PROPOSAL DISERTASI

PENGARUH KOMBINASI KURKUMIN (CURCUMA LONGA) DAN MENIRAN

(PHYLLANTUS NIRURI) TERHADAP APOPTOSIS
(CASPASE-3, P53, SURVIVIN) DAN PROLIFERASI (NF- κΒ)
PADA SEL PUNCA KANKER PAYUDARA (CD 44+/CD 24-)
MDA-MB231 IN VITRO

DEDY HERMANSYAH
NIM: 188102004

PROGRAM STUDI DOKTOR (S3) ILMU KEDOKTERAN

FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
2020
 DAFTAR ISI

Halaman
DAFTAR ISI ..................................................................................................... i
DAFTAR TABEL ............................................................................................ iii
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ iv
DAFTAR SINGKATAN .................................................................................. v

BAB I PENDAHULUAN ........................................................................... 1

1.1. Latar Belakang ....................................................................... 1
1.2. Rumusan Masalah .................................................................. 5
1.3. Tujuan Penelitian ................................................................... 6
1.3.1. Tujuan Umum ............................................................. 6
1.3.2. Tujuan Khusus ............................................................ 6
1.4. Manfaat Penelitian ................................................................. 6
1.4.1. Manfaat Teoritik ......................................................... 6
1.4.2. Manfaat Metodologik.................................................. 7
1.4.3. Manfaat Aplikatif ........................................................ 7
1.5. Potensi Orisinalitas ................................................................. 7
1.6. Potensi Hak Atas Kekayaan Intelektual.................................. 8

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ................................................................. 9

2.1. Kanker Payudara. .................................................................... 9
2.1.1. Defenisi ...................................................................... 9
2.1.2. Epidemiologi ............................................................... 9
2.1.3. Klasifikasi ................................................................... 10
2.1.4. Patogenesis ................................................................. 13
2.1.5. Penatalaksanaan .......................................................... 15
2.2. Cell Line Kanker Payudara .................................................... 16
2.2.1. MDA-MB 231 Cell Line ............................................. 16
2.2.2. MCF-7 Cell Line ........................................................ 18
2.3. Sel Punca Kanker Payudara .................................................... 19
2.3.1. Asal Usul Sel Punca Kanker Payudara ....................... 24
2.3.2. Jalur Sinyal Sel Punca Kanker Payudara ................... 26
2.3.2.1. Jalur Sinyal Notch .......................................... 26
2.3.2.2. Jalur Sinyal Wnt ............................................. 30
2.3.2.3. Jalur Sinyal Hedgehog (Hh) .......................... 33
2.4. Kurkumin ............................................................................... 35
2.4.1. Peran Kurkumin terhadap Kanker ............................. 38
2.4.2. Peran Kurkumin terhadap Apoptosis ......................... 39
2.4.3. Peran Kurkumin terhadap Sel Punca ......................... 44
2.5. Meniran ................................................................................... 46
2.5.1. Peran Meniran terhadap Kanker ................................. 49
2.5.2. Peran Meniran terhadap Apoptosis ............................ 51
2.6. Kombinasi Terapi Induksi Apoptosis .................................... 53
2.7. Kerangka Teori ...................................................................... 57
2.8. Kerangka Konsep ................................................................... 59
2.9. Hipotesis ................................................................................ 59

i
 2.9.1. Hipotesis Mayor ......................................................... 59
2.9.2. Hipotesis Minor ......................................................... 59

BAB III METODE PENELITIAN .............................................................. 61

3.1. Desain Penelitian .................................................................... 61
3.2. Tempat dan Waktu Penelitian ................................................. 62
3.2.1. Tempat Penelitian ....................................................... 62
3.2.2. Waktu Penelitian ......................................................... 62
3.3. Poppulasi dan Sampel Penelitian ........................................... 62
3.3.1. Populasi ....................................................................... 62
3.3.2. Sampel......................................................................... 62
3.4. Kriteria ................................................................................... 62
3.4.1. Kriteria Inklusi ............................................................ 62
3.4.2. Kriteria Ekslusi ........................................................... 63
3.5. Variabel Penelitian dan Defenisi Operasional ........................ 63
3.5.1. Variabel Penelitian ...................................................... 63
3.5.1.1. Variabel Bebas ............................................... 63
3.5.1.2. Variabel Terikat ............................................. 63
3.5.2. Definisi Operasional ................................................... 64
3.6. Alat dan Bahan ....................................................................... 65
3.6.1. Alat .............................................................................. 65
3.6.2. Bahan .......................................................................... 65
3.7. Cara Kerja ............................................................................... 67
3.7.1. Ekstraksi Curcuma Longa dan Phyllantus Niruri .... 66
3.7.2. Isolasi Sel Punca dari Cell Line MDA-MB231 ........ 66
3.7.3. Uji Sitotoksik..................................................................... 67
3.8. Pengolahan dan Analisis Data ................................................ 68
3.9. Etika Penelitian ....................................................................... 69
3.10. Alur Penelitian ........................................................................ 70

BAB IV JADWAL DAN BIAYA PENELITIAN ....................................... 71

4.1. Jadwal Penelitian .................................................................... 71
4.2. Biaya Penelitian ...................................................................... 71

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 73

ii
 DAFTAR TABEL

No. Judul Halaman

Tabel 2.1. Subtipe Kanker Payudara dan Ekspresi Penanda Biologis ......... 11
Tabel 2.2. Penggunaan Kurkumin sebagai Penelitian Kanker .................... 37
Tabel 3.1. Defenisi Operasional .................................................................. 64
Tabel 4.1. Jadwal Penelitian ........................................................................ 71
Tabel 4.2. Rencana Anggaran Dana Penelitian ............................................ 72

iii
 DAFTAR GAMBAR

No. Judul Halaman

Gambar 2.1. Generasi Sel Punca Kanker Payudara ......................................... 13
Gambar 2.2. BRCA sebagai Salah Satu Molekul yang Mengalami
Perubahan pada Terjadinya Kanker Payudara ............................. 14
Gambar 2.3. Mekanisme Estrogen terhadap Kanker Payudara ........................ 14
Gambar 2.4. Mekanisme Terjadinya Kanker Payudara ................................... 15
Gambar 2.5. Mekanisme yang Mendasari Resistensi Terapeutik
Sel Punca Kanker Payudara ........................................................ 25
Gambar 2.6. Jalur Pensinyalan Notch .............................................................. 28
Gambar 2.7. Hubungan Silang antara Transformasi Jalur Faktor
Pertumbuhan Beta (TGF-β) dan Jalur Wnt / β-catenin dalam
Induksi Kanker Payudara Epitel Mesenchymal Transisi (EMT)
Kanker Payudara ......................................................................... 32
Gambar 2.8. Hubungan Silang antara Pensinyalan Hh dan Autofag
berdasarkan Bukti Saat Ini .......................................................... 35
gambar 2.9. Struktur Kurkumin, Demethoxycurcumin,
Bisdemethoxycurcumin, Cyclocurcumin, dan Calebin dalam
Curcuma Longa ........................................................................... 36
Gambar 2.10. Efek Farmakologi dari Kurkumin ............................................... 36
Gambar 2.11. Cara kerja Kurkumin .................................................................. 37
Gambar 2.12. Mekanisme Kerja Kurkumin ...................................................... 38
Gambar 2.13. Hubungan antara Kurkumin dengan Kanker .............................. 39
Gambar 2.14. Fungsi Survivin pada Jalur Apoptosis ......................................... 40
Gambar 2.15. Proses Apoptosis Sel ................................................................... 41
Gambar 2.16. Jalur Intrinsik dan Ekstrinsik Apoptosis ..................................... 43
Gambar 2.17. Mekanisme Kurkumin terhadap Apoptosis ................................. 44
Gambar 2.18. Tanaman Meniran ....................................................................... 47
Gambar 2.19. Hubungan Meniran dengan Kanker ............................................ 50
Gambar 2.20. Kerangka Teori ........................................................................... 58
Gambar 2.21. Kerangka Konsep ....................................................................... 59
Gambar 3.1. Skema Rancangan Penelitian ..................................................... 61

iv
 DAFTAR SINGKATAN

AIF Apoptosis Inducing Factor

ALDH1 Aldehyde Dehydrogenase 1
Apaf-1 Apoptosis Protease-Activating Factor-1
Bax Bcl-2 Associated Killer
BCC Basal Cell Carcinoma
Bcl-2 B-cell Lymphoma-2
BRCA Breast Cancer Suspectibility Gene
Caspase3 Cysteine Aspartate Specific Proteases
CD 24 Cluster of Differentiation 24
CD133 Cluster of Differentiation 133
CD44+ Cluster of Differentiation 44
CD49f Cluster of Differentiation 49f
CD90 Cluster of Diferensiation 90
CO2 Carbon Dioxide
COX2 Cyclo Oxigenase
DCIS Ductal Carcinoma In Situ
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
EMT Epithelial to Mesenchymal
ER Estrogen Receptor
ERK Extracellular Signal-Regulated Kinase
ER-α Alpha Reseptor Estrogen
EZH2 Gen Zeste Homolog 2
FACS Fluorescence-Activated Cell Sorting
FADD Fas –Associated Death Domain
FasL Fas Ligand
FBS Fetal Bovine Serum
HER2 Human Epidermal Growth Factor Receptor-2
Hh Hedgehog
IAP Inhibtor Apoptosis Protein
IL8 Interleukin 8

v
JNK Jun NH2-Terminal Kinase
LCC latency Competent Cancer
LCIS Lobular Carcinoma In Situ
MAML Modulation of Notch Signaling by Mastermind-Like
MAPK Mitogen-Activated Protein Kinase
MaSC Multipotent Mammary Stem Cells
MB Medulloblastoma
MEK Metil Etil Keton
MET Mesenchymal to Epithelial
NF-κB Nuclear Factor-Kappa B
NICD Notch Intracellular Domain
NOS Not Otherwise Specified
PI3K Phosphoinositide 3-Kinases
PR Progesterone Receptor
RON Recepteur D’origine Nantais
STAT3 Signal Transducer and Activator of Transcription 3
TNF-α Tumor Necrosis Factor
VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
VEGFR-1 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 1

vi
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Pada tahun 2018, Globocan mencatat angka kanker payudara mencapai

2.088.849 kasus (11, 6%), dengan angka kematian sebesar 626 679 kasus (6.6%).

(Ferley et al., 2018). Insidensi kanker payudara tertinggi yaitu di asia sebesar

43,6% (911.014 kasus baru kanker payudara), 137.514 kasus diantaranya terjadi di

Asia Pasifik dengan angka mortalitas mencapai 50.935 kasus (Ferley et al., 2018).

Data di Indonesia menunjukkan angka kejadian kanker tertinggi di Indonesia untuk

perempuan adalah kanker payudara yaitu sebesar 42,1 per 100.000 penduduk

dengan rata-rata kematian 17 per 100.000 penduduk (Kementrian Kesehatan

Republik Indonesia, 2019).

Sebahagian besar kasus kanker payudara dapat ditangani dengan terapi yang

sudah ada seperti pembedahan, kemoterapi, radiasi, terapi hormonal, terapi target

namun masih dijumpai kekambuhan yang tinggi. Dengan perkembangan metode

deteksi dini dan terapi adjuvan yang maju menyebabkan angka mortalitas menurun

tajam, namun kejadian rekurensi masih cukup sering terjadi (Kurniawan et al.,

2016). Terdapat 30% dari kanker payudara yang sudah mendapatkan terapi definitif

baik lokal maupun regional mengalami rekurensi selama follow up (Colleoni et al.,

2016). Pada pasien kanker payudara yang mendapatkan kemoterapi dan radioterapi

memiliki rekurensi sebesar 40% (Jeong et al., 2016).

Di Belanda dilaporkan dari 8.062 pasien, angka rekurensi lokal dan

metastasis (33.1%) terjadi paling sering pada sub tipe HER2 positif dan paling

1
 2

jarang pada luminal A (Vanmareen et al., 2018). Di asia, angka rekurensi kanker

payudara meningkat dari tahun ke tahun (30,4 %) (Wong et al., 2018). Di

Indonesia, berdasarkan data yang diperoleh dari RSUD Dr. Soetomo periode

Januari- Agustus 2015 menunjukan bahwa tingkat kekambuhan kanker payudara

sebesar 29,82% dan sebagian besar kekambuhan terjadi dalam 5 tahun pertama

(Eveline, Purwanto, dan Lestari, 2017).

Insiden rekurensi selalu menjadi tantangan besar bagi klinisi dalam

menerapkan terapi terkini yang dapat menekan insiden rekurensi dan progresivitas

sel kanker serta mencegah terjadinya metastasis (Spronk et al., 2018). Terdapat

beberapa faktor yang dapat menyebabkan tingginya angka rekurensi kanker

payudara, diantaranya adalah factor individu, biologi molekuler, biologi tumornya.

Contohnya, kanker payudara subtipe triple negative yang memiliki angka rekurensi

yang tinggi dan terapi yang terbatas pada subtipe ini. Selain itu yang sering

dilupakan adalah keberadaan sel punca kanker payudara. Sel punca kanker

payudara tersebut merupakan populasi terkecil dari sel kanker payudara yang

memiliki sifat self-renewal, resisten terhadap terapi, penurunan aktivitas apoptosis,

daya proliferasi yang tinggi dan imatur (Huang et al., 2014). Hal inilah yang

menyebabkan tinggi nya angka rekurensi dan terapi yang ada gagal dalam

menghambat maupun mengatasi sel punca kanker payudara tersebut (Nalla et al.,

2019).

Keberadaan sel punca kanker payudara ini menyebabkan terapi yang

diberikan oleh dokter selama ini tidak mampu membuat sel kanker lenyap

seutuhnya dari tubuh pasien dan masih tetap mengalami kekambuhan, bahkan

menyebabkan kematian ( Lin et al, 2015).

 3

Selain permasalahan rekurensi dan resistensi yang diakibatkan oleh adanya

sel punca kanker payudara, permasalahan lain yang dijumpai adalah terapi yang ada

memiliki keterbatasan dan efek samping yang banyak. Kemoterapi dan radioterapi

memiliki efek samping yang dapat menginduksi sel punca kanker payudara terssebut

melalui jalur IL-8 (Nalla et al., 2019).

Beberapa ahli mulai mencari alternatif terapi lain yang alami, memiliki efek

anti kanker, dan memiliki efek samping yang minimal (Muthiah, 2015). Oleh karena

itu, terapi alternatif dipertimbangkan dengan pendekatan 'back-to-nature' yang

mungkin menghasilkan peningkatan respon terapi dan memiliki efek anti kanker serta

efek samping yang minimal atau tidak ada sama sekali.

Ada beberapa tanaman herbal yang diduga memiliki efek antikanker,

diantaranya kurkumin dan meniran yang telah lama dimanfaatkan untuk berbagai

tujuan, dan tanaman ini banyak terdapat di Indonesia. Senyawa aktif pada meniran

adalah glikosida flavanon, lignan, niranthin, nirtetralin, phyltetralin, asiklik triterpen,

glikoflavon dan flavon sulfonat asam. Adanya kandungan polyphenol pada tanaman

meniran sangat penting dalam inhibisi dari invasi, migrasi dan adhesi dari sel namun

dampak toksiknya terhadap sel normal 50% lebih sedikit dibandingkan dengan

kemoterapi pada umumnya, selain itu kandungan tersebut dapat menginduksi

apoptosis (caspase 3 dan 7) yang menyebabkan meniran dapat menjadi kandidat yang

berharga pada terapi dari kanker yang sudah mengalami metastasis (Lee et al., 2015).

Mekanisme efek antitumor dari ekstrak meniran adalah dengan menurunkan

COX2 dan IL8, antiapoptosis dan juga induksi dari TNF-α. Penelitian lain

menjelaskan bahwa mekanisme ini diakibatkan penurunan aktivitas survivin dan

peningkatan caspase-3 (Soeprijanto & Assegaf, 2014).

 4

Pemberian ekstrak meniran mencapai tingkat inhibisi kanker serviks

maksimal pada dosis 150 mg/ml. Dalam penelitian lebih lanjut, ektrak tersebut

dapat menghambat proliferasi sel kanker dengan menginduksi penghentian siklus

sel pada G2/M (Zhu et al., 2016).

Selain meniran, saat ini juga terdapat kurkumin yang memiliki senyawa

aktif kurkumin, demethoxy kurkumin, dan bisdemethoxy kurkumin. Penerapan

terapi dari tanaman ini telah diteliti secara luas dan terbukti memiliki aktivitas

antiproliferatif dan efek apoptosis yang melibatkan death receptors (jalur

ekstrinsik) dan aktivasi caspase-8 sehingga menginduksi downstream regulator

apoptosis seperti bax, noxa, dan p53 yang memodulator apoptosis yang mana

semuanya berinteraksi dengan protein anti-apoptosis terkait mitokondria survivin

(jalur intrinsik) (Lv et al., 2016).

Pada kanker payudara, penggunaan kurkumin bermanfaat dalam

mengurangi ekspresi survivin, meningkatkan ekspresi protein bax, dan menginduksi

apoptosis sehingga terjadi pengurangan massa tumor (Lv et al, 2014). Kurkumin

menghambat kemampuan migrasi sel punca kanker payudara dengan memperkuat

umpan balik negatif E-kaderin/β-katenin (Liu and Ho, 2018; Mukherjee et al.,

2014).

Pada pengobatan kanker serviks, pemberian ekstrak kurkumin mencapai

tingkat inhibisi maksimal pada dosis 12000 mg/hari. Dalam pengobatan lebih

lanjut, pemberian dosis maksimal 6 mg /hr dari kombinasi dexotel dan kurkumin

pada pasien dengan kanker payudara stadium lanjut terbukti dapat menurunkan

secara signifikan tingkat VEGF setelah dilakukan tiga kali siklus pengobatan (Gera

et al., 2017).
 5

Dari uraian diatas diharapkan kedua herbal tersebut dapat bersinergis dalam

hal efek anti kanker payudara dan memiliki efek samping yang minimal terhadap

sel normal. Terapi kombinasi ini didukung beberapa penelitian, terapi kombinasi

memberikan hasil yang paling efektif sehubungan dengan adanya efek anti kanker.

Keunggulannya berasal dari kemampuan untuk menargetkan beberapa jalur yang

pada dasarnya bertujuan untuk meminimalkan resistensi obat karena sel-sel kanker

sering tidak mampu beradaptasi dengan efek toksik simultan dari dua agen

terapeutik dibandingkan dengan terapi tunggal (Mokhtari et al., 2017). Selain itu

Aung dkk pada 2017 menyatakan bahwa gabungan beberapa senyawa antikanker

dibuktikan mempunyai aktivitas sitotoksisitas yang lebih baik dibandingkan

senyawa tunggal. Sejalan dengan penelitian yang dilakukan oleh Puspitarini dkk

pada tahun 2019 yang mengatakn bahwa kombinasi kurkumin dan meniran dengan

perbandingan 50:50 memiliki potensi sebagai antikanker dalam sel T47D melalui

kemampuan mereka untuk menginduksi apoptosis.

Berdasarkan latar belakang masalah yang sudah diuraikan, peneliti ingin

membuktikan pengaruh kombinasi kurkumin dan meniran terhadap apoptosis

melalui jalur caspase 3, p53, survivin dan proliferasi sel punca kanker payudara

melalui jalur NF-κB.

1.2. Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang masalah yang sudah diuraikan, maka rumusan

masalah penelitian ini adalah apakah pengaruh kombinasi kurkumin (Curcuma

longa) dan meniran (Phyllantus niruri) terhadap apoptosis melalui jalur caspase-3,
 6

p53, survivin dan proliferasi melalui jalur NF-κB pada sel punca kanker payudara

(cd 44+/cd 24-) mda-mb231 in vitro?.

1.3. Tujuan Penelitian

1.3.1. Tujuan Umum

Membuktikan pengaruh kombinasi kurkumin (Curcuma longa) dan meniran

(Phyllantus niruri) terhadap apoptosis melalui jalur caspase-3, p53, survivin dan

proliferasi melalui jalur NF-κB pada sel punca kanker payudara (CD 44+/CD 24-)

MDA-MB231 in vitro.

1.3.2. Tujuan Khusus

1. Membuktikan pengaruh pemberian kombinasi kurkumin (Curcuma longa) dan

meniran (phyllantus niruri) terhadap apoptosis melalui jalur caspase-3, p53,

survivin pada sel punca kanker payudara (CD 44+/CD 24-) MDA-MB231.

2. Membuktikan pengaruh pemberian kombinasi kurkumin (Curcuma longa) dan

meniran (Phyllantus niruri) terhadap proliferasi melalui jalur NF-κB pada sel

punca kanker payudara (CD 44+/CD 24-) MDA-MB231.

3. Membuktikan dosis IC50 kombinasi kurkumin (Curcuma longa) dan meniran

(Phyllantus niruri) lebih efektif terhadap apoptosis melalui jalur caspase-3, p53,

survivin pada sel punca kanker payudara (CD 44+/CD 24-) MDA-MB231.

4. Membuktikan dosis IC50 kombinasi kurkumin (Curcuma longa) dan meniran

(Phyllantus niruri) lebih efektif terhadap proliferasi terhadap NF-κB pada sel

punca kanker payudara (CD 44+/CD 24-) MDA-MB231.

1.4. Manfaat Penelitian

1.4.1. Manfaat Teoritik

 7

Penelitian ini memberikan data dasar dalam hal terapi target terhadap

kanker payudara melalui jalur apoptosis melalui jalur caspase-3, p53, survivin dan

proliferasi melalui jalur NF-κB pada sel punca kanker payudara (CD 44+/CD 24-)

MDA-MB231 in vitro yang bisa memberikan dasar teori serta pemahaman baru

untuk dikembangkan atau diperbaiki di masa yang akan datang.

1.4.2. Manfaat Metodologik

Penelitian ini dapat menjadi dasar untuk melakukan penelitian pada in vivo

(Hewan) dan jika mendapatkan hasil yang baik maka dapat dilanjutkan penelitian

terhadap manusia yang tujuan akhirnya pemberian kombinasi kedua ekstrak ini

dapat digunakan sebagai terapi fitofarmaka pada kasus kanker payudara

khususnya kanker payudara subtipe triple negative.

1.4.3. Manfaat Aplikatif

1. Jika terbukti mempunyai hasil positif pada penelitian in vitro, pemberian

kombinasi ekstrak kurkumin dan meniran dapat dipertimbangkan sebagai terapi

tambahan dalam penanganan kanker payudara .

2. Memberi informasi kepada pengampu kebijakan dan masyarakat untuk

memanfaatkan kombinasi ekstrak kurkumin (Curcuma longa) dan meniran

(Phyllantus niruri) yang memiliki potensi anti kanker payudara melalui jalur

apoptosis (caspase-3, p53, survivin) dan proliferasi (NF-κB) pada sel punca

kanker payudara (CD 44+/CD 24-) MDA-MB231 in vitro.

 8

1.5. Potensi Orisinalitas

1. Kombinasi ekstrak kurkumin dan meniran memiliki potensi anti kanker

payudara berupa induksi apoptosis (caspase-3, p53, survivin) dan proliferasi

(NF-κB) melalui mekanisme seluler pada sel punca kanker payudara (CD

44+/CD 24-) MDA-MB231 in vitro.

2. Menemukan dosis efektif pada kombinasi kedua ekstrak tersebut terhadap

apoptosis (caspase-3, p53, survivin) dan proliferasi (NF-κB) pada sel punca

kanker payudara (CD 44+/CD 24-) MDA-MB231 in vitro

1.6. Potensi Hak Atas Kekayaan Intelektual

Potensi hak atas kekayaan intelektual (HAKI) dari penelitian ini adalah

diketahuinya:

1. Pengaruh pemberian kombinasi kurkumin (Curcuma longa) dan meniran

(Phyllantus niruri) terhadap apoptosis melalui jalur caspase-3, p53, survivin

pada sel punca kanker payudara (CD 44+/CD 24-) MDA-MB231.

2. Pengaruh pemberian kombinasi kurkumin (Curcuma longa) dan meniran

(Phyllantus niruri) terhadap proliferasi melalui jalur NF-κB pada sel punca

kanker payudara (CD 44+/CD 24-) MDA-MB231.

3. Dosis efektif kombinasi kurkumin (Curcuma longa) dan meniran (Phyllantus

niruri) terhadap apoptosis melalui jalur caspase-3, p53, survivin pada sel

punca kanker payudara (CD 44+/CD 24-) MDA-MB231.

4. Dosis efektif kombinasi kurkumin (curcuma longa) dan meniran (phyllantus

niruri) terhadap proliferasi melalui jalur NF-κB pada sel punca kanker

payudara (CD 44+/CD 24-) MDA-MB231.

 9

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Kanker Payudara

2.1.1. Definisi

Kanker payudara adalah tumor ganas yang berasal dari kelenjar payudara

dan jaringan penunjangnya yang tumbuh infiltratif, destruktif, serta dapat

bermetastase (Feng et al., 2018).

2.1.2. Epidemiologi

Kanker payudara merupakan keganasan paling sering pada wanita di

negara maju dan nomor 2 setelah kanker servik di negara berkembang dan

merupakan 29% dari seluruh kanker yang di diagnosis setiap tahunnya

(International Agency for Research on Cancer, 2018).

Data terbaru yang di lansir Globocan tahun 2018 terdapat 18,1 juta kasus

baru dengan angka kematian sebesar 9,6 juta kematian, dimana 1 dari 6

perempuan di dunia mengalami kejadian kanker serta 1 dari 11 perempuan

meninggal karena kanker (Ferlay et al., 2018). Insidensi kanker payudara tertinggi

di asia sebesar 43,6% (911.014 kasus baru kanker payudara), 137.514 kasus

diantaranya terjadi di Asia Pasifik dengan angka mortalitas mencapai 50.935

kasus (International Agency for Research on Cancer, 2018).

Berdasarkan data Riskesdas (2018), prevalensi kanker di Indonesia

menunjukkan peningkatan dari 1,4 per 1000 penduduk di tahun 2013 menjadi

1,79 per 1000 penduduk pada tahun 2018. Angka kejadian penyakit kanker di

Indonesia (136,2 per 100.000 penduduk) berada pada urutan ke 23 di asia dan
 10

pada urutan ke 8 di asia tenggara. Angka kejadian kanker tertinggi di Indonesia

untuk perempuan adalah kanker payudara yaitu sebesar 42,1 per 100.000

penduduk dengan rata-rata kematian 17 per 100.000 penduduk. (Kementrian

Kesehatan Republik Indonesia, 2019).

2.1.3. Klasifikasi

Secara garis besar, klasifikasi kanker payudara berdasarkan analisis

histopatologi dikategorikan menjadi karsinoma in situ (non-invasif) dan

karsinoma invasif. Tipe kanker payudara in situ selanjutnya dapat dikelompokkan

menjadi dua tipe meliputi ductal carcinoma in situ (DCIS) dan lobular carcinoma

in situ (LCIS). Tipe DCIS terjadi akibat adanya pertumbuhan abnormal sel epitel

pada bagian duktus, sedangkan tipe LCIS terjadi ketika terdapat pembelahan sel

tak terkontrol pada bagian lobul. Selanjutnya kedua tipe tersebut dikategorikan

kembali berdasarkan bentuk pertumbuhan dan karakter sitologis untuk

membedakan keduanya. Kejadian DCIS lebih banyak dibandingkan LCIS

(Malhotra et al., 2010; Kontomanolis et al., 2018).

Karsinoma disebut invasif ketika terdapat proliferasi abnormal dari sel-sel

neoplasma pada jaringan payudara yang mampu penetrasi melewati dinding

duktus dan menginvasi bagian stroma. Tipe karsinoma invasif pada kanker

payudara dapat dikategorikan menjadi beberapa subtipe. Secara garis besar, tipe

karsinoma invasif dapat dikategorikan menjadi invasif non-spesifik seperti

invasive duct carcinoma-not otherwise specified (NOS) dan invasif spesifik. Tipe

invasif non-spesifik dicirikan dengan terbentuknya sel tumor yang menginvasi

bagian stroma hingga ke bagian vaskular. Sel tumor yang membentuk kanker tipe
 11

ini tidak mampu membentuk karakter spesifik sebagaimana tipe yang lain

sehingga dikategorikan sebagai tipe non-spesifik (Mohan, 2010; Makki, 2015).

Tipe invasif non-spesifik juga merupakan tipe kanker invasif yang memiliki

prevalensi lebih tinggi dibandingkan dengan tipe yang lain (Weigelt dan Reis-

Filho, 2009). Tipe karsinoma invasif spesifik mempunyai beberapa subtipe

histologi yang didasarkan pada tipe sel (seperti pada apocrine carcinoma),

jumlah, lokasi (seperti pada mucinous carcinoma), karakter arsitektur (seperti

pada papillary, tubular dan micropapillary carcinoma) dan profil

imunohistokimia (seperti pada neuroendocrine carcinoma) (Makki, 2015).

Menurut American Cancer Association, saat ini terdapat empat subtipe

molekul tumor payudara utama dengan perbedaan prognostik pada hasil pasien

berdasarkan pada ekspresi atau tidak dari penanda biologis spesifik yaitu:

Estrogen Receptor (ER), Progesterone Receptor (PR), dan Human Epidermal

Growth Factor Receptor-2 (HER2) (Kontomanolis et al., 2018).

Tabel 2.1. Subtipe Kanker Payudara dan Ekspresi Penanda Biologis

(Kontomanolis et al., 2018)

Breast cancer Immunohistochemical analysis

subtypes
1 Luminal A
2 Luminal B
3 Basal Like
4 HER enriched
PR (+) and/or ER (+) and HER-2 (-), ↓Ki67
PR (+) and/or ER (+) and HER-2 (+/-),
↑Ki67
PR (-) and ER (-) and HER-2 (-)
PR (-) and/or ER (-) and HER-2 (+)

Luminal A menyumbang sekitar 40% kanker payudara dan mewakili

subtipe yang paling umum. Tumor ini memiliki hormon-reseptor positif (ER+

dan/atau PR+) dan HER-2 negatif. Karakteristik klinis subtipe Luminal A

menggambarkan tingkat kelangsungan hidup yang tinggi. Subtipe ini merupakan

 12

tumor yang kurang agresif dengan tingkat kekambuhan yang rendah (Ki67

rendah) dibandingkan subtipe lainnya dan memiliki prognosis jangka pendek yang

paling baik karena respon yang baik terhadap terapi hormonal (Kontomanolis et

al., 2018).
+
Luminal B juga merupakan hormon-reseptor positif (ER dan/atau PR +)

dan HER-2+/-, dengan prevalensi lebih rendah dari Luminal A tetapi dengan

prognosis yang lebih buruk yang mewakili 10-20% dari kanker payudara. Luminal

B memiliki tingkat proliferasi tinggi (Ki 67 tinggi) tetapi masih respon terhadap

terapi hormonal (Kontomanolis et al., 2018).

Jenis basal-like adalah tumor yang ditentukan oleh tidak adanya semua

reseptor hormon (ER-, PR-, dan HER-2-) dan mewakili 10-20% dari kanker

payudara. Triple negative breast cancer (TNBC) ini bersifat agresif, tingginya

metastasis jauh setelah operasi, dan prognosis jangka pendek yang buruk karena

kurangnya terapi target dengan aktivitas spesifik (Kontomanolis et al., 2018).

HER-2 yang diperkaya mewakili tumor positif reseptor hormon (ER-, PR-)

dan HER-2 positif. Mereka cenderung tingkat tinggi, nodus positif, tumor agresif,

dengan tingkat kelangsungan hidup yang buruk dan mewakili 10% dari kanker

payudara. Berbeda dengan tumor basal-likel, HER2 masih memiliki target terapi

(Kontomanolis et al., 2018).

Sel punca kanker payudara telah terlibat dalam inisiasi tumor,

perkembangan, metastasis, rekurensi, dan resistensi terhadap terapi. Asal-usul sel

punca kanker payudara tetap kontroversial karena heterogenitas tumor dan adanya

populasi sisi kecil seperti itu untuk studi, tetapi meskipun demikian, penanda

permukaan sel dan korelasinya dengan fungsi sel punca kanker payudara terus
 13

diidentifikasi. Sel punca kanker payudara didorong oleh aktivasi jalur

perkembangan yang persisten, seperti Notch, Wnt, Hippo, dan Hedgehog dan

strategi pengobatan baru yang ditujukan untuk jalur ini adalah dalam

pengembangan praklinis dan klinis (Crabtree & Miele, 2018).

Gambar 2.1. Generasi Sel Punca Kanker Payudara (Bai et al., 2018)

2.1.4. Patogenesis

Kanker payudara biasanya terjadi karena adanya interaksi antara faktor

lingkungan dan genetik. Jalur PI3K/AKT dan jalur RAS/MEK/ERK melindungi

sel-sel normal dari sel apoptosis. Ketika gen-gen yang mengkode jalur-jalur

perlindungan ini bermutasi, sel-sel menjadi tidak mampu melakukan apoptosis

yang kemudian mengarah pada perkembangan kanker. Mutasi ini terbukti secara

eksperimental terkait dengan paparan estrogen (Kabel & Baali, 2015).

Lima sampai sepuluh persen dari semua kanker payudara muncul dari

mutasi germ-line. Gen BRCA1 terletak di lengan panjang kromosom 17,

sementara BRCA2 terletak di lengan panjang kromosom 13. Pasien gen positif
 14

memiliki risiko 80% terkena kanker payudara terutama pada kelompok usia pra-

menopause (Denkert et al., 2016).

Gambar 2.2. BRCA sebagai Salah Satu Molekul yang Mengalami Perubahan
pada Terjadinya Kanker Payudara (Denkert et al., 2016)

Saat ini, di samping penggunaan grade, histologi, dan imunohistokimia,

perubahan ekspresi gen digunakan sebagai instrumen untuk mengklasifikasikan

kanker payudara. Berdasarkan metode ini, beberapa subtipe kanker payudara yang

berbeda telah diidentifikasi termasuk dua subtipe utama dari ER negatif termasuk

basal like dan HER-2, dan dua subtipe ER positif termasuk luminal A dan luminal B.

Subtipe ini berbeda nyata dalam prognosis dan target terapeutik yang

diekspresikannya (Feng et al., 2018).

 15

Gambar 2.3. Mekanisme Estrogen terhadap Kanker Payudara

(Feng et al., 2018)

Gambar 2.4. Mekanisme Terjadinya Kanker Payudara (Feng et al., 2018)

2.1.5. Penatalaksanaan

Penatalaksanaan kanker payudara terdiri dari pembedahan, radioterapi,

kemoterapi, terapi biologis (terapi target molekul/terapi imunologi, dan terapi

hormonal). Pembedahan merupakan terapi utama pada kasus-kasus kanker

payudara stadium awal. Jenis pembedahan yang dapat dilakukan adalah radical

mastectomy, modified radical mastectomy, simple mastectomy, lumpectomy dan

breast conserving surgery (Leclerc et al., 2016).

Target terapi ditujukan pada kasus dengan ditemukannya ekspresi protein

pada jaringan kanker. Terapi hormonal terutama ditujukan pada penderita kanker
 16

payudara dengan reseptor hormonal (steroid reseptor) yang positif, terutama ER

dan PR positif (Leclerc et al., 2016).

2.2. Cell Line Kanker Payudara

Cell line sering digunakan sebagai pengganti sel primer untuk mempelajari

proses biologis. Perkembangan pengetahuan terkini mengenai kanker payudara

berasal dari studi in vivo dan in vitro yang menggunakan cell line kanker payudara

tampaknya menjadi elemen kunci untuk diagnosis molekuler pada kanker

payudara (Dai et al., 2017).

Penamaan cell line secara umum bukan mencerminkan asosiasi

fenotipenya melainkan bagaimana mereka didirikan seperti dibentuk oleh satu

laboratorium yang sama, satu pasien yang sama dan lain-lain. Sebagai contohnya

seri HCC cell line didirikan oleh Pusat Kanker Hamon, seri MDA didirikan oleh

Rumah Sakit dan Institusi Tumor MD Anderson (Dai et al., 2017).

2.2.1. MDA-MB 231 Cell Line

Cell Line MDA-MB 231 merupakan sel epitel yang pertama sekali

ditemukan dari wanita Kaukasian berusia 51 tahun yang menderita efusi pleura

akibat metastasis dari adenokarsinoma payudara (ECACC, 2017).

Cell line ini sangat agresif, invasif dan terdiferensiasi buruk pada kanker

payudara triple negatif, dikarenakan cell line ini memiliki sedikit ekspresi reseptor

estrogen dan reseptor progesteron. Sama seperti cell line invasif yang lain, invasif

cell line MDA-MB 231 ini diperantarai degradasi proteolitik dan matriks

ekstraseluler. Akibatnya, MDA-MB 231 ini memiliki sedikit reseptor estrogen

 17

dan reseptor progesteron serta amplifikasi HER-2, cell line ini diklasifikasikan

pada cell line “basal” pada kanker payudara. Meskipun begitu, saat ini cell line ini

dikenali pada molekuler subtipe claudin-low karena menyebabkan penurunan

regulasi claudin-3 dan claudin-4, ekspresi yang rendah dari penanda proliferasi

Ki-67. Banyaknya penanda ini dihubungkan dengan transisi epitel mesenkim dan

ekspresi yang berhubungan dengan sel punca kanker payudara, seperti CD44+ dan

CD24- (ECACC, 2017).

Pada penanaman 3D, cell line ini menunjukkan morfologi yang

menyerupai endotel dan ini diganggu oleh fenotif yang invasif, memiliki proyeksi

stellate yang sering menjembatani koloni sel multiple. Kanker payudara triple

negatif adalah bentuk kanker payudara yang agresif dengan pilihan pengobatan

yang terbatas. Memahami dasar molekuler dari kanker payudara triple negatif ini

sangat penting untuk perkembangan obat baru oleh karena itu banyak penelitian

menggunakan cell line MDA-MB 231. Cell line MDA-MB 231 dikenal sebagai

alat untuk penelitian metastasis ke tulang. Subclone cell line MDA-MB 231 yang

cenderung metastasis pada tulang, otak dan paru-paru tikus yang diikuti injeksi

intraventrikel yang telah diisolasi, oleh karena itu cell line ini digunakan untuk

identifikasi gen dan jalur yang berpotensi sebagai mediator metastasis pada

tempat yang spesifik (ECACC, 2017).

Sel MDA-MB-231 dikultur pada suhu 37◦ C dalam medium L-15

Leibovitz yang dilengkapi dengan glutamin 2 mM dan 15% serum fetal bovin.

Media ini mendukung pertumbuhan sel di lingkungan tanpa ekuilibrasi CO2. Sel

MDA-MB-231 harus dikultur pada kepadatan antara 1-3 x 104 sel / cm2 dan

disubkultur ketika konfluen 70-80% (ECACC, 2017).

 18

MDAMB-231 cell line yang dibeli dari American Type Culture Collection

(Manassas, Virginia, USA) tumbuh dalam medium RPMI 1640 dengan

GlutaMAX ™ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AS) dan Dulbecco's

Modified Eagle Medium (DMEM) dilengkapi dengan 10% Fetal Bovine Serum

(FBS) (Biochrom GmbH, Berlin, Jerman) dan antibiotik pada suhu 37˚C dalam

ruang yang dilembabkan dengan CO2 5%. Untuk semua percobaan, media AIM V

(Thermo Fisher Scientific) ditambah dengan 10% FBS dan amfoterisin B

digunakan biakan menjadi 60-70% pertemuan. Media AIM V meningkatkan

proliferasi sel pada kepadatan yang konsisten dan melekat setelah diinkubasi

selama 24 jam pada suhu 37˚C dalam inkubator CO2 5%. Sel yang dipertahankan

dalam AIM V berkembang biak secara nyata lebih cepat setelah kultur 5 hari dan

mencapai kepadatan tinggi setelah kultur in vitro selama 7 hari (masing-masing

2,56 × 105 dan 7,07 × 105 sel/ml) (Du et al., 2018).

2.2.2. MCF-7 Cell Line

MCF-7 didapat dari efusi pleura dari wanita usia 65 tahun yang menderita

adenokarsinoma payudara. Dinamai dari Michigan Cancer Society. Cell line ini

merupakan cell line yang paling banyak diteliti di dunia (Endofit, 2010).

Sel MCF7 sangat menarik karena mempertahankan sejumlah karakteristik

yang mirip dengan epitel mammae. Cell line memiliki morfologi mirip epitel dan

monolayers dan membentuk struktur kubah karena adanya akumulasi cairan

antara culture dish dan sel monolayer. Cell line ini adalah salah satu dari beberapa

kanker payudara yang mengekspresikan alpha reseptor estrogen (ER-α), juga

mengekspresikan reseptor androgen, progesteron dan glukokortikoid yang

menjadikan mereka alat yang berharga dalam penelitian medis. Pengobatan MCF7
 19

dengan estrogen telah terbukti memiliki efek anti-apoptosis, sedangkan

pengobatan dengan obat kemoterapi anti-estrogen (misalnya tamoxifen) dapat

mengurangi pertumbuhan kultur dengan menghambat proliferasi dan menginduksi

apoptosis (Comsa, Cimpean dan Raica, 2015).

2.3. Sel Punca Kanker Payudara

Sel punca kanker didefinisikan sebagai sejumlah kecil sel yang ada dalam

tumor yang memiliki kemampuan untuk memperbarui diri, memulai dan

berdiferensiasi menjadi berbagai jenis sel (Dandawate et al., 2016). Pada kanker

payudara, populasi kecil sel telah diidentifikasi dan disebut sel punca kanker

payudara. Tes pembentukan mammosphere adalah cara yang populer dan nyaman

untuk menilai perilaku sel-sel ini. Dalam tes ini, sel punca kanker payudara

distimulasi untuk berproliferasi dengan penambahan faktor pertumbuhan

epidermal dan faktor pertumbuhan fibroblast dasar ke media kultur di piring

kultur jaringan kepatuhan rendah (Nalla, Kalia & Khairnar., 2019). Sel-sel

berkembang biak di bawah kondisi kepatuhan rendah ini menimbulkan spheroid,

yang umumnya didefinisikan sebagai "mammosphere" dan mengandung berbagai

fitur terkait sel punca, termasuk aktivasi jalur pensinyalan terkait sel punca. Lebih

lanjut, laju pembentukan mammosphere berkorelasi baik dengan tumorigenisitas

jaringan induk. Karena hal ini, jumlah sel pembentuk mammosphere dalam suatu

populasi diperkirakan mencerminkan jumlah sel punca kanker payudara,

sedangkan ukuran mammosphere dianggap mencerminkan aktivitas proliferasi

mereka. Kepadatan plating yang rendah dari strategi ini memungkinkan sel punca

kanker payudara untuk berkembang biak dan membentuk bola yang tidak patuh

dengan agregasi terbatas, dan lebih mirip dengan struktur tumor tiga dimensi
 20

daripada strategi kultur jaringan patuh dua dimensi (2D) klasik. Tes pembentukan

mammosphere dapat digunakan untuk menghitung efisiensi pembentukan bola (%

SFE) mammosphere yang berasal dari jaringan primer dan cell line kanker

payudara (Crabtree & Miele, 2018).

Penanda permukaan sel, seperti cluster of differentiation 44 (CD44),

cluster of differentiation 24 (CD24), dan lainnya juga digunakan untuk

mengidentifikasi sel punca kanker payudara, dan fluorescence-activated cell

sorting (FACS) memungkinkan sel punca kanker payudara untuk diberi label,

diurutkan, dan dimanipulasi dalam pengaturan laboratorium. Laporan awal sel

punca kanker payudara mengidentifikasi subpopulasi sel CD44+/CD24-/low/ESA+/

Lin- yang mampu secara efisien membentuk tumor pada tikus telanjang dari

sangat sedikit sel. Dalam beberapa tahun terakhir, marker tambahan telah

diidentifikasi, termasuk Aldehyde Dehydrogenase 1 (ALDH1), Cluster of

Differentiation 133 (CD133), dan Cluster of Differentiation 49f (CD49f), dan

keberadaan marker ini sering dikaitkan dengan resistensi kemoterapi dan

radioterapi. Terapi yang menargetkan sel punca kanker payudara dengan fenotipe

ini sudah ada dan sejumlah antibodi terapeutik telah diusulkan yang menargetkan

biomarker ini dengan tujuan menghilangkan sel punca kanker payudara. Juga

telah dilaporkan bahwa kanker payudara triple negative memiliki ekspresi

tertinggi dari biomarker ini jika dibandingkan dengan subtipe kanker payudara

lainnya. Subtipe triple negative dengan fenotip CD44+/CD24lo dikaitkan dengan

prognosis yang buruk (Crabtree & Miele, 2018).

CD44: Cluster of Differentiation 44 (CD44) adalah transmembran

glikoprotein permukaan sel yang mengikat hyaluronan dan terlibat dalam banyak
 21

fungsi seluler, termasuk adhesi seluler, proliferasi, ketahanan hidup, dan

diferensiasi. sel punca kanker payudara menunjukkan ekspresi CD44 yang kuat

dan keberadaan glikoprotein ini berperan menjaga multipotensi populasi sel punca

kanker payudara. Karena ekspresinya yang tinggi, CD44 telah menjadi target

terapi sel induk kanker payudara (Crabtree & Miele, 2018).

CD24: Cluster of Differentiation 24 (CD24), juga dikenal sebagai Heat

Stable Antigen (HSA), adalah sialoprotein yang meningkatkan adhesi seluler,

proliferasi, dan metastasis. Ekspresi CD24 biasanya sangat rendah atau tidak ada

pada sel punca kanker payudara dan penelitian in vitro menunjukkan bahwa

peningkatan regulasi CD24 menghambat pertumbuhan pada sel kanker payudara.

Lebih lanjut, CD24 telah terlibat dalam kemoresistensi dalam cell line kanker

payudara, dengan sel CD24+ muncul dari sel CD24-/low yang diobati dengan

radiasi melalui transmisi ketidakstabilan genom (Crabtree & Miele, 2018).

ALDH1: Aldehyde Dehydrogenase 1 (ALDH1) adalah anggota dari

keluarga aldehyde dehydrogenase protein yang mengkatalisasi oksidasi aldehida

intraseluler dan mungkin memiliki peran dalam diferensiasi awal sel punca kanker

payudara melalui perannya dalam mengoksidasi retinol menjadi asam retinoat.

Ekspresi ALDH1 yang meningkat mengidentifikasi sel punca kanker payudara dan

berkorelasi dengan prognosis kanker payudara yang buruk pada kanker payudara

reseptor negatif. ALDH1 diukur dengan uji enzimatik (ALDEFLUOR) dan aliran

cytometry. Inhibitor ALDH1 telah diperiksa sebagai terapi potensial, tetapi upaya

terhambat oleh redundansi enzim dehidrogenase aldehida dan kurangnya

spesifisitas dalam terapi molekul kecil. Pada kanker payudara, isoform yang
 22

diduga diekspresikan secara selektif dalam sel punca kanker payudara termasuk

ALDH1A1 dan A3 (Crabtree & Miele, 2018).

CD133: Cluster of Differentiation 133 (CD133) atau prominin adalah

glikoprotein permukaan sel yang terlokalisasi pada tonjolan membran seperti

mikrovili dan pada permukaan apikal beberapa sel epitel. CD133 sel punca kanker

payudara terutama terkait dengan kanker payudara triple negatif dan berkorelasi

dengan kelangsungan hidup yang buruk (Crabtree & Miele, 2018).

CD49f: Cluster of Differentiation 49f (CD49f) adalah integrin α6 yang

melakukan homodimerisasi dengan integrin lain (CD24 atau CD104) untuk

mengikat laminin dan memfasilitasi adhesi sel epitel ke matriks ekstraseluler.

CD49f juga bekerja sama dengan jalur transduksi sinyal untuk memfasilitasi

komunikasi antara sel dan ECM. Ekspresi CD49f dikaitkan dengan prognosis

yang buruk dan penurunan kelangsungan hidup pada kanker payudara (Crabtree &

Miele, 2018).

CD90: Cluster of Diferensiation 90 (CD90) adalah glikoprotein berlabuh

GPI yang berinteraksi dengan integrin pada sel yang berdekatan. CD90 diinduksi

oleh transisi epithelial-mesenchymal, dan telah diusulkan untuk diinduksi oleh

sel-sel imun dalam lingkungan mikro tumor di sel punca kanker payudara. Lu et

al. telah menunjukkan bahwa populasi CD90+ pada kanker payudara triple

negative mengandung sel punca kanker payudara (Crabtree & Miele, 2018).

Survivin: adalah anggota terkecil dari Inhibitor of Apoptosis (IAP), yang

memiliki peran kunci dalam mengatur pembelahan sel dan menghambat apoptosis

dengan menghalangi aktivasi caspase. Ekspresi yang menyimpang dikaitkan

dengan proliferasi sel tumor, perkembangan, angiogenesis, resistensi terapeutik,

 23

dan prognosis yang buruk. Studi tentang mekanisme molekuler yang

mendasarinya menunjukkan bahwa survivin terlibat dalam regulasi sitokinesis dan

perkembangan siklus sel, serta berpartisipasi dalam berbagai jalur pensinyalan

seperti p53, Wnt, hipoksia, transformasi faktor pertumbuhan, dan jalur

pensinyalan Notch (Chen et al, 2016).

Kombinasi penanda ini telah digunakan untuk meningkatkan nilai

prognostik di klinik. Studi klinis baru-baru ini telah menunjukkan korelasi antara

keagresifan kanker payudara triple negative dan fenotip CD44+ / CD24-/low (Chen,

Ye & Ying, 2015). Pada hakekatnya bentuk kanker payudara itu berbeda-beda,

dengan subkategori klinis-patologis berdasarkan pewarnaan imunohistokimia

berupa reseptor estrogen, reseptor progesteron, atau HER2. Baru-baru ini, kanker

payudara telah dikategorikan pada tingkat molekuler menggunakan profil ekspresi

gen ke dalam kategori tambahan luminal A, luminal B, basal-like, diperkaya

HER2, dan claudin-low. Kanker payudara triple-negatif mencakup setidaknya 4

subtipe molekuler. Pertanyaan yang tersisa adalah apakah subkategori kanker

payudara ini muncul dari garis keturunan sel induk yang sama atau berbeda.

Dontu et al. menyarankan bahwa sel-sel progenitor yang berbeda dapat

menimbulkan berbagai subtipe kanker payudara dan studi awal penanda

permukaan sel dalam cell line kanker payudara menunjukkan bahwa leukemia dan

sel punca kanker payudara mungkin memiliki beberapa garis keturunan.

Menariknya, studi ekspresi gen telah menunjukkan bahwa berbagai subtipe kanker

payudara dapat muncul dari garis keturunan nenek moyang yang berbeda, tetapi

mungkin tidak dengan cara yang dapat diprediksi. Sebagai contoh, basal-like

cancer yang timbul pada wanita yang positif untuk BRCA1 cenderung timbul dari
 24

sel-sel progenitor luminal. Lebih lanjut, ada bukti yang menunjukkan bahwa sel

punca kanker payudara menampilkan plastisitas seluler di mana sel-sel ini dapat

bertransisi dari Epithelial to Mesenchymal (EMT) atau Mesenchymal to Epithelial

(MET) berdasarkan sinyal dari lingkungan mikro tumor (Crabtree & Miele, 2018).

Survivin telah terbukti berhubungan dengan angiogenesis dengan

berinteraksi dengan faktor pertumbuhan endotel vaskular, angiopoietin, dan faktor

pertumbuhan fibroblast dasar, serta mengatur perilaku metastatik pada tikus dan

manusia dengan mengaktifkan berbagai sinyal. Mekanisme ini menunjukkan

bahwa survivin memiliki kemampuan invasif pembuluh darah dan metastatik

dalam perkembangan tumor (Li et al, 2014).

2.3.1. Asal Usul Sel Punca Kanker Payudara

Asal usul sel punca kanker payudara telah memicu kontroversi selama

bertahun-tahun. Masih belum jelas apakah sel punca kanker payudara berasal dari

Multipotent Mammary Stem Cells (MaSC) suatu populasi progenitor yang unik

hasil dari dedifferensiasi sel-sel non-stem atau timbul dari beberapa kombinasi

darinya (Koury, Zhong, & Hou, 2017). Pandangan yang paling banyak diterima

adalah bahwa sel punca kanker payudara muncul dari sel-sel MaSC. Studi

penelusuran garis keturunan menunjukkan keberadaan sel progenitor luminal dan

basal yang tidak berpotensi dalam kelenjar susu yang sedang berkembang yang

mempertahankan dan mendukung garis keturunan sel luminal dan basal yang

sepenuhnya berdiferensiasi untuk jangka waktu yang lama. Diperkirakan bahwa

akumulasi mutasi pada sel-sel progenitor ini dapat menimbulkan sel punca kanker

payudara karena bukti menunjukkan fitur fenotipik yang serupa dari

 25

CD44+/CD24-/low pada populasi MaSC dan sel punca kanker payudara (Crabtree &

Miele, 2018).

Dediferensiasi dari sel non-stem adalah teori lain yang didukung oleh bukti

terbaru. Paparan lingkungan terhadap kemoterapi dan radioterapi menyebabkan

perubahan genetik dan epigenetik pada sel-sel non-stem, menghasilkan generasi sel

punca kanker payudara secara de novo. Perubahan dalam lingkungan mikro tumor

juga dapat berkontribusi pada dedifferensiasi sel non-stem pada fenotipe sel punca

kanker payudara dan bukti terbaru menunjukkan hasil pemrograman ulang

epigenetik yang digerakkan MYC dalam dedifferensiasi sel epitel susu menjadi

fenotipe seperti sel punca kanker payudara. Singkatnya, tampak bahwa “kebuntuan”

pada kanker payudara adalah fenotip yang dapat timbul melalui mekanisme yang

berbeda, baik dengan mutasi sel punca jaringan atau dengan memperoleh fenotip

seperti punca oleh sel yang ditransformasi, yang diinduksi oleh EMT, kemoterapi,

atau bahkan terapi yang ditargetkan. Misalnya, Bhola et al. baru-baru ini

menunjukkan bahwa pada kanker payudara triple negative, resistensi terhadap

mTOR, dan/atau PI3K inhibitor muncul melalui kemunculan sel punca kanker

payudara yang bergantung pada Notch (Li et al., 2019).

 26

Gambar 2.5. Mekanisme yang Mendasari Resistensi Terapeutik Sel Punca

Kanker Payudara (Bai et al., 2018)
2.3.2. Jalur Sinyal Sel Punca Kanker Payudara

Banyak jalur pensinyalan terlibat dalam regulasi sel induk payudara

normal, termasuk Notch, Hedgehog, Wnt, dan Hippo. Pada sel punca kanker

payudara, jalur ini dideregulasi dan mungkin merupakan mekanisme resistensi

tumor, rekurensi, dan metastasis. Ada banyak terapi dalam pengembangan

praklinis atau dalam uji klinis yang menargetkan jalur ini baik sendiri atau dalam

kombinasi dengan standar perawatan, kemoterapi sistemik untuk berbagai tumor,

termasuk kanker payudara (Crabtree & Miele, 2018).

2.3.2.1 Jalur Sinyal Notch

Pensinyalan notch adalah jalur kompleks yang dipreservasi yang terlibat

dalam embriogenesis, diferensiasi, penentuan nasib sel, proliferasi, dan

pemeliharaan sel punca. Pada mamalia, ada empat reseptor notch berupa notch 1-

4, dan lima ligan yang diketahui Jagged1 dan 2, delta-like1, 3 dan 4. Pensinyalan

canonical notch diaktifkan melalui interaksi antara ligan transmembran dan

reseptor pada sel tetangga. Reseptor notch mengalami pembelahan oleh ADAM10

atau ADAM17/TACE, yang diikuti oleh pembelahan proteolitik akhir oleh -

secretase untuk melepaskan Notch Intracellular Domain (NICD). NICD

mentranslokasi ke dalam nukleus dan berikatan dengan kompleks transkripsional

notch yang mencakup Mastermind-Like (MAML) dan CSL. Kompleks ini

mengaktifkan transkripsi gen target notch, seperti keluarga gen HES dan HEY,

CYCLIN D1, dan C-MYC. Pensinyalan Non-kanonik telah ditunjukkan dalam

beberapa tipe sel, termasuk sel imun, dan penelitian terbaru tentang infiltrasi
 27

kekebalan dan penghindaran kekebalan sel kanker membuat area yang tidak

diketahui ini kedepan (Crabtree & Miele, 2018).

Pensinyalan notch melalui notch4 sangat penting untuk perkembangan

kelenjar susu normal, dan ekspresi notch hadir dalam MaSC normal. Studi-studi

awal ini menunjukkan bahwa pensinyalan notch yang menyimpang dapat terlibat

dalam pembentukan tumor melalui pembaharuan diri sel induk kelenjar susu yang

dideregulasi. Penghambatan pensinyalan notch menggunakan pendekatan

farmakologis dan genomik mengurangi populasi sel punca kanker payudara dan

mengurangi pembentukan mammosphere dalam cell line kanker payudara, sel

primer, dan model tikus dari kanker payudara. Studi klinis menunjukkan bahwa

ekspresi Notch1 adalah penanda prognostik yang buruk untuk kanker payudara

dan berkorelasi dengan penanda sel punca kanker payudara, stadium TNM lanjut,

dan kelangsungan hidup bebas penyakit yang lebih pendek. Resistensi terhadap

terapi dianggap didorong oleh sel punca kanker payudara dan interaksi Jagged1-

notch4 yang terbukti menjadi pemain kunci dalam kanker payudara yang resisten

terhadap ER+ melalui aktivitas sel punca kanker payudara. Lebih lanjut, terapi

endokrin pada kanker payudara luminal mempromosikan pembaruan diri CD133+

sel punca kanker payudara dengan menginduksi peralihan dari mekanisme yang

bergantung pada ER ke pensinyalan IL6 / notch3. Notch juga menjadi perantara

EMT dengan mengatur produksi faktor-faktor, seperti Twist, Snail, Slug, dan E-

cadherin. Pensinyalan notch sering secara tidak sengaja diaktifkan oleh hipoksia,

seperti dalam lingkungan mikro tumor atau dalam ceruk sel induk, menyiratkan

peran Notch dalam pembaruan diri sel punca kanker payudara dan EMT (Crabtree

& Miele, 2018).

 28

Gambar 2.6. Jalur pensinyalan notch (Kontomanolis et al., 2018)

Sistem pensinyalan notch adalah pengatur utama tujuan dan diferensiasi

sel. Ekspresi notch diatur oleh hipoksia dan sitokin inflamasi (IL-1, IL-6, dan

leptin) dan diaktifkan oleh pengikatan ligan. Setiap jenis sinyal proangiogenik

dapat memengaruhi sel endotel untuk berevolusi menjadi ujung atau norma sel

induk. Pensinyalan ini diidentifikasi oleh empat reseptor notch, notch-1, notch-2,

notch-3, dan notch-4; ada lima ligan terkait, Jagged-1, Jagged-2, Delta-like-1 (Dll-

1), Dll-3, dan Dll-4; semua molekul protein ini terikat pada membran, melakukan

sinyal parakrin dan ada pada pembuluh arteri dan bukan pembuluh darah.

Pensinyalan Notch bergantung pada pengikatan reseptor notch dan ligan

 29

delta/serrate melalui endositosis dan proses komunikasi sel ke sel. Tumor yang

memperoleh profil ekspresi tinggi dari ligan notch adalah fakta yang tak

terbantahkan yang mengaitkannya dengan perilaku klinis agresif mereka. Molekul

protein Dll-4 ditemukan dalam angiogenesis fisiologis dan patologis. Protein Dll-

4 berfungsi sebagai regulator negatif dalam tumorigenesis dan sebagai regulator

positif dalam perkembangan tumor. Kehadiran dan ekspresi Dll-4 dalam sel

neoplastik menghasilkan pembatasan perkembangan pembuluh darah baru,

sementara mereka secara bersamaan memicu pembentukan pembuluh darah

berdiameter besar dengan kemampuan perfusi dan oksigenasi yang memadai

(Kontomanolis et al., 2018).

Titik awal untuk upregulasi Dll-4 adalah regio luminal endotel arteri.

Peningkatan regulasi ligan Dll-4 dalam sistem kardiovaskular memandu sprouting

pembuluh darah baru. Deregulasi ligan Dll-4 memiliki dampak negatif pada

pembentukan pembuluh darah. Pembuluh baru memang sedang dibangun tetapi

kemampuan fungsionalnya dibatasi, fakta ini menyebabkan pertumbuhan tumor

terganggu. Penurunan regulasi ligan Dll-4 menghasilkan penampilan pembuluh

darah nonfungsional baru dalam neoplasma. Pembuluh darah nonfungsional ini

benar-benar tidak mampu membawa darah ke neoplasma dan menghasilkan

pertumbuhan tumor minor (Kontomanolis et al., 2018).

Blokade jalur notch dapat menunjukkan perbaikan dalam menangani

kanker payudara berulang. Hal tersebut dikarenakan blokade tidak hanya dapat

menurunkan populasi sel punca kanker payudara pada tumor tetapi juga mencegah

aktivasi notch yang disebabkan oleh terapi. Misalnya, pensinyalan Notch berada

dalam loop umpan balik dengan pensinyalan VEGFR-1 dan VEGFR-2, yang
 30

mengatur angiogenesis tumor. Inhibitor VEGF antiangiogenik dapat mengaktifkan

pensinyalan notch, yang mengarah ke pertumbuhan tumor. Selain itu, pengobatan

trastuzumab atau tamoxifen juga dapat secara tak terduga memicu aktivasi Notch.

Ini menyarankan obat konvensional dalam kombinasi dengan Notch inhibitor

dapat membantu mencapai respon yang lebih baik terhadap terapi antikanker dan

meminimalkan risiko kekambuhan (Bai et al., 2018).

2.3.2.2. Jalur Sinyal Wnt

Sejak ditemukannya gen wnt pertama, wnt1 (awalnya bernama int-1), 19

gen Wnt manusia telah diidentifikasi. Gen-gen ini menyandikan sekelompok

glikoprotein tersekresi yang sangat terkonservasi, yang sangat penting untuk

perkembangan embrio dan homeostasis jaringan dewasa. Protein FZD adalah

tujuh reseptor transmembran untuk ligan Wnt. Ada 10 anggota dalam keluarga

FZD, berbagi CRD ekstraseluler yang dikonservasi dimana ligand Wnt

mengikat. LRP5 dan LRP6 adalah koreseptor untuk ligan Wnt. Baik FZD dan

LRP5/6 diperlukan untuk jalur wnt/β-catenin (Yin et al., 2018).

Secara konvensional, jalur wnt didefinisikan sebagai kanonik dan

nonkanonik sesuai dengan keterlibatan pensinyalan β-catenin. Beberapa anggota

dalam keluarga Wnt seperti Wnt1 dan Wnt3a berikatan dengan FZD dan

LRP5/6, yang mengarah ke pemisahan kompleks pendegradasi β-catenin di

mana β-catenin difosforilasi oleh GSK3β. Akibatnya, β-catenin dalam

sitoplasma lolos dari fosforilasi dan degradasi berikutnya dan mentranslokasi ke

nukleus, di mana ia bergabung dengan TCF/LEF, sehingga mempromosikan

transkripsi beberapa gen target. Jalur nonkanonik Wnt tidak tergantung pada β-

catenin, dan biasanya diprakarsai oleh Wnt5a dan Wnt11. Sampai sekarang,
 31

beberapa protein yang disekresikan telah ditemukan bersifat antagonis terhadap

pensinyalan Wnt, termasuk SFRP, DKK dan WIF-1 (Yin et al., 2018).

Telah diterima secara luas bahwa metastasis adalah peristiwa awal dalam

perkembangan kanker. Menggunakan tikus transgenik HER2, penelitian telah

menunjukkan bahwa sel-sel kanker payudara dapat menyebar pada stadium

tumor awal, dan EMT yang diinduksi oleh pensinyalan Wnt kanonik dan

nonkanonik berkontribusi pada penyebaran awal. Sel-sel awal yang

disebarluaskan ini menunjukkan karakteristik seperti batang dan memiliki

kemampuan mengawali tumor (Braune, Seshire & Lendahl, 2018). Mereka

diam, tetapi mereka dapat melepaskan dari dormansi yang mengarah ke

metastasis jauh. Oleh karena itu, mereka juga didefinisikan sebagai MIC yang

mungkin bertanggung jawab untuk metastasis tumor bahkan bertahun-tahun

setelah pengangkatan tumor primer. Khususnya, satu studi baru-baru ini

menunjukkan bahwa selama dormansi, DKK1 menekan pensinyalan Wnt dalam

MIC yang didefinisikan sebagai kanker laten yang kompeten (LCC);

downregulation pensinyalan Wnt menginduksi LCC ke dalam ketenangan untuk

menghindari pengawasan kekebalan. Bersama-sama, temuan ini meningkatkan

kemungkinan bahwa setelah diseminasi MIC awal, aktivitas pensinyalan Wnt

dapat menurun untuk dormansi MIC berikutnya (Yin et al., 2018).

 32

Gambar 2.7. Hubungan Silang antara Transformasi Jalur Faktor

Pertumbuhan Beta (TGF-β) dan Jalur Wnt / β-catenin dalam Induksi
Kanker Payudara Epitel Mesenchymal Transisi (EMT) Kanker Payudara
(Yin et al., 2018)

Pensinyalan Wnt/Frizzled/β-catenin mempertahankan pertumbuhan

payudara yang biasa serta terlibat dalam perkembangan kanker dan ditemukan

menjadi terlalu aktif pada 50% pasien kanker payudara yang menyertai

kelangsungan hidup yang buruk. Ini mengontrol masa depan sel selama

perkembangan embrio dan dalam pembaruan sel-sel usia dewasa. Protein dari

keluarga Wnt memicu transfer β-catenin ke nukleus dan memulai transkripsi gen

yang terlibat dalam menentukan diferensiasi sel, pembelahan asimetris, migrasi

dan polaritas sel (Nalla, Kalia & Khairnar, 2019).

Penghambatan pensinyalan ini menghambat pertumbuhan susu dan

mengubah proliferasi yang disebabkan oleh kehamilan. Bahkan pensinyalan Wnt

 33

yang diregulasi meningkatkan ekspansi sel-sel progenitor preneoplastik dalam

kelenjar susu tikus yang dimodifikasi secara genesis. Dibandingkan dengan sel-sel

induk normal, sel punca kanker payudara menunjukkan aktivasi lebih dari

pensinyalan Wnt, dan penghambatannya menurunkan mammosphere dengan cara

yang bergantung pada estrogen receptor. Baru-baru ini, penulis menemukan

bahwa sinyal β-catenin dan PI3K/Akt dikendalikan oleh pensinyalan AhR yang

menyebabkan resistensi terhadap kemoterapi dan pembaruan sel punca kanker

payudara. Bahkan, overekspresi neuropilin 1 (NRP-1), yang merupakan aktivator

jalur Wnt/β-catenin menghasilkan sel punca seperti ciri-ciri dalam sel kanker

payudara dan pembentukan tumor (Nalla, Kalia & Khairnar, 2019).

Karena itu, obat-obatan yang mengintervensi jalur pensinyalan Wnt

mungkin memberikan hasil klinis yang lebih baik dengan menargetkan

pengembangan sel punca kanker payudara. Sebagai contoh, sulforaphane memuat

nanopartikel dalam kombinasi dengan docetaxel (Huang, J. et al., 2016),

pyrvinium pamoate, dan pengobatan phosphosulindac (OXT-328) yang sangat

menghambat pembaruan diri dari sel punca kanker payudara dengan menurunkan

regulasi β-catenin yang menekan sel punca kanker payudara, EMT dan resistensi

terapeutik (Nalla, Kalia & Khairnar, 2019).

2.3.2.3. Jalur Sinyal Hedgehog (Hh)

Jalur pensinyalan hedgehog (Hh) mengatur berbagai proses

perkembangan, termasuk embriogenesis, proliferasi sel, masa depan sel, dan pola

jaringan pada vertebrata. Pada orang dewasa, aktivitas pensinyalan Hh yang

terkontrol sangat penting untuk penyembuhan luka, regenerasi jaringan, dan

pemeliharaan homeostasis. Namun, aktivasi jalur ektopik Hh telah

 34

didokumentasikan bertanggung jawab untuk tumorigenesis, perkembangan,

metastasis, dan resistensi obat dari berbagai kanker, termasuk basal cell

carcinoma (BCC), medulloblastoma (MB), dan banyak tumor padat dan

hematologis lainnya. Karena keterlibatan yang luas ini pada kanker, jalur Hh telah

muncul sebagai target yang menarik untuk terapi kanker. Selama dua dekade

terakhir, rangkaian upaya telah didedikasikan untuk pemahaman mendasar tentang

jalur Hh, serta pengembangan modulator jalur Hh tingkat klinis (Zeng & Ju,

2018).

Jalur Hedgehog (Hh) mengontrol proses perkembangan yang kompleks

dalam vertebrata. Aktivasi abnormal jalur Hh bertanggung jawab untuk

tumorigenesis dan pemeliharaan beberapa kanker, dan dengan demikian

mengatasi ini merupakan peluang terapeutik yang menjanjikan. Dalam beberapa

tahun terakhir, dua inhibitor Hh telah disetujui untuk pengobatan basal cell

carcinoma (BCC) dan menunjukkan hasil klinis yang baik (Zeng & Ju, 2018).

Sebagai salah satu pemain utama dalam sistem pensinyalan sel, jalur Hh

berinterplays dengan beberapa jalur onkogenik, seperti PI3K/AKT/mTOR,

RAF/MAPK/ERK, dan jalur KRAS. Meskipun peran dan mekanisme autophagy

atau pensinyalan Hh sendirian dalam kesehatan manusia dan penyakit telah

dipelajari secara intensif sejak beberapa dekade yang lalu, hubungan silang di

antara mereka belum terungkap sampai beberapa tahun terakhir. Pada gambar

2.12 menunjukkan hubungan silang antara jalur Hh dan autophagy berdasarkan

dua kategori: pensinyalan Hh menghambat autophagy dan pensinyalan Hh

mempromosikan autophagy (Zeng & Ju, 2018).

 35

Gambar 2.8. Hubungan Silang antara Pensinyalan Hh dan Autofag

berdasarkan Bukti Saat Ini (Zeng & Ju, 2018)

2.4. Kurkumin

Curcuma longa (Turmeric) dari famili Zingiberaceae oleh penduduk Asia

dan khususnya di Indonesia, telah digunakan secara tradisional sebagai obat dan

pencegah penyakit kanker yang tidak menimbulkan efek toksik yang merugikan,

salah satu kandungan senyawanya adalah kurkumin. Fitokimia curcuma longa

mengandung banyak sumber kurkuminoid polifenolik, yaitu kurkumin,

demethoxykurkumin, dan bisdemethoxkurkumin (Ashraf & Sultan, 2017).

Kurkuminoids mengandung kurkumin utama (sekitar 80%), dan dua

kurkuminoids lainnya adalah demethoxy kurkumin (sekitar 12%) dan

bisdemethoxy Kurkumin bersama dengan protein lainnya (6,3%), lemak (5,1%),

mineral (3,5%), karbohidrat (69,4 %), dan kelembaban (13,1%). Minyak esensial

(5,8%) diperoleh dengan distilasi uap rimpang memiliki a-phellandrene (1%),

 36

sabinene (0,6%), cineol (1%), borneol (0,5%), zingiberene (25%), dan

seskuiterpen (53 %) (Ashraf & Sultan, 2017).

Gambar 2.9. Struktur Kurkumin, Demethoxycurcumin,

Bisdemethoxycurcumin, Cyclocurcumin, dan Calebin dalam Curcuma Longa
(Lee, 2013)

Kurkumin mengandung efek anti-inflamasi, antioksi dan, anti-tumor, dan

dapat digunakan sebagai agen chemopreventive pada beberapa model sel kanker

dan digunakan sebagai pilihan terapetik di klinik onkologi (lee, 2013).

 37

Gambar 2.10. Efek Farmakologi dari Kurkumin (Gera et al, 2017)

Tabel 2.2. Penggunaan Kurkumin sebagai Penelitian pada Kanker (Gera et

al, 2017)
 38

Gambar 2.11. Cara Kerja Kurkumin (gera et al, 2017)

2.4.1. Peran Kurkumin terhadap Kanker

Kurkumin menghambat proliferasi dari berbagai macam sel tumor

(termasuk sel kanker payudara) dan menghambat karsinogen yang menginduksi

kanker (Banik et al., 2017).

Gambar 2.12. Mekanisme Kerja Kurkumin (Banik et al., 2017)

Mekanisme kerja kurkumin terhadap kanker antara lain menghambat jalur

Signal Transducer and Activator of Transcription 3 (STAT3) dan NF-κB, yang

 39

berperan dalam perkembangan kanker dan menghambat ekspresi gen

housekeeping (Vallianou et al., 2015).

Sebagian besar agen antikanker mengaktifkan faktor NF-κB yang

memediasi kelangsungan hidup sel, proliferasi, dan metastasis. Telah ditemukan

bahwa kurkumin menghambat aktivitas migrasi sel kanker payudara, tingkat

proliferasi, adhesi, dan invasi melalui down-regulation ekspresi NF-κBp65.

Human Epidermal Growth Factor 2 (HER2) adalah onkoprotein yang penting,

yang diekspresikan dalam sekitar 15% hingga 25% kanker payudara. Kurkumin

menurunkan HER2 oncoprotein, fosforilasi Akt, MAPK, dan ekspresi NF-κB di

kedua BT-474 dan SK-BR-3-jam sel. Selanjutnya, Kurkumin meningkatkan

kemanjuran kemoterapi dengan menyesuaikan p65NF-κB-p300 cross-talk yang

mendukung p53-p300 untuk kanker payudara. Kurkumin juga menunjukkan peran

terapeutik potensial dalam memblokir recepteur d’origine nantais (RON) invasi

tirosin kinase yang dimediasi sel karsinoma dengan mempengaruhi ekspresi

protein p65 dan aktivitas transkripsi melalui NF-κB (Vallianou et al., 2015).
 40

Gambar 2.13. Hubungan antara Kurkumin terhadap Kanker (Gera et al,

2017)

2.4.2. Peran Kurkumin terhadap Apoptosis

Apoptosis adalah kematian sel terprogram dengan cara menghilangkan sel

dari suatu organisme tanpa menimbulkan respons inflamasi (Iannolo G, 2017) .

Sel apoptosis dapat dikenali dengan perubahan morfologis stereotypical. Pada

organisme multisel, apoptosis sangat penting untuk pengembangan, tumor supresi,

sistem imun dan homeostasis. Sel apoptosis dapat dikenali dengan perubahan

morfologis stereotypical (Kadam & Abhang, 2016).

Survivin terlibat dalam tumorigenesis melalui mekanisme yang beragam,

termasuk penghambatan jalur apoptosis (Gambar 2.9), regulasi sitokinesis dan

berperan dalam berbagai jalur seperti jalur p53, Wnt, dan Notch signaling.

Survivin dikaitkan dengan menghambat sitokrom-c dan caspase-8 (Chen et al,

2016).
 41

Gambar 2.14. Fungsi survivin pada jalur apoptosis.

Apoptosis dapat dimulai baik oleh jalur ekstrinsik yang bertindak melalui

caspase-8 atau dengan jalur intrinsik yang bertindak melalui caspase-9. jalur ini

berkumpul untuk mengaktifkan caspases efektor, yang akhirnya mengarah ke

apoptosis. Survivin mencegah pengolahan inisiator caspase-9 dan caspases

efektor, sehingga menyebabkan penghambatan apoptosis (Chen et al, 2016).

Gambar 2.15. Proses Apoptosis Sel (Kadam & Abhang, 2016)

 42

Induksi apoptosis pada organisme multiseluler diidentifikasi melalui sinyal

intrinsik maupun ekstrinsik. Jalur intrinsik dikendalikan oleh permeabilisasi

membran mitokondria dan jalur ekstrinsik dikendalikan oleh death receptor yang

memicu kaskade apoptosis. Protein yang paling penting dalam apoptosis adalah

protein caspase yang beperan sebagai protein eksekutor (Iannolo et al, 2008).

Caspase upstream untuk jalur intrinsik adalah caspase 9 sementara jalur ekstrinsik

adalah caspase 8. Jalur intrinsik dan ekstrinsik akan mengaktifkan caspase 3

(Kadam & Abhang, 2016).

Jalur ekstrinsik diinisiasi oleh pengikatan death receptor pada permukaan

sel. Reseptor apoptosis merupakan bagian dari reseptor Tumor Necrosis Factor

(TNF) yang terdiri dari cytoplasmic domain yang berfungsi untuk mengirim sinyal

apoptotik. Death Receptor yang diketahui antara lain sejenis reseptor TNF tipe 1

seperti protein Fas (CD95). Pada saat Fas berikatan dengan ligand-nya, Fas

Ligand (FasL), tiga atau lebih molekul Fas bergabung dan cytoplasmic death

domain membentuk binding site untuk adaptor protein FADD (Fas –associated

death domain). FADD ini melekat pada reseptor apoptosis dan mulai berikatan

dengan bentuk inaktif dari caspase-8. Molekul pro caspase-8 ini kemudian

dipecah menjadi caspase-8 aktif. Enzim ini kemudian mengaktivasi caspase-3 dan

7 serta mengaktifkan pro caspase lainnya dan mengaktifkan enzim untuk mediator

pada fase eksekusi (Hongmei, 2012).

Jalur ini terjadi karena terdapat permeabilitas mitokondria dan pelepasan

molekul pro-apoptosis ke dalam sitoplasma tanpa memerlukan death receptor.

Protein anti-apoptosis yang utama adalah bcl-2 dan bcl-x yang pada keadaan

normal terdapat pada membran mitokondria dan sitoplasma. Faktor pertumbuhan

 43

dan sinyal lainnya dapat merangsang pembentukan protein anti-apoptosis bcl-2

yang berfungsi sebagai regulator apoptosis. Pada saat sel mengalami stres, Bcl-2

dan bcl-x menghilang dari membrane mitokondria dan digantikan oleh pro-

apoptosis protein seperti bak, bax, dan bim. Bila kadar bcl-2 dan bcl-x menurun

permeabilitas membran mitokondria meningkat dan melepaskan beberapa protein

yang mengaktifkan kaskade caspase. Salah satu protein tersebut adalah

cytochrom-c yang diperlukan untuk proses respirasi pada mitokondria. Di dalam

cytosol, cytochrome-c berikatan dengan protein Apaf-1 (apoptosis activating

factor-1) dan mengaktivasi caspase-9. Protein mitokondria lainnya seperti

Apoptosis Inducing Factor (AIF) memasuki sitoplasma dan akan mengikat

berbagai inhibitor apoptosis yang pada keadaan normal menghambat aktivasi

caspase (Kadam & Abhang, 2016).

 44

Gambar 2.16. Jalur Intrinsik dan Ekstrinsik Apoptosis (Kadam & Abhang,

2016)

Kurkumin menginduksi penangkapan G2/M dan proses apoptosis,

menghambat proliferasi sel dengan menghambat dinamika perakitan

mikrotubulus, dan lebih lanjut mengaktifkan pos pemeriksaan mitosis pada sel

MCF-7. Selanjutnya, sel-sel terakumulasi dalam fase G (1) dari siklus sel, dan

kurkumin menekan ekspresi gen zeste homolog 2 (EZH2) melalui stimulasi tiga

anggota utama dari jalur mitogen-activated protein kinase (MAPK): Jun NH2-

terminal kinase (JNK), extracellular signal-regulated kinase (ERK), dan p38

kinase (Banerjee, Singh, & Panda, 2010).

Pada kanker payudara, penggunaan kurkumin bermanfaat dalam

mengurangi ekspresi bcl-2, meningkatkan ekspresi protein bax, dan menginduksi

apoptosis sehingga terjadi pengurangan massa tumor (Lv Z et al, 2014). Curcumin

mengurangi viabilitas sel tumor payudara, menurunkan ekspresi VEGFR 2/3,

menderegulasi ekspresi siklin D1, PECAM-1, dan p65, yang merupakan faktor-

faktor yang diregulasi oleh NF-κB. Jalur ini akan menginhibisi proliferasi dan

angiogenesis tumor (Qadir, Naqvi & Muhammad, 2016).

 45

Gambar 2.17. Mekanisme Kurkumin terhadap Apoptosis (Chen J, 2014)

2.4.3. Peran Kurkumin terhadap Sel Punca

Kurkumin menyebabkan ketidakseimbangan dalam pembentukan

kompleks Bcl/Bax, sehingga meningkatkan tingkat apoptosis dengan

meningkatkan sensitivitas Mitomycin C (MMC) sel tumor. MMC menurunkan sel

punca kanker payudara yang berasal dari cell line MCF-7 dan MBA MB-231.

Kurkumin, menyebabkan sel punca kanker payudara kehilangan kemampuan

proliferatif mereka oleh generasi kelima. Kombinasi kurkumin dan MMC

menurunkan regulasi ekspresi protein antiapoptotic bcl-2, meningkatkan regulasi

dari protein proapoptotik bax, bak, bad, bik, dan bim. Jalur pensinyalan

apoptosis diaktifkan di stem cell kanker payudara melalui aktivasi caspase-3 dan

caspase-9 (Liu, 2018).

Kurkumin menghambat kemampuan migrasi sel punca kanker payudara

dengan memperkuat umpan balik negatif E-cadherin/β-Katenin. Kurkumin dapat

menghambat translokasi nuklir dari β-katenin, serta mengaktifkan Slug dan

 46

mengembalikan ekspresi E-cadherin. Efek ini akhirnya meningkatkan

pembentukan kompleks E-cadherin/β-Catenin dan retensi sitosol retensi sitosol-

katenin, sehingga akhirnya menghambat migrasi sel punca kanker payudara (Liu

& Ho, 2018; Mukherjee et al., 2016).

Saat ini, berbagai agen kanker sel punca yang selektif telah

dikembangkan, dan diklasifikasi sebagai senyawa alami (misalnya, ekstrak

herbal dan antibiotik tradisional Cina), bahan kimia sintetis, antibodi atau

protein rekombinan, dan oligonukleotida (He et al., 2014). Bukti-bukti yang ada

menunjukkan kurkumin dapat dipertimbangkan sebagai terapi target pada kasus

kanker payudara dengan menghambat pensinyalan wnt dalam kapasitas sel

punca kanker untuk memperbaharui diri dalam sel kenker payudara (Li, 2018).

Sebagai contoh, ekstrak herbal kurkumin dapat menginduksi apoptosis sel punca

kanker rectum pada CD133 dan secara signifikan meningkatkan radiosensitivitas

sel punca kanker. Kurcumin dan piperine, diberikan tunggal atau kombinasi,

dapat menekan pertumbuhan sel punca kanker payudara (He et al., 2014).

2.5. Meniran

Meniran (Phyllanthus) adalah salah satu genus terbesar dalam famili

Phyllanthaceae, dengan 11 sub-genus yang terdiri lebih dari 700 spesies terkenal

terutama di daerah tropis dan subtropics. Spesies paling penting yang secara

tradisional digunakan untuk pengobatan berbagai penyakit manusia yang

termasuk dalam sub-genus Cicca, Kirganelia dan Phyllanthus. Tumbuhan dari

genus Phyllanthus digunakan sebagai formulasi herbal selama berabad-abad di

 47

banyak negara Asia Tenggara, Brasil, India dan Cina (Nisar et al., 2018; Mou et

al., 2016; Kardinan & Kusuma, 2004). Tanaman herbal meniran telah banyak

dilaporkan dalam sistem pengobatan tradisional untuk mengobati berbagai

penyakit termasuk tumor, asma, nyeri sendi, infeksi virus dan banyak lagi yang

lainnya (Nisar et al., 2018). Lebih dari 510 senyawa telah diisolasi dari meniran

dan sebagian besar adalah lignin, triterpenoid, flavonoid, dan tanin yang memiliki

efek anti tumor dan antioksidan (Mou et al., 2016; Du et al., 2018). Meniran

berarti "daun dan bunga" karena bunga, serta buahnya, tampaknya menyatu

dengan daun dan dapat tumbuh hingga 60 cm (Kardinan & Kusuma, 2004).

Meniran adalah sejenis tanaman musim hujan yang ditemukan di lahan

pertanian dan lahan kritis. Baru-baru ini meniran menarik perhatian para peneliti,

karena sifat hepatoprotektifnya. Seluruh bagian dari tanaman;akar, daun, ekstrak,

dan buah dapat digunakan dalam pengobatan berbagai penyakit, terutama hepatitis

dan infeksi virus lainnya (Kardinan & Kusuma, 2004).

 48

Gambar 2.18. Tanaman Meniran (Kamruzzaman & Hoq, 2016)

Dalam penelitian klinis, tanaman meniran akan diambil ekstraknya melalui

tahapan ekstraksi. Ekstraksi adalah proses dimana zat yang terkandung dalam

bahan tanaman dipisahkan menggunakan pelarut tertentu melalui prosedur

standar. Ada beberapa prosedur untuk ekstraksi pelarut, yang umumnya

diterapkan dalam ekstraksi tanaman, seperti rebusan, infus, maserasi perkolasi dan

ekstraksi Soxhlet. Prosedur ini bergantung pada prinsip ekstraksi padat-cair,

karena bahan tanaman ditempatkan dalam kontak dengan pelarut tertentu untuk

memungkinkan difusi pelarut ke dalam sel. Setelah itu, pelarut akan melarutkan

substansi sel tumbuhan. Akhirnya, pelarut yang mengandung hasil harus berdifusi

keluar dari sel untuk memperkaya metabolit yang diekstraksi. Perlakuan tertentu,

seperti paparan panas dan penguapan, dapat menyebabkan hilangnya atau

degradasi dari konstituen tanaman. Oleh karena itu, pilihan prosedur ekstraksi

perlu dipertimbangkan secara hati-hati (Azwanida, 2015).

Pelarut mengekstraksi molekul yang larut dan meninggalkan bahan yang

tidak larut. Sebelum langkah ekstraksi, penanganan bahan tanaman penting sebagai

titik awal isolasi produk alami. Jaringan tanaman harus disiapkan dengan cara

meminimalkan risiko kontaminasi dan kehilangan senyawa aktif yang berharga,

atau perubahan kimia dari konstituen. Dalam kebanyakan kasus, pengeringan

jaringan tanaman dianggap sebagai cara terbaik untuk melestarikan bahan tanaman

dan cocok untuk penyimpanan sampel yang lama. Proses pengeringan harus
 49

dilakukan dalam kondisi terkendali untuk menghindari terlalu banyak perubahan

kimia selama proses. Langkah selanjutnya adalah menggiling bahan tanaman untuk

meningkatkan ekstraksi selanjutnya. Proses ini secara signifikan meningkatkan luas

permukaan serta memfasilitasi penetrasi pelarut ke dalam sel tumbuhan (Azwanida,

2015).

Seperti disebutkan sebelumnya, ekstrak tumbuhan terdiri dari campuran zat

kompleks. Akibatnya, perawatan awal diperlukan untuk menghilangkan,

setidaknya, beberapa biomassa, kontaminan, atau bahan inert yang tidak diinginkan

dari tanaman yang akan diekstraksi. Ini juga membantu mencegah oksidasi

enzimatik atau hidrolisis yang terjadi, terutama ketika mengekstrak dari bahan

tanaman segar. Ini biasanya dicapai dengan merendam bahan tanaman dalam

alkohol dan dapat digunakan sebagai awal proses ekstraksi (Azwanida, 2015)

Bahan tanaman diekstraksi menggunakan prinsip ‘like dissolves like’.

Misalnya, pelarut nonpolar digunakan untuk mengekstrak senyawa lipofilik (alkana,

asam lemak, sterol, pigmen, lilin, beberapa terpenoid, alkaloid, dan kumarin),

sementara pelarut polar digunakan untuk mengekstrak senyawa polar (flavonoid,

glikosida, tanin, dan alkaloid) (Azwanida, 2015).

Untuk pembuatan ekstrak etanol tumbuhan, sekitar 1 kg material tanaman

diproses menjadi bubuk kemudian dimaserasi dengan 10 L etanol. Campuran

tersebut dibiarkan 6 hari dan diaduk kuat dua kali sehari. Setelah itu campuran

disaring, dan supernatan dikeringkan menggunakan vacuum rotary evaporator

pada 60oC (Arina & Rohman, 2015).

Ekstrak etanol difraksinasi menggunakan vacuum column chromatography

dengan fase stasioner silica gel dan eluen diberikan dengan cara gradien. Setiap
 50

eluat (100 mL) yang diperoleh kemudian diuapkan dan dikenakan profiling TLC

menggunakan silika gel F254 dengan fase gerak kloroform: metanol (9:1 v/v).

Eluat dengan profil TLC yang sama kemudian dikumpulkan dan ditetapkan

dengan fraksi. Setiap fraksi selanjutnya digunakan untuk uji pembilasan radikal

bebas DPPH, serta untuk penentuan kandungan fenolik dan flavonoid total (Arina

& Rohman, 2015).

2.5.1. Peran Meniran terhadap Kanker

Memahami pensinyalan sel pada kanker sangat penting dan dapat

memberikan target potensial bagi agen antikanker untuk menginduksi apoptosis

dan / atau menghambat metastasis dan angiogenesis tumor. Meniran menunjukkan

sitotoksisitas selektif pada sel kanker dan dapat menginduksi apoptosis yang

kemungkinan besar disebabkan oleh campuran senyawa bioaktif dalam tanaman

(Tang et al., 2014).

Agen kemoterapi yang berhasil harus dapat mengganggu lebih dari satu

fase proses karsinogenesis. Berbagai fitokimia telah terbukti hadir dalam diet kaya

buah dan sayuran, sehingga memiliki potensi untuk bertindak sebagai agen

kemopreventif. Komponen-komponen ini dapat dikelompokkan menjadi dua

kategori, tergantung apakah mereka memblokir kanker atau menekan kanker.

Obat penghambat kanker pada dasarnya menghentikan karsinogen dari

mendudukisel target mereka untuk menghindari proses inisiasi melalui beberapa

mekanisme, baik meningkatkan detoksifikasi karsinogen, memodifikasi

penyerapan dan metabolisme karsinogen, mencari spesies oksigen reaktif, atau

meningkatkan perbaikan DNA. Di sisi lain, agen penekan kanker menghentikan

promosi dan progresi kanker setelah pembentukan sel pra-neoplastik melalui

 51

gangguan regulasi siklus sel, transduksi sinyal, transkripsi, regulasi dan apoptosis

(Kotecha, 2016).

Gambar 2.19. Hubungan Meniran dengan Kanker (Tang et al., 2014)

2.5.2. Peran Meniran terhadap Apoptosis

Dalam beberapa tahun terakhir, banyak penelitian telah menunjukkan

bahwa disregulasi proses apoptosis terlibat dalam pengembangan transformasi

neoplastik dan pertumbuhan tumor. Induksi apoptosis pada sel tumor telah

terbukti menjadi mekanisme antikanker yang paling umum yang disatukan oleh

banyak terapi kanker. Sehingga, menemukan obat-obatan anti-tumor terapeutik

 52

potensial dengan efek apoptosis yang kuat dan selektif akan sangat bernilai

(Hassan et al, 2015).

Aktivasi apoptosis dapat dibagi menjadi empat fase, yaitu inisiasi,

eksekusi, degradasi dan fagositosis (CRC UGM, 2006; Sari, 2018). Apoptosis

dapat distimulasi oleh kondisi fisiologis dan patologis serta memegang peranan

penting dalam menjaga homeostasis normal dan patogenesis beberapa penyakit.

Sinyal untuk apoptosis terjadi melalui jalur caspase dependen dan independen

yang diawali oleh kejadian yang memicunya dari dalam sel atau dari luar sel

melalui ikatan reseptor kematian. (Sari, 2018).

Kaspase merupakan anggota keluarga dari protease cysteinyl spesifik

aspartat dan dapat diklasifikasikan menjadi dua kelas berdasarkan fungsinya:

kelompok I (kaspase inflamatorik yang terlibat dalam pematangan sitokin) dan

kelompok II. Kaspase kelompok II terlibat dalam regulasi apoptosis dan dibagi

lagi menjadi dua sub kelas: kaspase inisiator (2, 8, 9 dan 10) dan kaspase efektor

(3, 6 dan 7). Banyak komponen bioaktif telah ditemukan mempengaruhi aktivasi

kaspase seperti anthocyanin, coumarin, asam fenolik, tanin dan terpenoid. Asam

betulinic, lupeol dan malvidin yang terdapat di meniran menginduksi apoptosis

oleh aktivasi kaspase-3 (Xu et al., 2015).

Selain jalur caspase dependen, apoptosis juga dapat dipicu tanpa melalui

aktivitas caspase, yakni jalur caspase independen (Sari, 2018). Jalur independen

kaspase diprakarsai oleh protein seperti faktor-faktor yang menginduksi

apoptosis: cathepsin, calpains, protein pro-apoptosis bax/bid, protease serin dan

keluarga bcl-2. Bax memicu apoptosis yang dimediasi mitokondria, sementara

bcl-2 mencegah apoptosis dengan menjaga integritas mitokondria (Xu et al.,

 53

2015). Senyawa fenolik seperti anthocyanin, coumarin, asam fenolik dan

terpenoid telah terbukti menyebabkan penahanan siklus sel pada berbagai tahap,

yaitu, G1, S, S/G2, G1/G0, G2/M dan G1/S, dan juga melalui down regulation

faktor anti-apoptosis yang melibatkan Bcl-2, Bcl-xL dan aktivasi faktor pro-

apoptosis p53 dan Bax. Triterpenoid ditemukan menurunkan kadar Bcl-2,

menginaktivasi Bid dan meningkatkan ekspresi bax (li et al., 2018).

Efek dosis pemberian ekstrak genus meniran pada aktivitas apoptosis

telah dilakukan pada berbagai penelitian. Penelitian oleh Abhyankar et al (2010)

melaporkan adanya peningkatan signifikan dari sel apoptotik kanker payudara

pada dosis ekstrak meniran 400 μg/ml setelah 4 jam pemberian ekstrak

dibandingkan dengan dosis 200 μg/ml, hal ini menunjukkan bahwa hasil dari

pemberian ekstrak pada efek apoptosis bergantung kepada dosis yang diberikan.

Pada penelitian mengenai peningkatan apoptosis dan penurunan aktivitas

telomerase pada sel karsinoma nasofaring, pemberian ekstrak P. urinaria dengan

konsentrasi 1 mg/ml selama 48 jam dan 2 mg/ml selama 24 jam menyebabkan

penurunan jumlah sel sampai setengah dari jumlah sel kontrol (Kim et al, 2017).

Pemberian ekstrak meniran mencapai tingkat inhibisi kanker serviks

maksimal pada dosis 150 mg/ml. Dalam penelitian lebih lanjut, ektrak tersebut

dapat menghambat proliferasi sel kanker dengan menginduksi penghentian siklus

sel pada G2/M (Ordikhani et al, 2016). Pengobatan dengan menggunakan meniran

dapat menginhibisi pertumbuhan sel dan menginduksi apoptosis pada sel limfoma

dalton. Konsentrasi lebih dari 200 μg/mL ditemukan menginduksi perubahan

nekrotik. Konsentrasi antara 75 sampai 200 μg/mL bersifat apoptotik (Rajeskumar

et al, 2002).
 54

2.6. Kombinasi Terapi Induksi Apoptosis

Standar untuk mengidentifikasi sel punca kanker adalah kemampuan

sejumlah kecil sel untuk menghasilkan tumor ketika disuntikkan pada tikus

immunocompromised, tetapi masalah biaya, waktu, dan tenaga kerja yang terkait

dengan penelitian pada hewan telah menggeser fokus ke arah pencarian marker sel

punca kanker. Banyak penanda sel punca kanker telah diusulkan dan kemudian

diidentifikasi sebagai target untuk kemoterapi. Namun, ekspresi penanda ini telah

terbukti tidak konsisten di seluruh sel punca kanker dari fenotip tumor dan

jaringan yang berbeda. Selain itu, banyak penanda Sel Punca kanker yang

dilaporkan dimiliki oleh sel induk sehat dan bahkan non-kanker, menimbulkan

tantangan untuk pengembangan terapi dengan target penanda ini (Crabtree &

Miele, 2018).

IC50 merupakan suatu pengukuran yang bersifat kuantitatf tentang

seberapa banyak konsentrasi inhibitor yang dibutuhkan untuk menghambat suatu

komponen dari proses biologikal (seperti enzim, sel, maupun reseptor sel) sebesar

50% dari prosesnya. Kurkumin merupakan fitofarmaka yang saat ini

diperhitungkan sebagai obat anti kanker payudara. Kandungan kurkuma yang

diperhitungkan sebagai anti kanker yaitu : curcumin, demethoxycurcumin dan

bisdemethoxykurkumin (Hu S, et. al, 2017; Khosropanah MH, et. al, 2016; Liu

HT, et. al 2018).

Beberapa penitian yang melibatkan fitofarmaka tersebut menunjukkan

beberapa hasil seperti penambahan kurkuma sebagai cotreatment akan

menurunkan IC50 sebesar 50% bila dibandingkan dengan terapi tanpa adanya
 55

kurkuma. Penilitian lain juga menunjukkan bahwa curcumin yang terdapat pada

kurkuma berperan aktif sebagai antikanker payudara dengan ER (+). Selain dari

penelitian tersebut, ada penelitian yang menghasilkan bahwa seiring dengan

berjalannya waktu yaitu 24 jam, 48 jam, dan 72 jam curcuma menunjukkan

kecenderungan untuk dibutuhkan dosis lebih rendah dari sebelumnya untuk

mencapai inhibisi 50% yaitu 79,58 µg/ml, 53,18 µg/ml, dan 30,78 µg/ml (Hu S,

et. al, 2017; Khosropanah MH, et. al, 2016; Liu HT, et. al 2018).

Fitofarmaka lain yang dipertimbangkan sebagai antikanker payudara yaitu

meniran (Phyllanthus niruri). Kandungan dari meniran memiliki fungsi

menghambat sel kanker dengan sifatnya yang sitotoksik terhadap aktifitas T47D

terutama pada fase S siklus sel. Dari seluruh kandungan senyawa yang terdapat

pada meniran, flavonoid sudah pernah dibuat penlitiannya sebagai antikanker

payudara. Dari penelitian tersebut didapatkan IC50 flavonoid pada meniran

sebesar84,88±0,87 µg/ml(Jose J, et. al, 2014; Omar WA, et. al, 2018; Yuniati Y,

et.al 2019).

Kombinasi penanda sel punca kanker seharusnya diperlukan untuk

menunjukkan populasi sel punca kanker. Misalnya, populasi umum sel dalam

kanker payudara yang telah dianggap sel induk kanker payudara adalah

CD44+/CD24-/ESA+. Yang paling menonjol di antara penanda putatif ini adalah

protein permukaan CD44 dan CD133 yang telah digunakan untuk

mengidentifikasi sel punca kanker dalam beragam jenis kanker. Selain tanda-

tanda ini, sifat-sifat tertentu dari sel punca kanker juga telah digunakan untuk

membedakan mereka dari sisa populasi tumor. Sebagai contoh, sel-sel yang
 56

dikenal sebagai populasi samping telah terbukti memiliki persentase TIC yang

tinggi (Abba et al, 2016).

Induksi apoptosis menunjukkan efek proapoptotik sel punca kanker.

Namun, sel punca kanker memiliki etiologi dan patogenesis yang kompleks.

Untuk meningkatkan efek terpaeutik para ilmuwan menggabungkan beberapa

komponen untuk menginduksi apoptosis (He, 2015). Lapatinib merupakan

penghambat tirosin kinase sintetis dari epidermal growth factor receptor (EGFR)

dan human epidermal growth factor receptor tipe 2 (HER-2). Lapatinib secara

signifikan meningkatkan sensitivitas stem sel kanker terhadap obat kemoterapi

adjuvan. Kombinasi methylene blue (inhibitor aP-gp) dengan doxorubicin

meningkatkan apoptosis sel tumor dan menekan pertumbuhan tumor, secara

signifikan meningkatkan kelangsungan hidup BALB/c mencit yang mengandung

adenokarsinoma JC syngeneic. Vinorelbine dan parthenolide dikembangkan untuk

membasmi sel-sel kanker. Parthenolide secara signifikan meningkatkan

sitotoksisitas vinorelbine di MCF-7 stem sel kanker (He, 2015).

 57

2.7. Kerangka Teori

 58

Gambar 2.20. Kerangka Teori

Keterangan gambar 2.20: Terdapat beberapa jalur yang dapat menyebabkan proses suatu sel menjadi tidak terkendali sehingga menyebabkan progresi tumor yang
secara terus menerus yang akhirnya dapat meyebabkan kanker payudara. Adapunjalur tersebut adalah jalur hormonal, VGEF, TGF-, EGF dan ER-. Kemudian di
dalam sel kanker payudara terdapat populasi kecil sel yang diduga sebagai penyebab angka rekurensi yang tinggi dan resisten terhadap pengobatan kanker payudara
yang sudah ada (kemoterapi, radioterapi, targeting terapi, hormonal terapi) kecuali pembedahan. Populasi kecil tersebut dikenal sebagai sel punca kanker payudara,
dimana sel punca tersebut mempunya beragam pathway yang membuatnya self-renewal dan kemoresisten, diantaranya terdapat jalur IL-6, jalur Beta-catennin/Wnt,
jalur hipoksia, jalur NF-κB dan jalur anti-apoptosis. Terdapat pengobatan herbal yan secara teoritis mempunya efek anti kanker diantaranya curcumin dan meniran.
Dimana kedua herbal ini memiliki senyawa flavonoid yang diduga dapat menghambat mediator anti-apoptosis, merangsang apoptosis, menghambat jalur IL-6,
Beta-catenin/wnt dan jalur NF-κB
 59

2.8. Kerangka Konsep

Variabel bebas Variabel Antara Variabel terikat

Ekstrak Kurkumin dan Apoptosis dan

Survivin, P53,
Meniran Proliferasi SPK
Caspase-3, NF-
κB

Gambar 2.21. Kerangka Konsep

2.9. Hipotesis

2.9.1. Hipotesis Mayor

Kombinasi kurkumin (curcuma longa) dan meniran (phyllantus niruri)

dapat menginduksi apoptosis (caspase-3, p53, survivin) dan menginhibisi

proliferasi (NF-κB) pada sel punca kanker payudara (CD 44+/CD 24-) MDA-

MB231 in vitro.

2.9.2. Hipotesis Minor

1. Pemberian kombinasi ekstrak menginduksi kurkumin (curcuma longa) dan

meniran (phyllantus niruri) dapat menginduksi apoptosis (caspase-3, p53,

survivin) pada sel punca kanker payudara (CD 44+/CD 24-) MDA-MB231 in

vitro.

2. Pemberian kombinasi ekstrak menginduksi kurkumin (curcuma longa) dan

meniran (phyllantus niruri) dapat menginhibisi proliferasi (NF-κB) pada sel

punca kanker payudara (CD 44+/CD 24-) MDA-MB231 in vitro.

3. Pemberian dosis efektif kombinasi ekstrak menginduksi kurkumin (curcuma

longa) dan meniran (phyllantus niruri) dapat menginduksi apoptosis (caspase-

 60

3, p53, survivin) pada sel punca kanker payudara (CD 44+/CD 24-) MDA-

MB231 in vitro.

4. Pemberian dosis efektif kombinasi ekstrak menginduksi kurkumin (curcuma

longa) dan meniran (phyllantus niruri) dapat menginhibisi proliferasi (NF-κB)

pada sel punca kanker payudara (CD 44+/CD 24-) MDA-MB231 in vitro.
 BAB III

METODE PENELITIAN

3.1. Desain Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorik in vitro

menggunakan post-test dengan kelompok kontrol (post-test only control group

design) (Gambar 3.1.). rancangan ini digunakan untuk menganalisis pengaruh

ekstrak Kurkumin dan meniran pada kelompok penelitian dengan cara

membandingkan antara kelompok perlakuan dengan kontrol.

OE

Gambar 3.1. Skema Rancangan Penelitian Post-Test Only Control Group

Keterangan gambar 3.1:

S : Subyek penelitian: Sel punca kanker payudara
P1 : Perlakuan dengan pemberian ekstrak kurkumin dan meniran pada dosis
1: 1
P2 : Perlakuan dengan pemberian kurkumin dan meniran pada dosis 1: 2
P3 : Perlakuan dengan pemberian kurkumin dan meniran dosis 2 : 1
OA : Hasil pengukuran pada kelompok penelitian paska pemberian ekstrak
kurkumin dan meniran pada dosis 1: 1
OB : Hasil pengukuran pada kelompok penelitian paska pemberian ekstrak
kurkumin dan meniran pada dosis 1: 2
OC : Hasil pengukuran pada kelompok penelitian paska pemberian ekstrak
kurkumin dan meniran pada dosis 2 : 1
OD : Kontrol positif, yaitu sel punca di dalam DMSO
OE : Kontrol negatif, yaitu sel punca kanker payudara yang tidak diberi
perlakuan

61
 62

3.2. Tempat dan Waktu Penelitian

3.2.1. Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan di laboratorium Stem Cell and Cancer Research

Laboratory Universitas Islam Sultan Agung Semarang.

3.2.2. Waktu Penelitian

Penelitian, pengumpulan data dan penyusunan laporan dilakukan pada

bulan Januari sampai Desember tahun 2020.

3.3. Populasi dan Sampel Penelitian

3.3.1. Populasi

Populasi penelitian adalah Sel Punca Kanker payudara. Klon SPK

payudara didapatkan melalui proses gradual-sorting pada sel MDA-MB231

menggunakan teknik Magnetic Activated Cell Sorting (MACS) dengan microbead

CD44 dan CD24. Sel MDA-MB231 didapatkan dari European Collection of

Authenticated Cell Cultures (ECACC).

3.3.2. Sampel

Jumlah sampel dalam penelitian ini adalah empat kelompok sel punca

kanker payudara dengan replikasi sebanyak tiga kali pada tiap variabel nya.

Kelompok sel punca kanker payudara terdiri atas tiga perlakuan dan satu kontrol.

3.4. Kriteria

3.4.1. Kriteria Inklusi

Sel kanker payudara dengan karakteristik sebagai berikut :

1. Mengekspresikan CD44+/CD24-
 63

2. Mampu membentuk mammosphere dalam biakan sel

3. Sel dalam keadaan viabel dan mampu proliferasi.

3.4.2. Kriteria Eksklusi

1. Terjadi kontaminasi pada biakan sel punca kanker payudara

2. Terjadi pelepasan koloni sel dalam biakan sel punca kanker payudara

3.5. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

3.5.1. Variabel Penelitian

3.5.1.1. Variabel Bebas

1. Induksi sel punca dari cell line MDA-MB231

2. Ekstrak kurkumin dan meniran

3.5.1.2. Variabel Terikat

1. Kadar protein p53, survivin, caspase-3 dan NF-κB dari cell line MDA-

MB231.
 64

3.5.2. Definisi Operasional

Tabel 3.1 Definisi Operasional

Variabel Bebas
Definisi Cara Ukur Hasil Skala
Ukur Ukur
Sel Punca cell line MDA-MB231 yang Uji % Numerik
Kanker dikultur dan sudah divalidasi CD44+/CD24- viabilitas
Payudara dan sel
Immunofluoresce
nce
Ekstrak Kurkumin merupakan tanaman Ekstraksi μg/ml Numerik
kurkumin kunyit yang mengandung banyak
dan sumber kurkuminoid polifenolik,
meniran yaitu curcumin,
demethoxycurcumin, dan
bisdemethoxycurcumin.
Meniran adalah spesies dari
keluarga Euphorbiaceae yang
tumbuh hingga 60 cm.
Phyllanthus berarti "daun dan
bunga" karena bunga, serta
buahnya, tampaknya menyatu
dengan daun
Variabel Terikat
Definisi Cara Ukur Hasil Skala
Ukur Ukur
P53 Protein Bax adalah salah satu RT PCR Fold numerik
protein pro - apoptosis yang change
dikode oleh gen p53. Peningkatan
protein pro – apoptosis ini dapat
menghentikan siklus sel atau
menghidupkan jalur apoptosis dan
menjaga sel dari mutasi genetik
akibat kerusakan DNA.
Survivin Survivin adalah adalah anggota Flowcitometri Pg/mL Numerik
terkecil dari inhibitor of apoptosis
(IAP), yang memiliki peran kunci
dalam mengatur pembelahan sel
dan menghambat apoptosis
dengan menghalangi aktivasi
caspase
Caspase-3 Salah satu protein yang berperan Flowcitometri Relative Numerik
dalam proses apoptosis dari fluorescen
sediaan tumor. ce unit
(RFU)
NF-κB NF-κB adalah regulator RT PCR Fold Numerik
 65

penting peradangan dan respons change

imun. Selain itu, NF-κB juga
mengatur transkripsi gen target
yang meningkatkan kelangsungan
hidup dan proliferasi sel,
menghambat apoptosis, dan
berperan dalam invasi dan
metastasis.

3.6. Alat dan Bahan

3.6.1. Alat

1. 96-well plate (Iwaki) 13. oven

2. Mikropipet 200 μL, 1000 μL 14. autoklaf

3. Blue tip dan yellow tip 15. alat-alat gelas (Pyrex)

4. Bejana maserasi 16. tissue culture flask

5. Neraca analitik (Santorius), 17. 96-well plate (Iwaki)

6. Waterbath (Heidolp) 18. mikroskop

7. Mikroskop 19. mikropipet

8. Kertas saring 20. Laminar air flow (LAF)

9. Inkubator CO2 (Binder) (IsocideTM)

10. Flow cytometer 21. Conical tube

11. RT-PCR 22. Silika gel GF254

12. Biological safety cabinet 23. Pipa kapiler

3.6.2. Bahan
1. Sel punca kanker payudara MDA- 5. Reagen MTT 5mg/ml dalam PBS

MB 231 6. SDS 10% dalam 0,1 N HCl

2. Ekstrak kurkumin dan meniran 7. Etanol 96%

3. DMSO 1% dalam HCl 0,1 N 8. Media DMEM

4. Aquades 9. FBS 10%

 66

10. Penislin-streptomisin 15. Primer pcr,

11. PBS (phosphate buffer salin) 16. Ekstraction rna kit,

12. Tripsin-EDTA (tripsin 0.25%) 17. CDNA synthesis kit,

13. Apoptosis kit , 18. KAPA sybr fast PCR kit,

14. Cell cycle kit,

3.7. Cara Kerja

3.7.1. Ekstraksi Curcuma Longa dan Phyllantus Niruri

Bahan dari penelitian ini berupa herbal yaitu dari tanaman Curcuma

Longa dan Phyllantus Niruri, tanaman tersebut kemudian dibersihkan dengan air

mengalir hingga bersih, lalu masing-masing herbal dikeringkan pada tempat

yang tidak terkena sinar matahari langsung, setelah itu dirajang dan diserbukkan

(serbuk simplisia) (Malik, Edward, dan Waris, 2014; Azahar, Gani, dan

Mokhtar, 2017; Rusmana et al, 2017).

Serbuk simplisia ditimbang 300 gram kemudian dimasukkan dalam

wadah maserasi. Cairan pengekstraksi ethanol sebanyak 1 L dimasukkan

kedalam wadah maserasi, biarkan beberapa jam kemudian tambahkan 1 L

ethanol 70% hingga seluruh serbuk sampel terendam, lalu ditutup rapat. Wadah

maserasi disimpan pada tempat yang terlindungi dari cahaya matahari langsung

selama 5 hari sambil dilakukan pengadukan sesering mungkin. Campuran

kemudian disaring dan ampasnya direndam lagi dengan cairan penyari yang

baru. Proses penyarian selanjutnya dilakukan sebanyak 4 kali dengan ethanol

setiap kali sebanyak 2 L. Ekstrak cair dikumpulkan kemudian dipekatkan

dengan menggunakan alat Rotavapor hingga diperoleh ekstrak yang kental

 67

(Malik, Edward, dan Waris, 2014; Azahar, Gani, dan Mokhtar, 2017; Rusmana

et al, 2017).

3.7.2. Isolasi Sel Punca dari Cell Line MDA-MB231

Sel dikultur dalam kondisi berbeda dalam Dulbecco’s Modified Eagle’s

Medium (DMEM) dengan 10% Fetal Bovine Serum (FBS). Setelah tiga hari, saat

sel tersebut menutupi 90% dari plat nya, sel yang menempel dipisahkan dengan

inkubasi dalam 0.25% larutan trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid selama 1

menit pada suhu 37˚C.

Sel MDA-MB-231 dalam logarithmic growth phasedisusun 106, 105, 104dan

103sel/ml dalam DMEM/F12 (1:1) medium bebas serum mengandung 2% B27

(Gibco-BRL, Carlsbad, CA, USA), 20 ng/ml epidermal growth factor (EGF;

Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) dan 20 ng/ml basic fibroblast growth factor

(bFGF; Sigma-Aldrich). Sel dikultur dalam kondisi bebas serum sebagai kluster

mammosphere yang tidak menempel. Diferensiasi diinduksi dengan mengkultur sel

mammosphere selama 12 jam dalam DMEM yang diberikan 10% FBS (Huang et al,

2015).

3.7.3. Uji Sitotoksik

a. Ambil sel dari inkubator CO2 dan amati kondisi sel di bawah mikroskop inverted.

b. Hitung jumlah sel menggunakan hemositometer sesuai protokol perhitungan sel.

Jumlah sel yang dibutuhkan untuk uji sitotoksik dengan metode MTT assay

adalah 1x105 sel/ sumuran.

c. Tanam sel ke dalam 96 well plate, masing-masing 100 μl/ sumuran.

d. Inkubasi sel ke dalam inkubator CO2 selama semalam atau hingga sel konfluen

80%.
 68

e. Ambil 96 well plate dari incubator, dan amati kondisi sel di bawah mikroskop

inverted.

f. Cuci semua sumuran menggunakan PBS masing-masing 100 μl/sumuran.

g. Masukkan seri konsentrasi larutan uji (ekstrak kombinasi kurkumin dan meniran

dosis 0-1000 μg/ml) ke dalam sumuran sesuai peta MTT yang telah dibuat dan

menambahkan 0,2% DMSO untuk regimen kontrol.

h. Inkubasi sel dalam inkubator CO2 selama 24, 48,72 jam.

i. Buang media sel, cuci sel menggunakan PBS 1x, dan tambahkan reagen MTT

200 μl ke dalam setiap sumuran termasuk kontrol media.

j. Inkubasi sel selama 2-4 jam dalam inkubator CO2 hingga terbentuk formazan.

k. Periksa kondisi sel di bawah mikroskop inverted. Jika formazan telah jelas

terbentuk, tambahkan stopper 100 μl SDS 10% dalam 0,1 N HCl.

l. Bungkus plate menggunakan kertas alumunium foil dan inkubasikan di tempat

gelap pada temperatur kamar selama semalam.

m. Buka pembungkus plate dan tutup plate.

n. Masukkan 96 well plate ke dalam ELISA reader dan baca absorbansi masing-

masing sumuran menggunakan ELISA reader dengan λ =550-600 nm (595

nm).(CCRC, 2013)

3.8. Pengolahan dan Analisis Data

Pada penelitian ini, data yang diperoleh selanjutnya dikumpulkan,

dilakukan coding, cleaning, dan tabulasi, serta dianalisis secara statistik dengan

program software SPSS 24 serta disajikan dalam bentuk table, narasi, dan gambar.

Analisis data meliputi uji univariat dan bivariate.

 69

Teknik analisis data yang digunakan dari uji sitotoksik ekstrak kombinasi

kurkumin dan meniran dosis 0-1000 μg/ml, dihitung persen viabilitas sel dengan

menggunakan rumus:

(Absorbansi perlakuan-Absorbansi kontrol media) x 100%

% viabilitas sel = (Absorbansi perlakuan-Absorbansi kontrol media)

Kemudian hasil yang diperoleh dianalisis menggunakan perangkat lunak

SPSS 24 dengan uji One way ANOVA, karena pada penelitian ini sampel terdiri

dari beberapa kelompok yang berbeda dibandingkan dengan kontrol.

3.9. Etika Penelitian

Persetujuan Penelitian diperoleh dari komite etik penelitian kesehatan

Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara.

70
 71

3.10. Alur Penelitian

MDA-MB231 cell line Ekstraksi Kurkumin dan Meniran

Isolasi sel punca kanker

payudara

Validasi

CD 44+ / CD 24 - Immunofluorescence

Uji Sitotoksisitas Ekstrak (MTT

Assay) untuk mencari IC50

Dibagi menjadi 4 kelompok

I. Kontrol II. < IC50 III. IC50 II. > IC50

Analisa Survivin, P53, Caspase-3, NF-κB

Analisa Data

Hasil
 BAB IV

JADWAL DAN BIAYA PENELITIAN

4.1. Jadwal Penelitian

Jadwal penelitian disajikan dalam bagan berikut ini.

Tabel 4.1. Jadwal Penelitian

Bulan Ke Indikator Kinerja

No. Kegiatan
1 2 3 4
1. Proposal
2. Pengajuan kelayakan etik Surat persetujuan komisi etik
ke Komisi Etik FK USU untuk pelaksanaan penelitian
3. Isolasi sel punca kanker Isolated MDA-MB231 cancer
payudara sel punca serta bahan tersedia

4. Ekstraksi Kurkumin dan Ekstrak Kurkumin dan

Meniran Meniran dosis 0-1000 μg/ml.

5. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Memperoleh data IC50 setiap

(MTT Assay) kelompok

6. Analisis hasil penelitian Deskriptif, Komparatif nilai p

dan pembuatan laporan signifikan, dan R
hasil penelitian.
7. Ujian hasil penelitian
penyerahan disertasi
kepada Dosen Penguji.

4.2. Biaya Penelitian

Biaya yang diperlukan dalam penelitian ini adalah sebesar Rp.

357.300.000. Sumber dana penelitian adalah dana mandiri. Uraian penggunaan

dana penelitian dapat dilihat dalam Tabel 4.2.

72
 73

Tabel.4.2. Rencana Anggaran Dana Penelitian

No Uraian Jumlah @ Jumlah (Rp)

.
1. Isolasi Sel punca kanker 1 set Rp. 70.000.000 Rp. 70.000.000
payudara MDA-MB231
2. Cell Line MDA-MB231 1 kit Rp. 55.000.000 Rp. 55.000.000
3. Ekstrak Curcumin 1 set Rp. 5.000.000 Rp. 5.000.000
danMeniran
4. Reagen P53 1 kit Rp. 23.000.000 Rp. 23.000.000
5. Reagen Caspase 3 1 kit Rp. 22.500.000 Rp. 22.500.000
6. Reagen Survivin 1 kit Rp. 23.700.000 Rp. 23.700.000
7. Reagen NF-κB 1 kit Rp. 23.300.000 Rp. 23.300.000
8. Isolasi CD44+/CD24- 1 kit Rp. 31.000.000 Rp. 31.000.000
9. MagCellect Magnet 1 unit Rp. 29.800.000 Rp. 29.800.000
10. Ethical Clearence 1 buah Rp. 1.500.000 Rp.
11. Ongkos Kirim Reagen Rp. 35.000.000 1.500.000
12. Alat Tulis, Foto Kopi, Rp. 5.000.000 Rp. 35.000.000
Administrasi, Penggadaan Rp. 5.000.000
Proposal dan Desertasi
13. Biaya Tidak Terduga Rp. Rp. 10.000.000
10.000.000

Total Rp
334.800.000
 DAFTAR PUSTAKA

Abba, M. C., Zhong, Y., Lee, J., Kil, H., Lu, Y., Takata, Y., et al. (2016) DMBA
induced mouse mammary tumors display high incidence of activating
Pik3caH1047 and loss of function Pten mutations. Oncotarget, [Online]
7(39) Available from: doi:10.18632/oncotarget.11733

Abhyankar, G., Suprasanna, P., Pandey, B.N., Mishra, K.P., et al. (2010). Hairy
root extract of Phyllanthus amarus induces apoptotic cell death in human
breast cancer cells. Innovative Food Science and Emerging Technologies.
[Online] 11 (3), 526–532. Available from: doi:10.1016/j.ifset.2010.02.005.

Allison, K. H. (2012). Molecular pathology of breast cancer: what a pathologist

needs to know. American journal of clinical pathology, 138(6), 770-780.

Arina, N. B. dan Rohman, A., (2013). The Phenolic Contents and Antiradical
Activity of Indonesian Phyllantus urinaria L. International Food Research
Journal, 20: 1119–1124.

Aung, T., Qu, Z., Kortschak, R., dan Adelson, D. (2017). Understanding the
effectiveness of natural compound mixtures in cancer through their
molecular mode of action. International journal of molecular sciences,
[Online] 18(3), Available from: doi: 10.3390/ijms18030656.

Azahar, N. F., Gani, S.S.A, and Mokhtar, N.F. (2017). Optimization of phenolics
and favonoids extraction conditions of Curcuma Zedoaria leaves using
response surface methodology. Chemistry Central Journal; 11 (96). DOI
10.1186/s13065-017-0324-y

Azwanida (2015). A Review on the Extraction Methods Use in Medicinal Plants,

Principle, Strength and Limitation. Medicinal dan Aromatic Plants.
[Online] 04 (03), 3–8. Available from: doi:10.4172/2167-0412.1000196.

Bai, X., Ni, J., Beretov, J., Graham, P., dan Li, Y. (2018). Cancer stem cell in
breast cancer therapeutic resistance. Cancer treatment reviews, [Online]
69, 152-163. Available from: doi: 10.1016/j.ctrv.2018.07.004.

Banerjee, M., Singh, P. dan Panda, D. (2010) Curcumin suppresses the dynamic
instability of microtubules, activates the mitotic checkpoint and induces
apoptosis in MCF-7 cells. FEBS Journal. [Online] 277 (16), 3437–3448.
Available from: doi:10.1111/j.1742-4658.2010.07750.x.

Banik, U., Parasuraman, S., Adhikary, A.K. dan Othman, N.H. (2017) Curcumin :
the spicy modulator of breast carcinogenesis. [Online] 1–16. Available
from:doi:10.1186/s13046-017-0566-5.

74
 75

Braune, E.-B., Seshire, A. and Lendahl, U. (2018) Notch and Wnt Dysregulation
and Its Relevance for Breast Cancer and Tumor Initiation. Biomedicines,
[Online] 6(4), p. 101. Available from: doi: 10.3390/biomedicines6040101.

Chen, J. dan Chen, F.W.W. (2014) Modulation of apoptosis-related cell signalling

pathways by curcumin as a strategy to inhibit tumor progression. [Online]
Available from: doi:10.1007/s11033-014-3329-9.

Chen, X., Duan, N., Zhang, C., dan Zhang, W. (2016). Survivin and
Tumorigenesis: Molecular Mechanisms and Therapeutic Strategies.
Journal of Cancer, 7(3), 314–323. doi:10.7150/jca.13332

Chen, X., Ye, S. dan Ying, Q. L. (2015) Stem cell maintenance by manipulating
signaling pathways: Past, current and future. BMB Reports,
[Online]48(12), pp. 668–676. Available from: doi:
10.5483/BMBRep.2015.48.12.215.

Colleoni, M., Sun, Z., Price, K. N., Karlsson, P., Forbes, J. F., Thürlimann, B., et
al. (2016). Annual Hazard Rates of Recurrence for Breast Cancer During
24 Years of Follow-Up: Results From the International Breast Cancer
Study Group Trials I to V. Journal of Clinical Oncology, [Online] 34(9),
927–935. Available from: doi:10.1200/jco.2015.62.3504

Crabtree, J. S. dan Miele, L. (2018) Breast cancer stem cells. Biomedicines,

[Online] 6(77), pp. 133–151. Available from: doi: 10.1007/978-3-319-
41761-5_10.

Dai, X., Cheng, H., Bai, Z. dan Li, J. (2017) Breast cancer cell line classification
and Its relevance with breast tumor subtyping. Journal of Cancer. [Online]
8 (16), 3131–3141. Available from: doi:10.7150/jca.18457.

Denkert, C., Liedtke, C., Tutt, A. dan von Minckwitz, G. (2017) Molecular
alterations in triple-negative breast cancer—the road to new treatment
strategies. The Lancet. [Online] 389 (10087), 2430–2442. Available from:
doi:10.1016/S0140-6736(16)32454-0.

Du, G., Xiao, M., Yu, S., Wang, M., et al. (2018) Phyllanthus urinaria: a potential
phytopharmacological source of natural medicine. International Journal of
Clinical and Experimental Medicine. [Online] 11 (7), 6509–6520.
Available from: www.ijcem.com/.

Du, X., Klaschik, K., Mallmann, P., Isachenko, E., Rahimi, G., Zhao, Y., et al.
(2018). An Experimental Model of Breast Cancer Cells: Informative
Protocol for In Vitro Culture. Anticancer Research, 38(11), 6237–
6245.doi:10.21873/anticanres.12979

Endofit, K., Ranting, D., Daun, S., Akar, et al. (2010). Uji sitotoksisitas hasil
fermentasi isolat kapang endofit dari ranting. Universitas indonesia
 76

European College of Authenticated Cell cultures (2017) Cell line profile MDA-
MB-231. [Online] 231 (92020424), 1–3. Available from: https://www.phe-
culturecollections.org.uk/media/133182/mda-mb-231-cell-line-profile.pdf.

Eveline, K., Purwanto, H., Lestari, P. (2017). Faktor Klinis dan Histopatologi
serta Hubungannya dengan Kekambuhan Pascaoperasi pada Pasien Kanker
Payudara di RSUD Dr. Soetomo, Januari–Juni 2015. Indonesian Journal
of Cancer, 11 (2).

Feng, Y., Spezia, M., Huang, S., Liu, B., et al. (2018) ScienceDirect Breast cancer
development and progression : Risk factors , cancer stem cells , signaling
pathways , genomics , and molecular pathogenesis. Genes dan Diseases.
[Online] 5 (2), 77–106. Available from: doi:10.1016/j.gendis.2018.05.001.

Ferlay, J., Ervik, M., Lam, F., Colombet, M., Mery, L., Pineros, et al. (2018).
Global Cancer Observatory: Cancer Today. Lyon, France; International
Agency for Reserch on Cancer. Available from: http://gco.iarc.fr/today,
[accessed 18th April 2019]

Gera, M., Sharma, N., Ghosh, M., Huynh, D.L., et al. (2017) Nanoformulations of
curcumin: an emerging paradigm for improved remedial application.
Oncotarget. [Online] 8 (39), 66680–66698. Available from:
doi:10.18632/oncotarget.19164.

He, Y.C., Zhou, F.L., Shen, Y., Liao, D.F., et al. (2014) Apoptotic death of cancer
stem cells for cancer therapy. International Journal of Molecular Sciences.
[Online] 15 (5), 8335–8351. Available from: doi:10.3390/ijms15058335.

Hongmei, Z. (2012) Extrinsic and Intrinsic Apoptosis Signal Pathway Review.

Apoptosis and Medicine. [Online] 3–22. Available from: doi:10.5772/50129.

Hu S, et.al. (2017). Curcumin Inibits Proliferation and Promotes Apoptosis of Breast

Cancer Cells. Experimental and Therapeutic Medicine

Iannolo, G., Conticello, C., Memeo, L. dan De Maria, R. (2008) Apoptosis in normal
and cancer stem cells. Critical Reviews in Oncology/Hematology. [Online] 66
(1), 42–51. Available from: doi:10.1016/j.critrevonc.2007.09.004.

Jeong, Y., Kim, S.S., Gong, G., Lee, H.J., et al. (2013) Treatment results of breast
cancer patients with locoregional recurrence after mastectomy. Radiation
Oncology Journal. 31 (3), 138–146. Available from:
doi:10.3857/roj.2013.31.3.138.

Jose J, et. al. (2014). A Comparative Evaluation of Anticancer Activities of

Flavonoids Isolated From Mimosa Pudica, Aloe Vera and Phyllanthus
Niruri Againts Human Breast Carcinoma Cell Line (MCF-7) Using MTT
Assay. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences
 77

Kabel, A.M. dan Baali, F.H. (2015) Breast Cancer: Insights into Risk Factors,
Pathogenesis, Diagnosis and Management. Journal of Cancer Research
and Treatment, Vol. 3, 2015, Pages 28-33. [Online] 3 (2), 28–33.
Available from: doi:10.12691/JCRT-3-2-3.

Kadam, C.Y. dan Abhang, S.A. (2016) Apoptosis Markers in Breast Cancer
Therapy. 1st edition. [Online]. Elsevier Inc. Available from:
doi:10.1016/bs.acc.2015.12.003.

Kamruzzaman, H. dan Hoq, O. (2016). A review on ethnomedicinal ,

phytochemical and pharmacological properties of Phyllanthus niruri. 4
(6), 173–180.

Kardinan, A. dan Kusuma, F. R. (2004). Hidup sehat secara Alami. Dalam:

Meniran Penambah Daya Tahan Tubuh Alami. Cet.1. Jakarta: Agro Media
Pustaka. h. 5-14, 16, 20.

Kementrian Kesehatan Republik Indonesia (2019) Hari Kanker Sedunia.

Available from: www.depkes-go.id/artikel/view/19020100003/hari-
kanker-sedunia-2019.html [Accessed 19th Mei 2019]

Khosropanah MH, et. al. (2016). Analysis of The Antiproliferative Effects of

Curcumin and Nanocurcumin in MDA-MB231 As A Breast Cancer Cell
Line. Iranian Journal of Pharmaceutical Research

Kim, Y.D., Jang, S.J., Lim, E.J., Ha, J.S., et al. (2017) Induction of telomere
shortening and cellular apoptosis by sodium meta-arsenite in human
cancer cell lines. Animal Cells and Systems. [Online] 21 (4), 241–254.
Available from: doi:10.1080/19768354.2017.1342691.

Kontomanolis, E. N., Kalagasidou, S., Pouliliou, S., Anthoulaki, X., Georgiou, N.,
Papamanolis, V., dan Fasoulakis, Z. N. (2018). The notch pathway in
breast cancer progression. The Scientific World Journal, [Online].
Available from: doi: 10.1155/2018/2415489.

Kotecha, R., Takami, A. dan Espinoza, J.L. (2016) Dietary phytochemicals and
cancer chemoprevention: a review of the clinical evidence. Oncotarget.
[Online] 7 (32). Available from: doi:10.18632/oncotarget.9593.

Koury, J., Zhong, L., dan Hao, J. (2017). Targeting signaling pathways in cancer
stem cells for cancer treatment. Stem cells international, [Online]
Available from: https://www.hindawi.com/journals/sci/2017/2925869/abs/.

Kurniawan, A., dan Prayogo, N. (2012). Tata Laksana Kanker Payudara Relaps
Laksana Kanker Payudara Relaps. Indonesian Journal of Cancer, 6(2), 87.
 78

Leclerc, A.F., Jerusalem, G., Devos, M., Crielaard, J.M., et al. (2016)
Multidisciplinary management of breast cancer. Archives of Public Health.
[Online] 74 (1), 1–6. Available from: doi:10.1186/s13690-016-0163-7.

Lee, W., Loo, C., Bebawy, M., Luk, F., et al. (2013) Curcumin and its
Derivatives : Their Application in Neuropharmacology and Neuroscience
in the 21 st Century. 338–378.

Li, W., Yang, H., Li, X., Han, L., Xu, N., dan Shi, A. (2019). Signaling pathway
inhibitors target breast cancer stem cells in triple-negative breast cancer.
Oncology reports, [Online] 41(1), pp. 437–446. Available from: doi:
10.3892/or.2018.6805.

Li, X., Wang, X., Xie, C., Zhu, J., et al. (2018) Sonic hedgehog and Wnt / β -
catenin pathways mediate curcumin inhibition of breast cancer stem cells.
[Online] 1–8. Available from: doi:10.1097/CAD.0000000000000584.

Li, Y., Ma, X., Wu, X., Liu, X., dan Liu, L. (2014). Prognostic Significance of
Survivin in Breast Cancer: Meta-analysis. The Breast Journal, 20(5), 514–
524. doi:10.1111/tbj.12303

Lin, S. C., Gan, Z. H., Han, K., You, Y., dan Min, D. L. (2015). Interleukin-6 as a
prognostic marker for breast cancer: a meta-analysis. Tumori 2015. 101(5):
535-541. DOI: 10.5301/tj.5000357

Liu HT, et. al (2018). Anticancer Effect of Curcumin on Breast Cancer and Stem
Cells. Elsevier

Liu, H.-T. dan Ho, Y.-S. (2018).Anticancer effect of curcumin on breast cancer
and stem cells. Food Science and Human Wellness. [Online] 7 (2), 134–
137. Available from: doi:10.1016/j.fshw.2018.06.001.

Lv, Z. D., Liu, X. P., Zhao, W. J., Dong, Q., Li, F. N., Wang, H. B., dan Kong, B
(2014) Curcumin induces apoptosis in breast cancer cells and inhibits
tumor growth in vitro and in vivo, International Journal Of Clinical And
Experimental Pathology, 7(6), pp. 2818–2824.

Makki, J. (2015). Diversity of Breast Carcinoma: Histological Subtypes and

Clinical Relevance. Clin Med Insights Pathol. 8: 23-31.

Malhotra, G. K., Zhao, X. , Band, H., Band, V. (2010). Histological, molecular

and functional subtypes of breast cancers. Cancer Biol. Ther. 10: 955-960.

Malik, A., Edward, F., dan Waris, R. (2014). Skrining Fitokimia Dan Penetapan
Kandungan Flavonoid Total Ekstrak Metanolik Herba Boroco. Jurnal
Fitofarmaka Indonesia. 1(1).
 79

Mao, X., Wu, L.-F., Guo, H.-L., Chen, W.-J., et al. (2016) The Genus
Phyllanthus : An Ethnopharmacological, Phytochemical, and
Pharmacological Review . Evidence-Based Complementary and
Alternative Medicine. [Online] 2016, 1–36. Available from:
doi:10.1155/2016/7584952.

Mohan, H. (2010). Textbook of Pathology Sixth Edition. Jaypee Brothers Medical

Publishers. New Delhi.

Mokhtari, R.B., Homayouni, T.S., Baluch, N., Morgatskaya, E., et al. (2017)
Combination therapy in combating cancer. Oncotarget. [Online] 8 (23),
38022–38043. Available from: doi:10.18632/oncotarget.16723.

Mukherjee, S., Mazumdar, M., Chakraborty, S., Manna, A., et al. (2014)
Curcumin inhibits breast cancer stem cell migration by amplifying the E-
cadherin / β -catenin negative feedback loop. 1–19.

Muthiah (2015). Empowerment and understanding of community toward family

medicines in Nurul Khasanah District Malang, Pp 3-5.

Nalla, L. V., Kalia, K. dan Khairnar, A. (2019) Self-renewal signaling pathways

in breast cancer stem cells, International Journal of Biochemistry and Cell
Biology. Elsevier Ltd, 107(1), [Online] pp. 140–153. Available from: doi:
10.1016/j.biocel.2018.12.017.

Nisar, M.F., He, J., Ahmed, A., Yang, Y., et al. (2018) Chemical components and
biological activities of the genus phyllanthus: A review of the recent
literature. Molecules. [Online] 23 (10). Available from:
doi:10.3390/molecules23102567.

Omar WA, et. al. (2018). Therapeutic Index of Methanolic Extracts of Three
Malaysian Phyllanthus Species on MCF-7 and MCF-10A Cell Lines.
Pharmacognosy Journal

Ordikhani, F., Arslan, M.E., Marcelo, R., Sahin, I., et al. (2016) Drug delivery
approaches for the treatment of cervical cancer. Pharmaceutics. [Online] 8
(3), 1–15. Available from: doi:10.3390/pharmaceutics8030023.

Panahi, Y., Fazlolahzadeh, O., Atkin, S.L., Majeed, M., et al. (2019) Evidence of
curcumin and curcumin analogue effects in skin diseases: A narrative
review. Journal of Cellular Physiology. [Online] 234 (2), 1165–1178.
Available from: doi:10.1002/jcp.27096.

Puspitarini, S., Widodo, Lestari, N.D., Rifai, M., (2019). Exploring of Cheral
Potensial as Anticancer Agent via Apoptosis Mechanism. AIP Conference
Proceedings. Available from: https://doi.org/10.1063/1.5125553.
 80

Radzi, M., Hassan, A., Raihan, N., Mustapha, N., et al. (2017) Efficacy and Safety
of Phyllanthus Niruri in Non-alcoholic Steatohepatitis Treatment : Pilot
Study from Malaysia. 3 (3), 131–137.

Rajeskumar, N. V., Joy, K.L., Kuttan, G., Ramsewak, R.S., et al. (2002)
Antitumour and anticarcinogenic activity of Phyllanthus amarus extract.
Journal of Ethnopharmacology. [Online] 81 (1), 17–22. Available from:
doi:10.1016/S0378-8741(01)00419-6.

Riskesdas (2018) Laporan Nasional Riskesdas. Badan Penelitian dan

Pengembangan Penelitian Kesehatan 2019.

Rusmana, D. et al (2017). Antioxidant of Phyllantus niruri Extract, Rutin, and

Quercetin. Indones Biomed J; 9(2): 84-90. DOI: 10.18585/inabj.v9i2.281

Sari, L. M. (2018). Apoptosis: Molecular Mechanisms of Cellular Death.

Cakradonya Dent J; 10(2): 65-70. 10 (2), 65–70.

Schacter, J.L., Henson, E.S. dan Gibson, S.B. (2014) Estrogen Regulation of Anti-
Apoptotic Bcl-2 Family Member Mcl-1 Expression in Breast Cancer Cells.
[Online] 9 (6), 1–12. Available from: doi:10.1371/journal.pone.0100364.

Soeprijanto, B. dan Assegaf, J. H. (2014) Protective effect and antitumor effect of

Phyllanthus meniran extract on DMBA-induced breast cancer in irradiated
rats, Indian Journal of Applied Research, [Online] 4(5), pp. 440–442.
Available from: doi: 10.15373/2249555x/may2014/135.

Spronk, I., Schellevis, F.G., Burgers, J.S., Bock, G.H. De, et al. (2018) Incidence
of isolated local breast cancer recurrence and contralateral breast cancer :
A systematic review. The Breast. [Online] 39, 70–79. Available from:
doi:10.1016/j.breast.2018.03.011.

Tang, Y., Jaganath, I., Manikam, R. dan Sekaran, S.D. (2014) Inhibition of
MAPKs , Myc / Max , NF-κB, and Hypoxia Pathways by Phyllanthus
Prevents Proliferation , Metastasis and Angiogenesis in Human Melanoma
( MeWo ) Cancer Cell Line. [Online] (April). Available from:
doi:10.7150/ijms.7704.

Vallianou, N.G., Evangelopoulos, A., Schizas, N. dan Kazazis, C. (2015)

Curcumin and Sp-1. 652, 645–651.

Vanmaaren, M. C., Munck, L. D., Strobbe, L. J., Sonke, G. S., Westenend, P. J.,
Smidt, M. L., et al. (2018).10-year recurrence rates for breast cancer
subtypes in the Netherlands: a large population-based study. Internationa
journal of cancer. 144 (2). https://doi.org/10.1002/ijc.31914

Weigelt, B. dan Reis-Filho, J. S. (2009). Histological and molecular types of

breast cancer: is there a unifying taxonomy?. Clin. Oncol. 6: 718-730.
 81

Widyastuti, R., Adi, M.B.S. dan Listyana, N.H. (2008) Karakterisasi morfologi
dan fitokimia tanaman meniran (Phyllanthus niruri L.). [Online] 109–113.
Available from: http://jurnal.fp.uns.ac.id/ index.php/semnas
/article/download/953/639.

Wong, F. Y., Tham, W. Y., Nei, W. L., Lim, C., and Miao, H. (2018). Age exerts
a continuous efect in the outcomes of Asian breast cancer patients treated
with breast-conserving therapy. Cancer Communications. 38 (39).
https://doi.org/10.1186/s40880-018-0310-3

Wong, R.S.Y. (2011) Apoptosis in cancer: From pathogenesis to treatment.

Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30 (1), 87.
Available from: doi:10.1186/1756-9966-30-87.

Yin, P., Wang, W., Zhang, Z., Bai, Y., Gao, J., dan Zhao, C. (2018). Wnt
signaling in human and mouse breast cancer: Focusing on Wnt ligands,
receptors and antagonists, Cancer Science, [Online] 109(11), pp. 3368–
3375. Available from: doi: 10.1111/cas.13771.

Yuniati Y, et al. (2019). Discovering anticancer compound of Ethyl acetate

Extract from RL1 Code Endophytic Fungi Culture Derived by Phyllanthus
Niruri Linn Leaves Through Cell Cycle Modulation in T47d Cells

Zeng, X. dan Ju, D. (2018). Hedgehog Signaling Pathway and Autophagy in

Cancer, International Journal of Molecular Sciences, [Online] 19(8), p.
2279. Available from: doi: 10.3390/ijms19082279.

Zhou H et al. (2012). Targets of curcumin. 12 (3), 332–347.

Zhu, D., Shen, Z., Liu, J., Chen, J., Liu, Y., Hu, C., et al. (2016) The ROS-
mediated activation of STAT-3/VEGF signaling is involved in the 27-
hydroxycholesterol-induced angiogenesis in human breast cancer cells,
Toxicology Letters. Elsevier Ireland Ltd, [Online] 264, pp. 79–86.
Available from: doi: 10.1016/j.toxlet.2016.11.006.