BAB III

METODE PENELITIAN
3.1.

Jenis Penelitian
Jenis penelitian ini adalah eksperimental murni dengan pengembangan bakteri secara

in vitro pada media kultur, lalu dilakukan uji aktivitas protease terhadap sari

kentang

(Solanum tuberosum).
3.2.

Lokasi dan Waktu Penelitian

Tahap isolasi sampai dengan tahap pengujian aktivitas protease akan dilakukan di

laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Pembangunan Nasional

Veteran Jakarta. Penelitian ini dilakukan dari bulan Desember 2016 sampai Januari 2017.
3.3.
Bahan, Alat, dan Subjek Penelitian
3.3.1. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini:
1.
Sari Kentang (Solanum tuberosum)
2.
Isolat murni bakteri Escherichia coli
3.
Media Skim Milk Agar
4.
Natrium Agar
5.
Aquades
6.
Spirtus
7.
Etanol
8.
Reagen Bromocresol Green (BCG)
3.3.2. Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.

Alat pengukur micrometer (jangka sorong).

Aluminium foil.
Autoclave.
Batang pengaduk.
Cawan petri.
Tabung Erlenmeyer.
Sterilisator.
Gelas ukur 10 ml.
Gelas ukur 5 ml.
Kertas cakram.
Inkubator.
Kapas steril.
Lampu Bunsen.
Penggaris.
Rak tabung reaksi.
Sarung tangan karet.
Spidol permanen.
Spuit steril 10 ml.

19.
Spuit steril 5 ml.
20.
Tabung reaksi.
3.3.3. Subjek Penelitian
Sampel penelitian ini adalah kentang (Solanum tuberosum) jenis kentang kuning yang
berasal dari perkebunan di Wonosobo. Sampel kentang kemudian diproses dengan juicer
sehingga didapatkan sarinya. Sampel akan diberikan ke subjek penelitian, yakni bakteri
Escherichia coli dari isolat murni yang didapatkan dari laboratorium Mikrobiologi Fakultas
Kedokteran Universitas Indonesia.
3.4.

Teknik Pengambilan Sampel

Teknik pengambilan sampel kentang yang dilakukan bersifat Purposive sampling

yaitu pengambilan bahan yang didasarkan pada suatu pertimbangan tertentu yang dibuat oleh
peneliti. Kentang yang dipergunakan adalah kentang kuning yang berasal dari perkebunan di
Wonosobo. Hal ini dikarenakan kentang kuning lebih empuk dan berair sehingga lebih mudah
untuk dibuat sari, selain itu, daerah Wonosobo dipilih karena merupakan tempat yang ideal
untuk pertumbuhan tanaman kentang sehingga kentang tumbuh dengan subur dan baik.
3.5.

Besar Sampel
Dalam penelitian ini ukuran sampel ditentukan dengan menggunakan rumus Federer
(Sopiyudin, 2009), perhitungan sebagai berikut:
(n-1) (t-1) 15
t
= jumlah kelompok (25%, 50%, 75%, 100%, dan kelompok kontrol negatif)
n
= jumlah ulangan.

Maka didapatkan jumlah sampel sebagai berikut:

(n-1) (t-1) 15
(n-1) (6-1) 15
(n-1) 5 15
4n 5 15
4n 15+5
4n 20
n45
dilakukan pengulangan sebanyak lima kali.
3.6.
Metode Penelitian
3.4.1. Rancangan Penelitian
Rancangan penelitian ini dilaksanakan dengan metode eksperimental murni di
laboratorium. Pada rancangan penelitian eksperimental, peneliti melakukan manipulasi
terhadap satu atau lebih variabel penelitian dan kemudian mempelajari efek perlakuan
tersebut.

Aktivitas protease diukur secara kualitatif dengan melihat adanya zona bening
disekitar koloni. Intervensi pada penelitian ini adalah pemberian 5 mL sari kentang dalam
empat variasi konsentrasi (25%, 50%, 75% dan 100%). Kelompok kontrol negatif diberikan 5
mL larutan aquades.
3.4.2. Identifikasi Variabel
3.4.2.1.
Jenis Variabel
(i)
Variabel Terikat (Dependen)
Diameter zona bening Escherichia coli
(ii)
Variabel Bebas (Independen)
Sari kentang 5 mL konsentrasi 25%
Sari kentang 5 mL konsentrasi 50%
Sari kentang 5 mL konsentrasi 75%
Sari kentang 5 mL konsentrasi 100%
3.4.2.2. Definisi Operasional Variabel
No
.
1.

Variabel

Definisi

Alat Ukur

Hasil Ukur

Skala Ukur

Indeks

Operasional
Nilai indeks

Jangka

Diameter

Rasio

Proteolitik

yang

Sorong

zona bening

Bakteri

didapatkan

bakteri

(variabel

dari hasil bagi

(mm) dibagi

dependen)

diameter zona

zona koloni

bening bakteri

(mm)

terhadap
diameter
koloni.
(Baehaki,
2.

Sari Kentang

2011)
Solanum

(variabel

tuberosum

sari kentang

independen)

yang diproses

(%)
25%, 50%,

dengan juicer

3.

Kontrol

3.4.3. Cara Kerja

Pengamatan:

Rasio

75% dan

dan diambil
sarinya.
Aquades

Konsentrasi

100%.
Spuit

10 mL

Rasio

Isolat bakteri Escherichia coli yang sudah murni, diremajakan pada Nutrient Agar
miring dengan ose dari isolat kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Setelah
itu, dilakukan uji proteolitik pada bakteri secara kualitatif.
Sari kentang kemudian dilarutkan dalam aquades sampai mencapai volume 5 mL. Sari
kentang dilarutkan sehingga mencapai empat jenis konsentrasi berbeda (25%, 50%, 75% dan
100%). Masing-masing larutan ditambahkan ke cawan petri masing-masing, kemudian
dicampur dengan 10 mL Skim Milk Agar 2%. Sebagai kontrol negatif, digunakan pelarutnya,
yakni aquades sebanyak 5 mL dicampur dengan 10 mL Skim Milk Agar 2%.
Pada media Skim Milk Agar yang sudah mengeras, dibuat lubang ditengahnya dengan
diameter 3 mm, kemudian sebanyak satu ose bakteri Escherichia coli yang telah diremajakan
dimasukkan ke dalam lubang tersebut lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Setelah
24 jam, reagen Bromocresolgreen (BCG) kemudian dituang keatas media agar sampai
seluruh permukaan media tertutup oleh reagen, setelah itu media diinkubasi selama 20-30
menit di suhu ruang (25-30o C) (Vijayaraghavan, 2013).
Aktivitas proteolitik Escherichia coli yang ditumbuhkan pada media Skim Milk Agar
ditunjukkan dengan terlihatnya zona bening yang muncul disekitar koloni yang terbentuk
(Putri, 2012). Indeks proteolitik dihitung dengan cara mengukur luas areal bening dan luas
koloni bakteri. Perhitungan indeks proteolitik adalah perbandingan luas areal bening dengan
luas koloni bakteri (Baehaki, 2011).
(Gambar 3.1. Area Perhitungan Indeks Proteolitik)

a
Rumus Indeks Proteolitik b
Keterangan:
a

= Diameter zona bening yang terbentuk.

= Diameter koloni.
Indeks proteolitik bakteri dihitung pada berbagai konsentrasi dihitung dan

dibandingkan dengan indeks proteolitik bakteri pada media kontrol.

3.4.4. Rancangan Analisis Data
Data yang telah terkumpul selanjutnya diolah dan dianalisis secara statistik. Data
analisis yaitu untuk mengetahui perbedaan pengaruh sari kentang terhadap aktivitas protease
bakteri Escherichia coli yang telah dilakukan tiap kelompoknya.
(i)

Uji Normalitas
Pada data numerik (potensi daya hambat) dilakukan uji normalitas untuk
mengetahui apakah data berdistribusi normal atau tidak. Jenis uji yang dipakai
adalah Saphiro Wilk Test karena jumlah sampel kurang dari 50. Data

(ii)

berdistribusi normal apabila nilai signifikansinya > 0.05 (Sopiyudim. 2009).

Uji Anova One Way
Data yang didapat mengarah kepada uji hipotesis komparatif variabel numerik,
data berdistribusi normal serta lebih dari kelompok, maka dari itu apabila data
berdistribusi normal maka digunakan uji Anova One Way. Apabila daa yang
didapat tidak berdistribusi normal maka akan digunakan uji alternatif KruskalWallis.

Data hasil pengamatan subjek penelitian yang diperoleh kemudian akan dianalisis dengan
komputerisasi.