks selama 1
menit dan disentrifugasi pada 10000 rpm selama 10 menit, lalu supernatan
diinjeksikan sebanyak 10 L ke alat KCKT. Kemudian dianalisis
kromatogram dari masing-masing perbandingan untuk mengetahui kondisi
kromatogram blanko darah.
Kemudian dilakukan hal yang sama terhadap darah yang sudah
mengandung larutan Lansoprazol masing-masing dengan konsentrasi 5 ppm,
3 ppm, dan 1 ppm, kemudian diekstraksi sesuai dengan perbandingan terpilih,
dan diinjeksikan sebanyak 10 L ke alat KCKT kemudian dicatat waktu
retensi dan luas puncaknya.

5.4.6. Validasi Metode Analisis Lansoprazol Dalam Darah (Gandjar & Rohman,
2007; Harmita, 2006; Food Drug and Administration, 2001; United
Nations Office on Drug and Crime, 2009)
5.4.6.1. Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linearitas dalam Darah In Vitro
Dibuat larutan blangko dan larutan Lansoprazol dalam darah dengan
konsentrasi 2-6 g/mL, kemudian dipreparasi sesuai prosedur. Lalu
supernatan masing-masing sebanyak 10 μL disuntikkan ke alat KCKT pada
kondisi terpilih. Setelah itu dianalisis regresi perbandingan luas puncak
terhadap konsentrasi Lansoprazol dalam darah dari masing-masing
konsentrasi dan dibuat kurva kalibrasi dengan persamaan garis regresi linier
(y = a + bx). Dihitung koefisien korelasi (r) dari kurva tersebut.
5.4.6.2. Limit Deteksi (LOD) dan Limit Kuantitasi (LOQ)
Larutan Lansoprazol dalam darah dengan konsentrasi 2-6 g/mL
dipreparasi sesuai prosedur. Kemudian supernatan sebanyak 10 μL dari
masing-masing larutan tersebut disuntikkan ke alat KCKT pada kondisi
terpilih. Setelah itu dianalisis regresi perbandingan luas puncak terhadap
konsentrasi Lansoprazole dalam darah dari masing-masing konsentrasi dan
dibuat kurva kalibrasinya.
LOQ dihitung melalui persamaan garis regresi linier dari kurva kalibrasi,
dengan rumus :
Sy
10 ( )
x
LOQ =
b

sedangkan nilai batas deteksi (LOD) diperoleh dengan rumus :

Sy
3( )
x
LOD =
b

dimana (Sy/x) adalah simpangan baku residual, b adalah slope dari persamaan
regresi.
5.4.6.3. Uji Selektivitas
Sebanyak 10 μL supernatan sampel darah yang telah dideproteinase dan
mengandung Lansoprazol pada konsentrasi 5 μg/mL disuntikkan ke dalam
instrumen KCKT dengan kondisi fase gerak dan kecepatan alir terpilih,
diulang sebanyak 6 kali. Kemudian dihitung nilai % RSD (Relative Standard
Deviation) dengan nilai ≤ 15% dan akurasinya (% diff) dengan nilai ± 15%.
5.4.6.4. Uji Akurasi
Dibuat larutan Lansoprazol dalam darah dengan konsentrasi 3 μg/mL, 4
μg/mL, dan 5 μg/mL. Setelah itu dipreparasi sesuai prosedur. Supernatan
sebanyak 10 μL disuntikkan ke alat KCKT dengan kondisi fase gerak dan
kecepatan alir terpilih, diulangi sebanyak tiga kali. Kemudian dihitung
persentase akurasi (% diff) dan perolehan kembali (% recovery) dari masing-
masing konsentrasi larutan tersebut. Nilai rata-rata % diff disyaratkan ± 15%.
Sedangkan nilai perolehan kembali dihitung dengan cara membandingkan
konsentrasi Lansoprazol dalam darah yang diperoleh dari hasil ekstraksi
dengan konsentrasi Lansoprazol yang sebenarnya dikalikan dengan 100%.
Perolehan kembali disyaratkan pada ± 15% dalam sampel biologis.
5.4.6.5. Uji Presisi
Dibuat larutan Lansoprazol dalam darah dengan konsentrasi 3 μg/mL, 4
μg/mL, dan 5 μg/mL. Setelah itu dipreparasi sesuai prosedur. Supernatan
sebanyak 10 μL disuntikkan ke alat KCKT dengan kondisi fase gerak dan
kecepatan alir terpilih, diulangi sebanyak tiga kali. Dilakukan pengukuran
intra-hari dan inter-hari (selama 2 hari berturut-turut), kemudian dihitung
persentase simpangan baku relatif atau % RSD (Relative Standard Deviation)
dari masing-masing konsentrasi dengan nilai ≤ 15%.
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

9.1. Hasil
9.1.1. Penentuan Metode Analisis Lansoprazol
9.1.1.1.Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan dengan
menggunakan spektrofotometer ultraviolet-visibel, diperoleh serapan
maksimum Lansoprazol pada panjang gelombang 283 nm. Spektrum serapan
Lansoprazol dapat dilihat pada lampiran 1 gambar 6.1.
9.1.1.2. Penetapan Komposisi Fase Gerak
Penetapan kadar Lansoprazol dalam darah in vitro dilakukan pada kondisi
optimum dengan kromatografi cair kinerja tinggi menggunakan kolom
Acclaim® (C18) dengan kecepatan alir 0,8 mL/menit, panjang gelombang 283
nm, dan volume penyuntikan 10 μL Komposisi fase gerak semula terdiri dari
metanol:dapar fosfat pH 7 (70:30). Pada komposisi ini, waktu retensi
Lansoprazol yaitu 2,95 menit. Kemudian dilakukan modifikasi fase gerak
yaitu komposisi kedua metanol-dapar fosfat pH 7 (65:35) dan komposisi
ketiga metanol-dapar fosfat pH 7 (60:40). Pada komposisi metanol-dapar
fosfat pH 7 (65:35) waktu retensi Lansoprazol yaitu 3,67 menit. Sedangkan
pada komposisi metanol-dapar fosfat pH 7 (60:40) waktu retensi Lansoprazol
yaitu 5,04 menit. Laju alir yang digunakan adalah 0,8 ml/menit. Namun hasil
optimasi ini memberikan data kromatogram dengan puncak yang lebar dan
pada komposisi 60:40 dihasilkan double peak.
Kemudian dilakukan modifikasi lagi dengan penambahan TEA
(Trietilamin) dengan komposisi metanol:dapar fosfat (65:35) dengan
penambahan TEA hingga pH 7,4. Dengan komposisi fase gerak ini,
didapatkan waktu retensi sekitar 3,77 menit. Metode ini dipilih karena
menghasilkan plat teoritis yang lebih banyak daripada komposisi fase gerak
yang lain, HETP (Height Equivalent Theoritical Plate) yang lebih kecil,
 25

faktor kapasitas yang memenuhi persyaratan (1-10) serta asimetrisitas yang

baik (<2,5) sebagaimana tercantum tercantum pada tabel 4.1.

Tabel 4.1. Hasil penetapan komposisi fase gerak pada konsentrasi 10 µg/mL,
kecepatan alir 0,8 mL/menit, panjang gelombang 283 nm, dan volume
penyuntikan 10 μL.
Fase Luas
TR Faktor
Gerak Puncak N HETP Asimetri
(menit) Kapasitas
(v/v) (µAU)
65:35 3,773 3592,9 1130 0,0133 1,22 0,86
(+TEA) 3,767 3576,1 1084 0,0138 1,22 0,85
70:30 2,950 7162,2 351 0,0427 0,73 1,62
65:35 3,890 7691,9 303 0,0495 1,24 1,66
60:40 4,997 8172,3 251 0,598 1,92 1,71
Keterangan:

TR = Time Retention (waktu

retensi) N = Plat Teoritis

HETP = Height Equivalent Theoritical Plate

9.1.1.3. Uji Kesesuaian Sistem

Pada uji kesesuaian sistem terdapat parameter-parameter untuk
menetapkan kesesuaian sistem sebelum analisis, yaitu meliputi plat teoritis
(N), resolusi atau daya pisah, dan nilai koefisien variasi dari luas area dari
serangkaian injeksi (minimal 6 kali injeksi). Syarat utama adalah %RSD
(Relative Standard Deviation) dari luas area, yaitu ≤ 2%. Uji kesesuaian
sistem yang dilakukan telah memenuhi persyaratan yang ditetapkan, kecuali
parameter plat teoritis (N). Data mengenai uji kesesuaian sistem terdapat pada
tabel 4.2 dan data selengkapnya tercantum dalam lampiran 4 tabel 6.1.

Tabel 4.2. Hasil uji rata-rata kesesuaian sistem sampel Lansoprazol pada
konsentrasi 10 μg/mL dengan komposisi fase gerak metanol:dapar fosfat (65:35)
dengan penambahan TEA hingga pH 7,4 pada kecepatan alir 0,8 mL/menit,
panjang gelombang 283 nm dan volume penyuntikan 10 μL.

Parameter Uji Persyaratan Hasil Uji Rata-rata

Plat Teoritis >2500 1091,67
Asimetris <2,5 0,88
Faktor Kapasitas 1-10 1,22
%RSD (Relative Standard Deviation) ≤2% 0,576
 26

9.1.1.4. Penetapan Metode Ekstraksi

Penetapan metode ekstraksi pada awalnya dilakukan penambahan EDTA
10% pada darah untuk memperoleh plasma. Kemudian dilakukan modifikasi
metode ekstraksi dengan mengendapkan protein darah sekaligus menarik
Lansoprazol, dari hasil percobaan didapatkan bahwa pelarut yang baik
digunakan adalah metanol dengan perbandingan 1 bagian supernatan
(plasma) dan 4 bagian metanol dalam 1,5 mL, dikarenakan pada
perbandingan tersebut tidak terdapat interferen pada waktu retensi
Lansoprazol. Kemudian dilakukan pengukuran untuk darah yang telah
mengandung Lansoprazol dengan konsentrasi 5 µg/ml, 3 µg/ml, dan 1 µg/ml.
Data mengenai penetapan pelarut pengendap protein plasma (pelarut
ekstraksi) terdapat pada tabel 4.3.
Tabel 4.3. Hasil penetapan pelarut pengendap protein plasma

Pengendap Kosentrasi Waktu Retensi Luas Puncak Faktor

Protein (µg/ml) (menit) (µAU) kapasitas
5 3,833 1626,4 1,22
Metanol 3 3,826 714,1 1,23
1 - - -

9.1.2. Validasi Metode Analisis dalam Darah secara In Vitro

9.1.2.1.Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linearitas dalam Darah in vitro
Uji ini dilakukan pada seri larutan standar Lansoprazol dalam darah
dengan konsentrasi 2-6 μg/mL, dari uji ini akan didapat persamaan regresi
linier dan koefisien korelasi (r). Hasil uji diperoleh persamaan garis y =
477,35x - 776,42, dan koefisien korelasi (r) 0,9875, kurva kalibrasi dari
persamaan garis tersebut terdapat dalam gambar 4.1. Data hasil percobaan
selengkapnya tercantum pada lampiran 5 dalam tabel 6.2.
 27

9.1.2.2. Uji Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi dalam Darah in vitro
Uji batas deteksi dan batas kuantitasi dilakukan untuk mengetahui batas
deteksi dan batas kuantitasi terendah dari sampel yang masih dapat
menghasilkan data dengan akurasi dan presisi yang baik. Batas deteksi yang
diperoleh dari hasil pengujian sebesar 0,619 μg/mL dan batas kuantitasi 2,05
μg/mL. Data mengenai uji batas deteksi dan batas kuantitasi dapat dilihat
pada tabel 4.4 dan data hasil percobaan selengkapnya tercantum pada
lampiran 6 dalam tabel 6.3.
Tabel 4.4. Hasil uji batas deteksi, batas kuantitasi dan koefisien fungsi

Parameter Nilai
Simpangan Baku Residual (S y/x) 98,17
Limit Deteksi (LOD) 0,619 μg/mL
Limit Kuantitasi (LOQ) 2,05 μg/mL

9.1.2.3. Uji Selektivitas

Uji selektivitas dilakukan terhadap sampel konsentrasi 5 μg/mL dilakukan
sebanyak 6 kali untuk mengetahui spesifitas metode tersebut. Syarat untuk uji
selektivitas adalah %RSD (Relative Standard Deviation) dengan nilai ≤ 15%
dan akurasinya (% diff) dengan nilai ± 15%. Data hasil uji rata-rata terdapat
pada tabel 4.5 dan Data hasil percobaan tercantum pada lampiran 7 dalam
tabel 6.4.
 28

Tabel 4.5. Hasil uji rata-rata selektivitas

C Rata-rata Luas SD RSD % diff

(μg/mL) Puncak (µAU) (%) rata-rata
5 1630,92 13,26 0,813 -0,793
Keterangan:

C = Konsentrasi

SD = Simpangan Baku
KV = Koefisien Variasi

9.1.2.4. Uji Akurasi

Uji akurasi dilakukan pada 3 konsentrasi sampel, yaitu pada 3 μg/mL, 4
μg/mL dan 5 μg/mL dilakukan sebanyak 3 kali untuk masing-masing
konsentrasi. Syarat hasil uji akurasi adalah % diff dengan nilai ≤ 15%.
Kemudian dihitung pula nilai perolehan kembali (% recovery), nilai ini
disyaratkan pada ≤ 15% dalam sediaan biologis. Hasil uji rata-rata dapat
dilihat pada tabel 4.6 dan data hasil percobaan selengkapnya tercantum pada
lampiran 8 dalam tabel 6.6.

Tabel 4.6. Hasil uji rata-rata akurasi

Rata-rata Rata-rata
C SD RSD % diff
Luas Puncak Perolehan
(μg/mL) (%) rata-rata
(µAU) Kembali (%)
3 714,3 104,09 8,57 1,2 4,09
4 1231,5 105,16 2,89 0,24 5,16
5 1636,27 101,09 18,1 1,11 1,09

9.1.2.5. Uji Presisi

Uji dilakukan pada 3 konsentrasi sampel, yaitu pada 3 μg/mL, 4 μg/mL
dan 5 μg/mL diulangi sebanyak 3 kali untuk masing-masing konsentrasi,
dilakukan pada pengujian intra-hari (dalam 1 hari) dan inter-hari selama 2
hari berturut-turut. Syarat hasil uji presisi adalah simpangan baku relatif atau
%RSD (Relative Standard Deviation) dari masing-masing konsentrasi dengan
nilai ≤ 15%. Hasil uji rata-rata presisi dapat dilihat pada tabel 4.7 dan 4.8
serta data hasil percobaan selengkapnya tercantum pada lampiran 9 dalam
tabel 6.7.
 29

Tabel 4.7. Hasil uji rata-rata presisi H-1 (intra day)

C Rata-rata Luas RSD

SD % diff rata-rata
(μg/mL) Puncak (µAU) (%)
3 714,3 8,57 1,2 4,09
4 1231,5 2,89 0,24 5,16
5 1636,27 18,1 1,11 1,09

Tabel 4.8. Hasil uji rata-rata presisi H-2 (inter day)

C Rata-rata Luas RSD

SD % diff rata-rata
(μg/mL) Puncak (µAU) (%)
3 710,83 9,35 1,31 3,85
4 1205,47 5,8 0,48 3,79
5 1612,73 12,45 0,77 0,1

9.2. Pembahasan
Pada penelitian ini telah dilakukan validasi metode analisis Lansoprazol
dalam darah in vitro secara KCKT. Penetapan kadar Lansoprazol dalam darah
in vitro dilakukan sebagai pengujian terhadap sediaan farmasi dari segi
farmakokinetiknya, bagaimana ketersediaan hayati obat dalam tubuh
sehingga keefektivitasannya terbukti. Optimasi dan validasi juga perlu
dilakukan guna mendapatkan metode yang terbaik untuk analisa kadar
Lansoprazol dalam darah. Metode analisis dengan menggunakan alat KCKT
ini dipilih karena memiliki banyak kelebihan yaitu waktu analisisnya cepat,
cara kerjanya sederhana dan sensitif.
Sebelum memasuki tahap analisis, perlu dilakukan penentuan panjang
gelombang analisis optimum dengan menggunakan spektrofotometer
ultraviolet–visibel dan didapatkan hasil bahwa Lansoprazol memiliki serapan
maksimum pada 283 nm. Pemilihan panjang gelombang analisis ini berguna
untuk meningkatkan selektivitas dan sensitifitas analisis dari sampel yang
digunakan.
Tahap selanjutnya adalah penentuan komposisi fase gerak dan laju alir.
Pada pemilihan fase gerak, dilakukan dengan menggunakan kolom Acclaim ®.
Optimasi fase gerak semula terdiri dari metanol:dapar fosfat pH 7 dengan
 30

komposisi (70:30), (65:35), dan (60:40). Pada komposisi metanol-dapar fosfat

pH 7 (70:30) waktu retensi Lansoprazol yaitu 2,95 menit, dan pada komposisi
(65:35) waktu retensinya 3,67 menit. Sedangkan pada komposisi (60:40)
waktu retensi Lansoprazol yaitu 5,04 menit. Laju alir yang digunakan adalah
0,8 ml/menit. Namun hasil optimasi ini memberikan data kromatogram
dengan puncak yang lebar dan pada komposisi 60:40 dihasilkan double peak.
Kemudian dilakukan modifikasi lagi dengan penambahan TEA (Trietilamin)
dengan komposisi metanol:dapar fosfat (65:35) dengan penambahan TEA
hingga pH 7,4 dan laju alir sebesar 0,8 ml/menit. Dengan komposisi fase
gerak ini, didapatkan waktu retensi sekitar 3,77 menit dengan plat teoritis
sekitar 1130 (>2500), HETP (Height Equivalent Theoritical Plate) sekitar
0,0133, faktor kapasitas sebesar 1,22 (1-10) serta faktor asimetris sekitar 0,86
(<2,5). Dari hasil ini, fase gerak yang ditetapkan telah memberikan hasil
parameter yang memenuhi persyaratan, kecuali untuk parameter plat teoritis
yang kurang dari kondisi ideal yaitu >2500.
Uji kesesuaian sistem dilakukan untuk memastikan kesesuaian dan
keefektifan sistem yang digunakan agar diperoleh kondisi operasional dan
kromatogram yang baik. Dari hasil percobaan diperoleh nilai rata-rata, yaitu
jumlah plat teoritis 1091,67 (>2500), faktor kapasitas 1,22 (1-10), asimetris
0,88 (<2,5), dan koefisien variasi 0,576% (<2%).
Pada penetapan metode ekstraksi, awalnya dilakukan penambahan EDTA
pada darah untuk memperoleh plasma. Kemudian dilakukan metode
pengandapan protein menggunakan pelarut organik yaitu metanol.
Pengendapan protein ini bertujuan untuk menghilangkan komponen-
komponen yang ada dalam protein plasma yang dapat mengganggu analisis
dan kromatogram. Protein plasma dapat diendapkan dengan berbagai pelarut;
seperti pelarut organik, pelarut asam, dan pelarut basa. Pada penelitian ini
dilakukan dengan pelarut organik yang akan mengendapkan protein sehingga
obat akan lepas dari ikatan protein dan tertarik ke dalam pelarut organik.
Hasil yang didapatkan pelarut organik yang digunakan adalah metanol
dengan perbandingan 1:4 dengan plasma darah yang memberikan
 31

kromatogram yang lebih baik daripada perbandingan 1:2 maupun 1:3,

didasarkan pada tidak adanya interferen pada waktu retensi Lansoprazol.
Validasi metode penetapan kadar Lansoprazol dalam darah in vitro
dilakukan dengan tujuan untuk memastikan bahwa metode tersebut akurat
dan dapat digunakan sebagai metode penetapan kadar secara in vivo. Validasi
metode yang dilakukan adalah validasi sebagian dengan mempertimbangkan
bahwa metode yang dilakukan pada penelitian ini merupakan modifikasi dari
metode yang telah dilakukan sebelumnya. Parameter validasi yang dilakukan
meliputi liniearitas, limit deteksi dan limit kuantitasi, selektivitas, akurasi,
presisi, dan perolehan kembali.
Liniearitas merupakan kemampuan metode analisis yang memberikan
respon yang secara langsung proporsional terhadap konsentrasi analit dalam
sampel. Dari percobaan dibuat larutan standar Lansoprazol dalam darah
dengan rentang konsentrasi 2-6 µg/mL, dan didapat hasil persamaan garis
regresi linier y = 477,35x - 776,42, dan koefisien korelasi (r) 0,975.
Langkah selanjutnya adalah penetapan batas deteksi dan batas kuantitasi
dari sampel. Batas deteksi merupakan jumlah terkecil analit dalam sampel
yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibanding
dengan blangko. Sedangkan batas kuantitasi merupakan kuantitas terkecil
analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria akurat dan seksama.
Hasil dari uji batas deteksi ini adalah 0,619 μg/mL dan batas kuantitasi
sebesar 2,05 μg/mL.
Uji selektivitas dilakukan untuk mengetahui bahwa metode yang
ditetapkan kemampuannya hanya untuk mengukur zat tertentu saja dengan
cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam
matriks sampel. Uji ini dilakukan terhadap sampel dengan konsentrasi 5
μg/mL. Persyaratan untuk uji selektivitas ini adalah nilai koefisien variasinya
(KV) dengan nilai ≤ 15% dan akurasinya (% diff) dengan nilai ± 15%. Hasil
pengujian selektivitas pada sampel adalah %RSD (Relative Standard
Deviation) sebesar 0,813% dan % diff sebesar 0,793%, hasil ini telah
memenuhi persyaratan untuk uji selektivitas.
 32

Uji akurasi dilakukan untuk mengetahui kedekatan hasil penetapan yang

diperoleh dengan hasil sebenarnya. Akurasi diperiksa dengan menghitung
perbedaan nilai yang terukur dengan nilai sebenarnya (% diff) Uji akurasi
dilakukan dengan menetapkan kadar sampel pada 3 konsentrasi yaitu 3
µg/mL, 4 µg/mL, dan 5 µg/mL. Persyaratan yang ditentukan adalah % diff ±
15%. Pada konsentrasi 3 μg/mL didapatkan hasil % diff rata-rata sebesar -
4,09%, konsentrasi 4 μg/mL didapatkan % diff rata-rata sebesar 5,16% dan
pada konsentrasi 5 μg/mL didapatkan % diff rata-rata sebesar 1,09%.
Kemudian dihitung pula nilai perolehan kembalinya (% recovery) dengan
cara membandingkan konsentrasi Lansoprazol dalam darah yang diperoleh
dari hasil ekstraksi dengan konsentrasi Lansoprazol yang sebenarnya
dikalikan dengan 100%. Perolehan kembali disyaratkan pada ± 15% dalam
sediaan biologis. Nilai uji perolehan kembali pada konsentrasi 3 μg/mL
berkisar 104,09%, konsentrasi 4 μg/mL berkisar 105,16% dan pada
konsentrasi 5 μg/mL sekitar 101,09%. Pengujian perolehan kembali ini
dilakukan pada tiga konsentrasi dengan tujuan untuk memberikan batas range
bahwa konsentrasi analit yang terukur pada daerah tersebut masih terukur
dengan baik oleh detektor. Hasil untuk uji akurasi dan perolehan kembali ini
telah memenuhi persyaratan uji pada sediaan biologis.
Presisi adalah ukuran yang menunjukan derajat kesesuaian antara hasil uji
individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika
prosedur diterapkan secara berulang pada sampel. Uji presisi dilakukan intra-
hari dan inter-hari, pada pengujian intra-hari, konsentrasi rendah 3 μg/mL
didapat %RSD (Relative Standard Deviation) sebesar 1,2%, pada konsentrasi
sedang 4 μg/mL diperoleh %RSD (Relative Standard Deviation) sebesar
0,24% dan pada konsentrasi tinggi 5 μg/mL didapat %RSD (Relative
Standard Deviation) sebesar 1,11%. Sedangkan pada pengujian inter-hari,
konsentrasi rendah 3 μg/mL didapat %RSD (Relative Standard Deviation)
sebesar 1,31%, pada konsentrasi sedang 4 μg/mL diperoleh %RSD (Relative
Standard Deviation) sebesar 0,48% dan pada konsentrasi tinggi 5 μg/mL
didapat %RSD (Relative Standard Deviation) sebesar 0,77%. Pengukuran
inter-hari yang dilakukan selama 2 hari berturut-turut didapat hasil %RSD
 33

(Relative Standard Deviation) ≤ 15%. Pada uji presisi ini, hasil tersebut telah
memenuhi syarat untuk uji presisi pada sediaan biologis. Uji dilakukan pada
intra-hari dan inter-hari untuk memastikan bahwa setelah sediaan disimpan
masih stabil dan tidak mengganggu hasil analisa.
Hasil dari parameter-parameter validasi metode analisis yang telah
dilakukan secara keseluruhan telah memenuhi persyaratan yang ditetapkan
untuk pengujian pada sediaan biologis. Hal ini menunjukan bahwa metode
analisis Lansoprazol dalam darah in vitro valid dan dapat digunakan untuk
penetapan kadarnya secara in vivo.
 BAB 5
KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan
5.1.1. Optimasi metode analisis Lansoprazol diperoleh hasil bahwa Lansoprazol
dapat dianalisis dengan menggunakan kolom Acclaim® Polar Advantage
C18, dengan kondisi optimum fase gerak metanol:dapar fosfat (65:35)
dengan penambahan trietilamin hingga pH 7,4, kecepatan alir 0,8
mL/menit, panjang gelombang 283 nm. Pada proses optimasi ekstraksi
Lansoprazol dalam darah, hasil ekstraksi terbaik untuk metode analisis
pada KCKT adalah dengan pencampuran plasma dengan metanol pada
perbandingan 1:4, waktu vorteks 60 detik dan proses sentrifugasi pada
kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit.
5.1.2. Hasil validasi metode menunjukkan bahwa metode analisis yang
digunakan sudah memenuhi persyaratan yang berlaku untuk akurasi,
presisi, linearitas, dan selektifitas.

5.2 Saran
Untuk penelitian selanjutnya, disarankan untuk dapat menggunakan
larutan pengendap protein yang lain, seperti asam trikloroasetat, asam
perklorat, maupun kombinasi asam-asam tersebut dengan pelarut organik
sehingga diharapkan hasil ekstraksi protein dari plasma menjadi lebih
sempurna. Bila memungkinkan dapat pula digunakan cara ekstraksi protein
dalam plasma yang lain seperti ekstraksi cair-cair maupun ekstraksi cair-
padat.
 DAFTAR PUSTAKA

American Pharmacists Association (APhA). 2008. Drug Information Handbook

17th Edition. Ohio : Lexi-Comp.

Anonim. 2000. PREVACID®. http://www.drugbank.ca/system/fda_labels/

DB00448.pdf?1265922801. Diakses pada hari Senin, 2 Juli 2012 pukul 08.12.

A. Avgerinos, et al.. 1998. Determination of Lansoprazole in Biological Fluids and

Pharmaceutical Dosage by HPLC. European Journal of Drug Metabolism and
Pharmacokinetics, Vol. 23, No. 2, 1998, pp. 329-332.

Evans, G (Ed.). 2004. A Handbook of Bioanalysis and Drug Metabolism. USA:

CRC Press.

Food and Drug Administration. 2001. Bioanalytical Method Validation.

Rockville: Center for Veterinary Medicine.

Gandjar, I. G. dan Abdul Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta:

Pustaka Pelajar.

Gerald K. McEvoy (Ed.), Jane Miller (Ed.), dan Kathy Litvak (Ed.). 2004. AHFS
Drug Information 2004. American Society of Health-System Pharmacists.

Harahap, Y. (2010). Peran Bioanalisis dalam Penjaminan Kualitas Obat dan

Peningkatan Kualitas Hidup Pasien. Depok: UI Press.

Harmita. 2006. Analisis Fisikokimia. Departemen Farmasi FMIPA UI.

Johnson, E.L. dan R.Stevenson. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Terj. Kosasih
Padmawinata. Bandung: Penerbit ITB Press.

Karol, M.D., et al.. 1995. Determination of lansoprazole and five metabolites in

plasma by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B Biomed
Appl, 1995; 668:182-6.

Katsuki, H., et al.. 2001. High-Performance Liquid Chromatographic Assay for

the Simultaneous Determination of Lansoprazole Enantiomers and Metabolites in
Human Liver Microsomes. Journal of Chromatography B, Vol. 757, No. 1, pp.
127-133.

Kelly, M.T. 1992. Drug Analysis in Biological Fluids. Dalam: Chemical Analysis in
Complex Matrices. New York: Ellis Horwood.

Lunn, G. 1999. HPLC Methods for Pharmaceutical Analysis, Volume 3: E – O. New

York : Wiley-Interscience.

McEvoy, Gerald K. (ed.). 2008. AHFS Drug Information 2008. Bethesda, MD:
American Society of Health-System Pharmacists.

Meyer, Veronika R.. 2010. Practical High-Performance Liquid Chromatography

5th Edition. Chichester : Wiley.

Noubarani, M. et al.. 2010. Improved HPLC Method for Determination of Four

PPIs, Omeprazole, Pantoprazole, Lansoprazole and Rabeprazole in Human
Plasma. J Pharm Pharmaceut Sci, 13(1), hal 1-10.

Pudjiadi, Anna. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta : UI Press. Hal. 209-210

Reddy. Battu, P. dan Venkateswara Reddy. G. 2009. Validation and Stability of
RP-HPLC for The Determination of Lansoprazole in Tablet Dosage Form and
Human Plasma. The Pharma Research, vol. 1, hal 60-66.
Sweetman, Sean C. 2009. Martindale The Complete Drug Reference 36th edition.

London: The Pharmaceutical Press, 1739-1740.

Shargel, L. dan Andrew B.C.Yu. 1988. Biofarmasetika dan Farmakokinetika

Terapan. Terj. Siti Sjamsiah. Surabaya: Universitas Airlangga Press.

Sherwood, Lauralee. 1996. Fisiologi Manusia Dari Sel ke Sistem edisi kedua. Terj.
Brahm U. Pendit. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC. Hal: 346-363

Supandi. 2008. Optimasi dan Validasi Metode Penetapan Kadar Famotidin

Kombinasi dengan Magnesium Hidroksida, Hidrotalcite dan Simetikon dalam
Plasma in vitro dan in vivo secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Tesis.
Program Pasca Sarjana FMIPA-Universitas Indonesia. Tidak dipublikasikan: 101
hlm

United Nation Office on Drug and Crime. 2009. Guidance for the Validation of
Analytical Methodology and Calibration of Equipment used for Testing of Illicit
Drugs in Seized Materials and Biological Specimens. Vienna: United Nations
Publication.

Uno, T., et al.. 2005. Determination of Lansoprazole and Two of its Metabolites
by Liquid-Liquid Extraction and Auto-mated Column Switching High-
Performance Liquid Chromatography: Application to Measuring CYP2C19
Activity. Journal of Chromatography B, Vol. 816, No. 1-2, February 2005, pp.
309-314.
 DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Penetapan Panjang Gelombang Serapan Maksimum

Gambar 6.1 Spektrum panjang gelombang maksimum Lansoprazol dalam

metanol pada konsentrasi 10 μg/mL.
Lampiran 2. Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Gambar 6.2. Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dionex Ultimate® 3000
Lampiran 3. Kromatogram Hasil Analisa

Gambar 6.3 Kromatogram Lansoprazol murni pada konsentrasi 50 µg/mL

dengan komposisi fase gerak metanol:dapar fosfat (65:35) dengan penambahan
TEA hingga pH 7,4 pada kecepatan alir 0,8 mL/menit, panjang gelombang 283
nm dan volume penyuntikan 10 μL.

Gambar 6.4. Kromatogram Lansoprazol dengan fase gerak metanol : dapar

fosfat pH 7 (70:30)
 Lanjutan

Gambar 6.5. Kromatogram Lansoprazol dengan fase gerak metanol : dapar fosfat
pH 7 (65:35)

Gambar 6.6. Kromatogram Lansoprazol dengan fase gerak metanol : dapar fosfat
pH 7 (60:40)
 Lanjutan

Gambar 6.7. Kromatogram Lansoprazol murni pada konsentrasi 10 µg/mL

dengan komposisi fase gerak metanol:dapar fosfat (65:35) dengan penambahan
TEA hingga pH 7,4 pada kecepatan alir 0,8 mL/menit, panjang gelombang 283
nm dan volume penyuntikan 10 μL.
 Lanjutan

Gambar 6.8. Kromatogram sampel darah kosong (blanko) dengan komposisi fase
gerak metanol:dapar fosfat (65:35) dengan penambahan TEA hingga pH 7,4 pada
kecepatan alir 0,8 mL/menit, panjang gelombang 283 nm dan volume penyuntikan
10 μL.
 Lanjutan

Gambar 6.9. Kromatogram Lansoprazol dalam sampel darah pada konsentrasi 5

µg/mL dengan komposisi komposisi fase gerak metanol:dapar fosfat (65:35)
dengan penambahan TEA hingga pH 7,4 pada kecepatan alir 0,8 mL/menit,
panjang gelombang 283 nm dan volume penyuntikan 10 μL.
 Lanjutan

Gambar 6.7. Kromatogram Lansoprazol murni pada konsentrasi 10 µg/mL

dengan komposisi fase gerak metanol:dapar fosfat (65:35) dengan penambahan
TEA hingga pH 7,4 pada kecepatan alir 0,8 mL/menit, panjang gelombang 283
nm dan volume penyuntikan 10 μL.
 Lanjutan

Gambar 6.8. Kromatogram sampel darah kosong (blanko) dengan komposisi fase
gerak metanol:dapar fosfat (65:35) dengan penambahan TEA hingga pH 7,4 pada
kecepatan alir 0,8 mL/menit, panjang gelombang 283 nm dan volume penyuntikan
10 μL.
 Lanjutan

Gambar 6.9. Kromatogram Lansoprazol dalam sampel darah pada konsentrasi 5

µg/mL dengan komposisi komposisi fase gerak metanol:dapar fosfat (65:35)
dengan penambahan TEA hingga pH 7,4 pada kecepatan alir 0,8 mL/menit,
panjang gelombang 283 nm dan volume penyuntikan 10 μL.
Lampiran 4. Uji Kesesuaian Sistem

Tabel 6.1. Uji kesesuaian sistem Lansoprazol dengan fase gerak metanol:dapar
fosfat (65:35) dengan penambahan TEA hingga pH 7,4 pada konsentrasi 10
µg/mL, kecepatan alir 0,8 mL/menit, panjang gelombang 283 nm, dan volume
penyuntikan 10 μL.

Waktu Luas Plat Koefisien

Faktor
Retensi Area Teoritis HETP Asimetri Variasi
Kapasitas
(menit) (µAU) (N) (%)
3,773 3592,9 1130 0,0133 1,21 0,86
3,767 3576,1 1084 0,0138 1,22 0,85
3,770 3600,3 1133 0,0132 1,22 0,84
3,780 3582,1 1104 0,0135 1,23 0,89 0,576
3,769 3569,2 1064 0,0141 1,23 0,92
3,777 3541,8 1035 0,0145 1,21 0,90

Hasil Parameter Uji:

Plat Teoritis (>2500) : 1091,67
Asimetris (<2,5) : 0,88
Faktor Kapasitas (1-10) : 1,22
Koefisien Variasi (<2%) : 0,576
Lampiran 5. Uji Liniearitas dan Pembuatan Kurva Kalibrasi Lansprazol dalam
sampel darah.

Tabel 6.2. Data hasil uji liniearitas

Konsentrasi Luas Puncak

(μg/mL) (µAU)
2 80,7
3 714,1
4 1232,4
5 1626,4
6 2011,3

Kurva Kalibrasi Lansoprazol dalam Darah

2500
Luas Area (µAU)

2000

1500

0 1 2 3 4 5 6 7
Konsentrasi (μg/mL)
Gambar 6.10. Kurva Kalibrasi Lansoprazol dalam

Darah Keterangan :
- Persamaan garis : y = 477,35x - 776,42
- Koefisien korelasi : 0,99
- Kondisi Analisis :
Fase gerak : metanol:dapar fosfat (65:35) dengan penambahan TEA hingga
pH 7,4
Kolom : Acclaim® (C18; 15 cm x 4,6 mm)
Volume injeksi : 10 μL
Kecepatan alir : 0,8 mL/menit
Detektor : Diode Array Detector

Panjang Gelombang : 283 nm

Lampiran 6. Uji Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi

Tabel 6.3. Data hasil uji batas deteksi dan batas kuantitasi

Luas Luas Area

Konsentrasi Puncak Berdasarkan
[Y-Y1] [Y-Y1]2
(μg/mL) (µAU) Persamaan
[Y] Regresi [Y1]
2 80,7 178,28 -97,58 9521,8564
3 714,1 655,63 58,47 3418,7409
4 1232,4 1132,98 99,42 9884,3364
5 1626,4 1610,33 16,07 258,2449
6 2011,3 2087,68 -76,38 5833,9044
Jumlah 28917,083

S (y/x) =
28917,083
√∑(F−F1) =√ = 98,17
3
𝑛−2

3 (𝑆𝑦/𝑥)
LOD = 3 (98,17) = 0,619 μg/mL
𝑏 =
477,35
 10 (𝑆𝑦/𝑥)
LOQ =
𝑏
 10 (98,17)
= = 2,05 μg/mL
477,35
 Luas % diff
Konsentrasi Simpangan RSD
Puncak % diff rata-
(μg/mL) Baku (SD) (%)
(µAU) rata
1636,4 1,09
1654,3 1,84
1618,1 -0,09
5 1630,2 0,83 13,26 0,813 0,793
1626,4 0,67
1620,1 0,41
 Lampiran 8. Uji Akurasi

Tabel 6.5. Data hasil uji akurasi

Rata-rata
Uji
Luas Uji %diff
Konsentrasi Perolehan Simpangan
Puncak Perolehan % diff RSD (%) rata-
(μg/mL) Kembali Baku (SD)
(µAU) Kembali rata
(%)
(%)
723,2 104,72 4,72
3 706,1 103,52 104,09 3,52 8,57 1,2 4,09
723,7 104,06 4,06
1233,9 105,28 5,28
4 1232,4 105,21 105,16 5,21 2,89 0,24 5,16
1228,3 104,99 4,99
1636,4 101,09 1,09
5 1654,3 101,84 101,09 1,84 18,1 1,11 1,09
1618,1 100,32 0,32
 Lampiran 9. Uji Presisi

Tabel 6.6. Data hasil uji presisi

Konsentrasi Luas Puncak Simpangan

% diff RSD (%) % diff rata-rata
(μg/mL) (µAU) Baku (SD)
723,2 4,72
Hari ke-1 706,1 3,52 8,57 1,2 4,09
723,7 4,06
3 717,2 4,29
Hari ke-2 700,1 3,10 9,35 1,31 3,85
715,0 4,16
1233,9 5,28
Hari ke-1 1232,4 5,21 2,89 0,24 5,16
1228,3 4,99
4 1200,2 3,52
Hari ke-2 1204,5 3,74 5,8 0,48 3,79
1211,7 4,12
1636,4 1,09
Hari ke-1 1654,3 1,84 18,1 1,11 1,09
1618,1 0,32
5 1612,9 0,11
Hari ke-2 1625,1 0,62 12,45 0,77 0,1
1600,2 -0,44
Lampiran 10. Perhitungan konsentrasi Lansoprazol dalam darah

Konsentrasi awal = 201 mg dalam 100 mL metanol

= 201 ppm

Konsentrasi untuk larutan induk 100 ppm

→ 24,875 mL Lansoprazol 201 ppm dimasukkan dalam labu ukur 50 mL,
kemudian dicukupkan dengan metanol hingga tanda batas.

V1 x C1 = V2 x C2
V1 x 201 = 50 mL x 100 ppm
ppm
V1 = 5000/201
= 24,875 Ml

Dari larutan induk 100 ppm, kemudian diambil beberapa mL dan dicukupkan
dengan darah hingga batas ukur pada labu ukur 5 mL sehingga menjadi darah
yang mengandung 1 ppm, 2 ppm, 3 ppm, 4 ppm, 5 ppm, dan 6 ppm Lansoprazol.

Contoh untuk darah yang mengandung 6 ppm Lansoprazol:

V1 x C 1 = V2 x C 2
V1 x 100 ppm = 5 mL x 6 ppm
V1 = 30/100
= 0,3 mL
Lampiran 11. Cara perhitungan Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi

2
S(y/x) = √∑(F−F1) ; = a +bx
dimana Y
1
𝑛−2

𝑦
𝑆( )
Sx0 = 𝑥
; Sx0 = standar deviasi dari fungsi

Vx0 = 𝑆𝑥0 𝑥 100% ; Vx0 = koefisien variasi dari fungsi

𝑥̅

3 (𝑆𝑦/𝑥)
LOD =
𝑏

10 (𝑆𝑦/𝑥)
LOQ =
𝑏
Lampiran 12. Cara perhitungan Simpangan Baku, Koefisien Variasi, % diff, dan
Uji Perolehan Kembali

a. Simpangan Baku (SD),

Hasil analisis adalah x1, x2, x3, x4,……………….xn, maka simpangan bakunya
adalah :

∑(𝑥−𝑥̅)2
SD = √
𝑛−1

Contoh perhitungan:
(1233,9−1231,53)2+(1232,4−1231,53)2+(1228,3−1231,53)2
SD = √
2

SD = 2,898

b. Simpangan baku relatif (%RSD) atau koefisien variasi (KV) adalah :

%RSD = 𝑆𝐷 𝑥 100%
𝑥̅

Contoh perhitungan :
2,898
%RSD = 𝑥 100%
1231,53

%RSD = 0,235%

c. Persen (%) diff = 𝐵−𝐴 𝑥 100%

𝐴

d. Uji Perolehan Kembali = 𝐵 𝑥 100%

𝐴

Keterangan: A : Kadar sebenarnya

B : Kadar terukur
𝑥̅ : Jumlah rata-rata