Spektrofotometer merupakan alat yang digunakan untuk mengukur absorbansi dengan cara melewatkan

cahaya dengan panjang gelombang tertentu pada suatu objek kaca atau kuarsa yang disebut kuvet.[1]
Sebagian dari cahaya tersebut akan diserap dan sisanya akan dilewatkan.[2] Nilai absorbansi dari cahaya
yang dilserap sebanding dengan konsentrasi larutan di dalam kuvet

Spektrofotometer dibagi menjadi dua jenis yaitu spektrofotometer single-beam dan spektrofotometer
double-beam.[3] Perbedaan kedua jenis spektrofotometer tersebut hanya pada pemberian cahaya, di
mana pada single-beam, cahaya hanya melewati satu arah sehingga nilai yang diperoleh hanya nilai
absorbansi dari larutan yang dimasukan.[3] Berbeda dengan single-beam, pada spektrofotometer
double-beam, nilai blanko dapat langsung diukur bersamaan dengan larutan yang diinginkan dalam satu
kali proses yang sama.[3] Prinsipnya adalah dengan adanya chopper yang akan membagi sinar menjadi
dua, di mana salah satu melewati blanko (disebut juga reference beam) dan yang lainnya melewati
larutan (disebut juga sample beam).[4] Dari kedua jenis spektrofotometer tersebut, spektrofotometer
double-beam memiliki keunggulan lebih dibanding single-beam, karena nilai absorbansi larutannya telah
mengalami pengurangan terhadap nilai absorbansi blanko.[5] Selain itu, pada single-beam, ditemukan
juga beberapa kelemahan seperti perubahan intensitas cahaya akibat fluktuasi voltase.[5]

a b (Inggris) Caprette DR. 2005. Experimental Bioscience [terhubung berkala].

http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/protein/spectrophotometer.html [22 Agu 2009].

^ a b (Inggris) Csuros M. 1997. Environmental Sampling and Analysis Lab Manual. CRC Press. Hal. 23-27.

^ a b c (Inggris) Vallvey LFC, Fernandez MD, de Orbe I, Vilchez JL, Avidad R. 1997. Simultaneous
determination of the colorants sunset yellow FCF and quinoline yellow by solid-phase
spectrophotometry using partial least squares multivariate calibration. Analyst 122:351-354.

^ (Inggris) Roe S. 2001. Protein Purification Techniques: A Practical Approach. Oxford: Oxford University
Press. Hal. 54-67.

^ a b (Inggris) Wei YJ, Li KA, Tong SY. 1997. A linear regression method for the study of the coomassie
brilliant blue protein assay. Talanta 44(5): 923-930.

Jenis-jenis spektrofotometer

1) Spektrofotometri UV (Ultraviolet)

Berbeda dengan spektrofotometri visible, pada spektrofotometri UV berdasarkan interaksi sampel

dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Sebagai sumber sinar dapat
digunakan lampu deuterium. Karena sinar UV tidak dapat dideteksi dengan mata kita, maka senyawa
yang tidak memiliki warna atau bening dan transparan.

2) Spektrofotometri Visible (Spektro Vis)

Pada spektofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar atau energi adalah cahaya tampak
(visible). Cahaya visible termaksud spectrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia.
Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sampel yang dapat dianalisis dengan
metode ini hanya sampel yang memiliki warna. Hal ini menjadi kelemahan tersendiri dari metode
spektrofotometri visible.

3) Spektrofotometri UV Visible

Spektrofotometri UV-Vis adalah pengukuran panjang gelombang dan intens sinar ultraviolet dan cahaya
tampak yang diabsorbsi oleh sampel. Sinar ultraviolet dan cahaya tampak memiliki energi yang cukup
untuk mempromosikan elektron pada kulit terluar ketingkat energi yang lebih tinggi. Sinar ultraviolet
berada pada panjang gelombang 200-400 nm sedangkan sinar visible berada pada panjang gelomang
400-800 nm.

Metode spektrofotometri UV-Vis digunakan untuk menetapkan banyak jenis bahan obat. Cara untuk
menetapkan kadar sampel adalah dengan membandingkan absorbansi sampel dengan absorban baku,
atau dengan menggunakan persamaan regresi linier yang menyatakan hubungan antara konsentrasi baku
dengan absorbansi dan selanjutnya digunakan untuk menghitung kadar sampel

Cara Menggunakan Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometer UV-Vis merupakan gabungan antara spektrofotometer UV dan Vis (Visible).

Spektrofotometer ini dapat digunakan untuk sampel berwarna dan sampel tak berwarna.

Berikut ini akan dijelaskan tahapan-tahapan penggunaan spektrofotometer UV-Vis.

Merk spektrofotometer: UV mini-1240, SHIMADZU CORPORATION, Japan

1. Hubungkan alat dengan arus listrik

2. Nyalakan alat (biasanya di bagian belakang alat)

3. Tunggu selama 30 menit (sampai semua tampilan di layar menunjukkan OK)

4. Sambil menunggu 30 menit, siapkan alat-alat sebagai berikut:

- Sampel

- Buku/kertas catatan + alat tulis

- Aquades untuk membilas

- Tempat buangan aquades

- Tisu

· Setelah 30 menit, tahapan yang dilakukan adalah sebagai berikut:

1. Tekan angka 1 (pilih menu Photometric)

2. Tekan tombol Go To WL (Wavelength) untuk mengatur panjang gelombang

3. Tekan tombol angka-angka sesuai panjang gelombang yang diinginkan

4. Tekan Enter

5. Tekan tombol autozero untuk mengnolkan (0) angka yang tertera pada layar

6. Cuci kuvet dengan aquades (setelah dicuci dilap dengan tisu secra searah)

7. Isi kuvet dengan pelarut yang digunakan pada sampel yang akan diukur (misal: aquades, etanol)

8. Taruh kuvet di tempat pembacaan absorbansi

9. Setelah muncul angkanya di layar, tekan tombol autozero untuk mengnolkan (kalibrasi)

10. Cuci kembali kuvet dan dilap

11. Isi kuvet dengan blanko

12. Lakukan pembacaan absorbansi

13. Cuci kuvet dan dilap

14. Isi kuvet dengan sampel 1

15. Lakukan pembacaan absorbansi

16. Cuci kuvet dan dilap

17. Isi kuvet dengan sampel selanjutnya

18. Tiap ganti sampel, ulangi poin 16

· Cara mematikan spektrofotometer:

1. Tekan tombol autozero

2. Tekan tombol return

3. Matikan tombol di belakang alat

4. Cabut kabelnya

Tujuan kalibrasi

Agar alat spektrofotometer dapat digunakan dengan baik (menghasilkan data yang handal dan valid) dan
awet

Untuk mengetahui letak kesalahan atau kerusakan secara dini sehingga dapat diperbaiki sebelum alat
mengalami kerusakan berat

Sesuat persyaratan ISO/IEC 17025 (klausal 5.5)

Definisi IUPAC

Absorpsi: Proses suatu bahan (absorbat) diretensi oleh bahan lain (absorben); ini dapat berupa larutan
fisik gas, cairan, atau padatan dalam cairan, pengikatan molekul suatu gas, uap, cairan, atau pelarutan
bahan pada permukaan padatan melalui gaya fisika, dll. Dalam spektrofotometri, absorpsi cahaya pada
panjang gelombang tertentu digunakan untuk mengidentifikasi sifat kimia suatu molekul, atom atau ion
dan untuk mengukur konsentrasi spesies-spesies ini.

Daun muda

Daun muda dari Amaranthus sp umumnya memiliki warna yang lebih muda dibandingkan dengan daun
setengah tua dan daun dewasa serta memiliki kandungan klorofil yang berbeda-beda. Setelah dilakukan
pengukuran terhadap konsentrasi klorofilnya pada tabel 2 diperoleh klorofil a sebesar 3,95386 mg/l dan
klorofil b sebesar 4,90592 mg/l. adapun klorofil totalnya adalah 4,32812 mg/l. Hal ini menunjukan
bahwa jumlah klorofil terbanyak pada daun muda adalah klorofil b.

Daun muda

Daun muda dari Amaranthus sp umumnya memiliki warna yang lebih muda dibandingkan dengan daun
setengah tua dan daun dewasa serta memiliki kandungan klorofil yang berbeda-beda. Setelah dilakukan
pengukuran terhadap konsentrasi klorofilnya pada tabel 2 diperoleh klorofil a sebesar 3,95386 mg/l dan
klorofil b sebesar 4,90592 mg/l. adapun klorofil totalnya adalah 4,32812 mg/l. Hal ini menunjukan
bahwa jumlah klorofil terbanyak pada daun muda adalah klorofil b.

Dengan menggunakan cuvet, Optica Dencity (OD) diukur dari ekstrak dengan menggunakan panjang
gelombang 663 nm dan 645 nm. Konsentrasi klorofil dapat dihitung dengan rumus Arnon (1949) dengan
membandingkan OD pada 663 nm dan 645 nm dalam sel yang tebalnya 1 cm dengan menggunakan
koefisien absorbsi spesifik yang telah ditentukan oleh Mac Kinner (1941) sebagai berikut :

Klorifil total (mg/l) = 20,2 D645 + 0.02 D663

Klorofil a = 12,7 D663 + 2,69 D645

Klorofil b = 22,9 D645 + 0,02 D663

Metode pengujian yang dilakukan pada praktikum ini adalah metode sptektrofotometri menggunakan
alat spektrofotometer dengan panjang gelombang 645 nm dan 663 nm. Pemilihan panjang gelombang
didasarkan pada sifat klorofil yang banyak menyerap sinardengan panjang gelombang 400 – 700 nm.
Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu.

Prinsip kerjanya adalah menentukan kadar klorofil dengan spektrum cahaya (panjang gelombang)
tertentu yang dipancarkan ke molekul klorofil didalam alat tersebut. Senyawa tertentu hanya menyerap
foton yang bersesuaian dengan panjang gelombang tertentu dan oleh karena itu setiap pigmen memiliki
spektrum absorbsinya yang unik. Klorofil a dan klorofil b karena memiliki absorbsi spektrumnya yang
kuat pada kisaran panjang gelaobang 600-700 nm. Klorofil-a (C55H72O5N4Mg) yang berwarna hijau tua
dan klorofil-b (C55H70O6N4Mg) yang berwarna hijau muda. Klorofil-a dan b paling kuat menyerap
cahaya di bagian merah (600-700 nm), sedangkan yang paling sedikit cahaya hijau (500-600 nm).