LAPORAN PRAKTIKUM KIMIA KLINIK

SPEKTROFOTOMETRI UV-VISIBLE

ASISTEN : FAIZAL HERMANTO S.Si.M,Si.Apt

KELOMPOK VI A
ANGGOTA :
- TUBAGUS GITA PERMANA / 3311131007
- SOFI APRILIANTI / 3311131016
- MOH TAUFIK H MUGNI / 3311131022
- DIANA KRISKA / 3311131027
- SITI FATIMAH / 3311131040
- TASHA AYU R / 3311131041

LABORATORIUM KIMIA KLINIK1

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS JENDERAL ACHMAD YANI

1
 CIMAHI 2016
BAB I
PENDAHULUAN

1.1 PRINSIP PERCOBAAN

Berdasarkan penyerapan (absorsi) energy sinar oleh molekul molekul tereksitasi
dalam daerah ultra violet dan visible.
Reaksi antara sisa hydrogen peroksida dengan aseptor oksigen seperti
amonofernazon.

1.2 TUJUAN PERCOBAAN

Membuat kurva kalibrasi.
Menentukan kadar secara spektrofotometri.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Spektrofotometri UV-Visible

 Spektrofotometri sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri
dari spektrometer dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar
dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer
adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang
diabsorpsi. Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi
secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan atau
diemisikan sebagai fungsi sebagai panjang gelombang. Kelebihan
spektrofotometer dengan fotometer adalah panjang gelombang dari
sinar putih dapat lebih dideteksi dan ini diperoleh dengan alat pengurai
seperti prisma, grating atau celah optis. Pada fotometer filter dari
berbagai warna yang mempunyai spesifikasi melewatkan trayek
panjang gelombang tertentu. (Gandjar, 2007)
Spektrum elektromagnetik dibagi dalam beberapa daerah cahaya.
Suatu daerah akan diabsorpsi oleh atom atau molekul, dan panjang
gelombang cahaya yang diabsorpsi dapat menunjukkan struktur
senyawa yang diteliti. Spektruk elektromagnetik meliputi suatu daerah
panjang gelombang yang luas dari sinar gamma gelombang pendek
berenergi tinggi sampai pada pada panjang gelombang mikro dan
panjang gelombang sangat penting (Marzuki, 2012.)
Sinar tampak dari 400 sampai 800 nm dan sinar UV yang
berbatasan sekitar 250 sampai 400 nm akan diabsorpsi oleh elektron
terliar molekul dan atom spektroskopi absorbsi dalam bidang ini
disebut spektroskopi elektron. Pada penentuan fotometer nyala logam
alkali dan alkali tanah, emisi cahaya juga diukur dalam daerah sinar
tampak dan sinar ultraviolet. (Marzuki, 2012.)
Spektrum absorbsi dalam daerah-daerah ultra ungu dan sinar
tampak umumnya terdiri dari satu atau beberapa pita absorpsi yang
lebar, semua molekul dapat menyerap radiasi dalam daerah UV-
tampak. Oleh karena itu mereka mengandung elektron, baik yang
dipakai bersama atau tidak, yang dapat dieksitasi ke tingkat yang lebih
tinggi. Panjang gelombang pada waktu absorpsi terjadi tergantung
pada bagaimana erat elektron terikat di dalam molekul. Elektrton
dalam satu ikatan kovalen tunggal erat ikatannya dan radiasi dengan
energi tinggi, atau panjang gelombang pendek, diperlukan untuk
eksitasinya. (Wunas, 2011)
 Adapun mekanisme kerja dari spektrofotometer adalah mula-mula
sumber radiasi dari berbagai macam sinar tanda () yang berbeda-
beda, masuk ke dalam monokromator. Di monokromator ini cahaya
diubah dari cahaya polikromatik menjadi monokromatik, jadi sinar
yang ada pada monokromator sudah ada tertentu. Kemudian dari
monokromator sinar menembus kuvet atau sampel dimana sampel
telah dilarutkan dengan pelrut yang sesuai, yaitu pada percobaan kali
ini memakai pelarut etanol. Di kuvet ini, ada cahaya yang diserap oleh
sampel (absorban) dan ada yang diteruskan disebut transmitan.
( Marzuki, 2012.)
Pengukuran absorbans atau transmittan dalam spektroskopi
ultraviolet daerah tampak digunakan untuk analisis kualitatif dan
kuantitatif untuk beberapa senyawa kimia. Keuntungan utama metode
spektrofotometri adalah bahwa metode ini memberikan cara
sederhana untuk menetapkan kuantitas zat yang sangat kecil. Selain
itu, hasil yang diperoleh cukup akurat, dimana angka yang terbaca
langsung dicatat oleh detector dan tercetak dalam bentuk angka
digital ataupun grafik yang sudah diregresikan.
Secara sederhana Instrumen spektrofotometri yang disebut
spektrofotometer terdiri dari : (Yahya.2013)
sumber cahaya monokromator sel sampel detektor read out
(pembaca).

2.2 Glukosa
 Glukosa darah merupakan karbohidrat dalam bentuk
monosakarida yang terdapat dalam darah.(Baron, 1984). Organ organ
yang berpengaruh dalam metabolisme glukosa antara lain hati dan
pankreas. Glukosa darah berada dalam keseimbangan dan mengatur
secara hormonal yaitu hormon teroid, hormon insulin, hormon efineprin
dan hormon pertumbuhan. (Ganong, 1990)
Metode pengukuran kadar glukosa :
a Metode kimia. Prinsip pemeriksaan ini, yaitu proses kondensasi glukosa
dengan akromatik amin dan asam glasial pada suasana panas, sehingga
terbentuk senyawa berwarna hijau kemudian diukur dengan fotometri.
b Metode enzimatik.
Metode glukosa oksidase. Prinsip pemeriksaan ini adalah enzim
glukosa oksidasi mengkatalisis reaksi oksidasi glukosa menjadi
asam glukonat dan hidrogen peroksida yang terbentuk bereaksi
dengan phenol dan 4 amino phenazone dengan bantuan enzim
peroksidase menghasilkan quinoneimine yang berwarna merah
muda dan dapat diukur dengan fotometer pada = 546 nm.
Metode hexokinase.(Dawn, 2000)
 BAB III
METODE PENELITIAN

3.1 Alat Percobaan

1. Beaker Glass
2. Botol Semprot
3. Labu takar berbagai ukuran
4. Pipet Tetes
5. Pipet Volume
6. Spatel
7. Spektrofotometer UV Visible

3.2 Bahan Percobaan

1. Sampel
2. Baku Pembanding Standar
3. Aquadest
4. Enzim

3.3 Prosedur Percobaan

A. Pembuatan Kurva Kalibrasi Larutan Standar
1. Ditimbang baku pembanding/standar sebanyak 50,0 mg.
2. Dimasukkan ke dalam labu takar, lalu ditambahkan pelarut sehingga
didapat larutan stok.
3. Dibuat pengenceran dari larutan stok tersebut ke dalam berbagai
konsentrasi 500-400 ppm.
4. Diambil 30 microliter menggunakan micro pipet dari masing masing
konsentrasi, lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi.
5. Ditambahkan enzim ke dalam tabung reaksi tersebut, lalu di shake
dalam orbital shaker dan di inkubasi dalam suhu kamar selama 10
menit.
6. Diukur serapan masing masing larutan menggunakan
Spektrofotometer UV Visible dan buatlah kurva kalibrasinya.
B. Penetapan Kadar Sampel
1. Diambil 30 microlit dari botol larutan sampel menggunakan micro pipet,
lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi, dilakukan duplo.
2. Ditambahkan enzim ke dalam tabung reaksi tersebut, kemudian di shake
dalam orbital shaker dan di inkubasi dalam suhu kamar selama 10 menit.
3. Diukur serapan larutan sampel menggunakan Spektrofotometer UV
Visible sehingga didapat absorbansinya.
4. Dihitung kadar sampel menggunakan persamaan kurva kalibrasi yang
telah diperoleh sebelumnya.

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Percobaan
Table Kurva Kalibrasi Glukosa Kelas A

No Konsentrasi (ppm) Serapan (A)

1. 500 0.1208
2. 1000 0.2967
3. 1500 0.434
4. 2000 0.5665
5. 2500 0.742
6. 3000 0.9
7. 3500 1.001
8. 4000 1.168

4.2 Pembahasan
Karbohidrat sebagai sumber energi uatama bagi
kelangsungan makhluk hidup merupakan polisakarida yang
monomernya adalah monosakarida. Dalam kelangsungan hidup
manusia, contohnya di hati semua monosakarida yang dihasilkan
diubah menjadi glukosa kemudian diangkut ke seluruh tubuh
oleh aliran sirkulasi untuk digunakan sebagai sumber energi oleh
sel-sel tubuh.
Pada praktikum ini kelompok kami melakukan pemeriksaan
kadar glukosa menggunakan pengukuran dengan
spektrofotometri UV-Visible. Spektrofotometri UV-Vis adalah salah
satu analisis untuk menentukan kadar suatu senyawa pada suatu
sampel adalah dengan cara spektrofotometri. Spektrofotometri
merupakan metode analisis yang didasarkan pada besarnya nilai
absorbsi suatu zat terhadap radiasi sinar elektromagnetik. Dan
alasan menggunakan spektrofotomrtri UV-Visible dibanding
dengan spektrofotometri inframerah dikarenakan
spektrofotometri inframerah hanya dapat menyerap sinar
radiomagnetik (REM) dengan rentang 0.78 300 m atau
terabsorbsinya energy cahaya oleh molekul molekul dalam
daerah sinar inframerah sedangkan spektrofotometri UV-Visible
yang merupakan salah satu dari suatu jenis spektroskopi dengan
terbentuknya suatu spectrumnya dengan terabsorpsi energi
cahaya oleh molekul molekul dalam daerah sinar UV dan sinar
tampak atau dalam rentang 180 780 nm, sehingga identifikasi
dan pengukuran kadar bahan farmasi secara spektrofotometri
UV-Visible memiliki ketelitian dan kepekaan yang lebih baik dari
pada dalam daerah inframerah. Dan untuk syarat sampel yang
dapat terukur dalam spektrofotometri UV-Visible adalah molekul
yang memiliki gugus kromofor atau suatu ikatan terkonjunggasi
dalam suatu senyawanya, dan suatu molekul yang memiliki
gugus ausokrom atau senyawa yang memiliki electron bebas
dalam strukturnya.
Tahapan awal dari percobaan ini adalah penyiapan alat dan
bahan. Sedangkan bahan yang digunakan terdiri dari sampel no
6, enzim GOD (Glukosa Oksidase) dan Peroksidase, aquadest,
dan reagen warna, karena dalam percobaan kali ini kita
menggunakan metode enzimatis. Prinsip pemeriksaan pada
metode ini adalah enzim glucose oxidase mengkatalisis reaksi
oksidasi glukosa menjadi asam glukonat dan hidrogen peroksida.
Hidrogen peroksida yang terbentuk bereaksi dengan phenol dan
4-amino phenazone dengan bantuan enzim peroksidase
menghasilkan quinoneimine yang berwarna merah muda dan
dapat diukur dengan fotometer pada panjang gelombang 546
nm. Intensitas warna yang terbentuk setara dengan kadar
glukosa darah yang terdapat dalam sampel.
Selanjutnya dilakukan perbandingan antara larutan standar
dan larutan uji. Larutan standar dibuat dengan memasukkan
standar sebanyak 30 L dengan menggunakan micropipet
kemudian dicampur dengan reagen warna. Larutan standar ini
diperlukan untuk menghitung kadar glukosa dalam sampel
dengan membandingkan absorbansi larutan uji dan larutan
standar. Larutan uji ini adalah sampel no 6 yang diambil
sebanyak 30 L yang kemudian dicampur dengan reagen warna.
Dalam sampel no 6 terdapat glukosa, Ketika serum tersebut
dicampur dengan reagen, maka terjadi reaksi enzimatik yang
terdiri dari rekasi utama dan reaksi indikasi, dimana reaksi
utamanya adalah:

Gambar 1. .Reaksi utama pada pemeriksaan kadar glukosa secara enzimatik

Pada reaksi diatas, glukosa oksidase (GOD) yang terdapat

dalam reagen mengkatalisis oksidasi glukosa. Dilihat dari
strukturnya glukosa terdiri dari gugus aldehid dan gugus alkohol.
Gugus - gugus ini ketika teroksidasi dengan bantuan enzim GOD
akan membentuk asam karboksilat yaitu berupa asam glukanoat
dengan hasil samping peroksida (H2O2). Hasil samping dari
reaksi ini yaitu hydrogen peroksida (H2O2) akan menjadi dasar
reaksi indikasi, dimana hidrogen peroksida akan bereaksi dengan
4-aminoantipirin yang merupakan reagen warna yang dikopling
dengan fenol dengan katalis enzim peroksidase. Hasil dari reaksi
ini menghasilkan senyawa quinoneimina, dimana senyawa ini
menimbulkan warna yang intensitasnya sebanding dengan kadar
glukosa yang dapat diukur dengan spektrofotometri. Adapun
reaksi indikasi yang terjadi dapat digambarkan seperti berikut:
 Gambar 2. Reaksi indikasi pada pemeriksaan kadar glukosa secara
enzimatik

Setelah larutan uji, standar telah dibuat kemudian

didiamkan dalam suhu 37C selama 10 menit atau pada suhu
kamar selama 20 menit dan terlindung dari cahaya. Hal tersebut
berdasarkan prinsip laju reaksi, dimana laju reaksi reaksi
sebanding dengan energy aktivasi. Faktor-faktor yang dapat
meningkatkan energi aktivasi diantaranya adalah penambahan
katalis dan peningkatan suhu, sehingga ketika disimpan dalam
suhu kamar diperlukan waktu yang lebih lama. Setelah
didiamkan, maka larutan uji, blanko dan standar dimasukkan
kedalam spektrofotometri. Ketika larutan uji dimasukkan dalam
spektrofotometri, maka terjadi penyerapan gelombang
elektromagnetik pada daerah visible (380-780 nm) yaitu pada
panjang gelombang 507.5 nm oleh senyawa yang memiliki gugus
kromofor yang terdapat dalam larutan uji (Quinineimina). Karena
cahaya yang ditembakkan mengandung energi (E= h. c/ )
menyebabkan terjadinya eksitasi elektron molekul tersebut dari
keadaan dasar (ground state) ke tingkat energy yang lebih tinggi.
Ketika elektron-elektron tersebut tereksitasi, maka
spektrofotometer menghasilkan nilai absorbansi, dimana
absorbansi ini setara dengan jumlah energi yang dioabsorpsi
oleh molekul untuk mengeksitasi elektron dari keadaan dasar ke
tingkat energi yang kebih tinggi, dimana perpindahan tersebut
dapat digambarkan seperti dibawah ini:
 Gambar 3. Proses eksitasi elektron dari ground state ke tingkat
energi yang lebih
Setelah diukur dengan spektrofotometri, pada larutan
standar dari tiap kelompok praktikumnya, didapat absorbansi
untuk konsentrasi 500 ppm sebesar 0.1208, konsentrasi 1000
ppm sebesar 0.2967, konsentrasi 1500 ppm sebesar 0.434,
konsentrasi 2000 ppm sebesar 0.5665, konsentrasi 2500 ppm
0.742, konsentrasi 3000 ppm sebesar 0.9, konsentrasi 3500 ppm
sebesar 1.001 dan untuk konsentasi 4000 ppm sebesar 1,168.
Selanjutnya dibuat kurva kalibrasi dan di dapat regresi linier y =
0.0003x 0.012 dengan R =0.9979. Pada larutan uji kelompok
kami (sampel no 6) yang di lakukan secara duplo diperoleh
absorbansi pada tabung reaksi pertama sebesar 0.871 dan pada
tabung reaksi kedua diperoleh absorbansi 0.928. Selanjutnya
ditentukan kadar dari larutan uji yang dibuat duplo tersebut.
Setelah di lakukan perhitungan penetapan dari kedua tabung
reaksi tersebut di dapat rata rata hasil kadar glukosa sampel
no 6 sebesar 3038.25 g/mL
 BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Dari sampel yang diuji, didapatkan regresi linier y = 0.0003x 0.012

dengan R =0.9979. Pada larutan uji kelompok kami (sampel no 6) yang di lakukan
secara duplo diperoleh absorbansi pada tabung reaksi pertama sebesar 0.871 dan
pada tabung reaksi kedua diperoleh absorbansi 0.928. Setelah di lakukan
perhitungan penetapan dari kedua tabung reaksi tersebut di dapat rata rata hasil
kadar glukosa sampel no 6 sebesar 3038.25 g/mL.
 DIAGRAM ALIR

1. Pembuatan Kurva Kalibrasi Larutan Standar

2. Penetapan Kadar Sampel
 LAMPIRAN

A. GAMBAR

MIKRO PIPET
 SPEKTROFOTOMETER UV-VISIBLE

MEKANISME SPEKRUM UV-VISIBLE

B. KURVA KALIBRASI
 Kurva Kalibrasi Glukosa Kelas A
1.4

1.2
f(x) = 0x - 0.01
1 R = 1

0.8
Absorban
0.6

0.4

0.2

0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

Konsentrasi (ppm)
C. PERHITUNGAN

Regresi Linear Y = 0,0003 x 0,012

R= 0,9979

Sampel 1 Y = 0,0003 x 0,012

0,871 = 0,0003 x 0,012
0,883
X = 0,0003

= 2943,3 g/mL

Sampel 2 Y = 0,0003 x 0,012

0,928 = 0,0003 x 0,012
0,940
X = 0,0003

= 3133,3 g/mL

2943,3+ 3133,3
Total = 2 = 3038,3 g/mL
 DAFTAR PUSTAKA

1 Baron, D. N, 1995. Kapita Selekta Patologi Klinik (A Short Text Book of

Chemical Pathology) Edisi 4. EGC. Jakarta.
2 Dawn B, Marks. 2000. Dasar Dasar Kimiawi dan Biologis Biokimia.
Dalam : Biokimia Kedokteran Dasar. Jakarta : EGC
3 Gandjar, Ibnu Gholib. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta : Pustaka
Pelajar
4 Ganong, W.F. 2002. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran. Edisi 20. Jakarta:
Penerbit Buku Kedokteran EGC. Hal: 1187-1201
5 Marzuki, Asnah. 2012. Kimia Analisis Farmasi. Makassar : Dua Satu
Press
6 Wunas, Yeanny dan Susanti. 2011. Analisa Kimia Farmasi Kuantitatif
(revisi kedua). Makassar : Laboratorium Kimia Farmasi Fakultas Farmasi
UNHAS
7 Yahya.sripatundita. JURNAL SPEKTROFOTOMETER-UV-VIS. Diakses
tanggal 8 mei 2013 pukul 21.