LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI UMUM

ACARA VII
ENUMERASI BAKTERI

Nama : Auuxensius Rexer Fransenda

NIM : 24020220130027

Kelompok :4

Asisten : Ade Frisky Rahmayanti

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI UMUM

PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA
UNIVERSITAS DIPONEGORO
2021
 ACARA VII
ENUMERASI BAKTERI

I. TUJUAN
1.1. Mampu melakukan perhitungan mikroba dengan metode Total Plate Count
1.2. Mampu menentukan jumlah mikroba pada berbagai macam sampel dengan
metode Total Plate Count

II. TINJAUAN PUSTAKA

II.1 Enumerasi Mikroba
Analisis jumlah sel bakteri merupakan salah salah satu teknik yang
penting dilakukan untuk pengembangan bakteri endofit sebagai penghasil
senyawa antimikroba. Teknik menghitung jumlah sel bakteri adalah dikenal
juga dengan nama enumerasi. Enumerasi adalah suatu yang digunakan untuk
menghitung jumlah mikroba dalam suatu media tanpa mengidentifikasi jenis
mikroba (bakteri, jamur, yeast) (Jawetz et al., 2013). Teknik ini bertujuan
untuk menentukan jumlah sel dari suatu kultur bakteri secara kuantitatif.
Enumerasi secara kuantitatif bakteri dapat dilakukan dengan perhitungan
mikroorganisme secara langsung (direct count) dan perhitungan bakteri
secara tidak langsung (indirect count). Analisis langsung dapat dilakukan
dengan kamar hitung (counting chamber). Kelemahan teknik ini adalah tidak
dapat membedakan sel bakteri yang hidup dan mati (Lily, 2011).
Pada perhitungan jumlah bakteri dengan cara tidak langsung (indirect
count) dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu perhitungan pada cawan
petri (Total Plate Count), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan
jumlah terkecil atau terdekat (metode MPN), dan kalorimeter (turbidimetri)
(Fardiaz, 2013). Keuntungan menggunakan metode enumerasi mikroba
secara tidak langsung adalah perhitungan hanya dilakukan pada mikroba
yang masih hidup sehingga hasilnya lebih akurat. Kekurangan dalam metode
perhitungan tidak langsung adalah membutuhkan waktu inkubasi yang lama
sehingga hasilnya tidak didapat dengan waktu yang cepat. Perhitungan
mikroba secara tidak langsung memiliki sensitifitas yang tinggi sehingga
metode tersebut cocok digunakan untuk deteksi sensitif dari kontaminasi
mikroba pada makanan dan materi yang lain (Madigan et al., 2011).
 2.1.1. Secara Langsung
Perhitungan secara langsung dapat mengetahui beberapa jumlah
mikroorganisme pada suatu bahan pada saat tertentu tanpa memberikan
perlakuan terlebih dahulu. Perhitungan ini dapat dilakukan dengan
beberapa cara antara lain, adalah dengan membuat preparat dari suatu
bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan
penggunaan ruang hitung (counting chamber) (Brooks et al., 2011).

2.1.2. Secara Tidak Langsung

Perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah
mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viable count)
dan jumlah orgnisme yang diketahui dari cara tidak langsung terlebih
dahulu harus memberikan perlakuan tertentu sebelum dilakukan
perhitungan. Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu:
perhitungan pada cawan petri (total plate count/ TPC), perhitungan
melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN
methode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri) (Brooks
et al., 2011).

II.2 Total Plate Count

Salah satu cara untuk mendeteksi atau menganalisis jumlah mikroba
yaitu dengan cara uji TPC (Total Plate Count) di laboratorium. Pengujian
Total Plate Count (TPC) dimaksudkan untuk menunjukkan jumlah mikroba
yang terdapat dalam suatu produk dengan cara menghitung koloni bakteri
yang ditumbuhkan pada media agar. Metode TPC (Total Plate Count)
dibedakan atas dua cara, yakni metode tuang (pour plate), dan metode
permukaan (surface/spread plate). Pada metode tuang , sejumlah sampel (1ml
atau 0,1ml) dari pengenceran yang dikehendaki dimasukkan kecawan petri,
kemudian ditambah agar-agar cair steril yang didinginkan (47-500C) sebanyak
15-20 ml dan digoyangkan supaya sampelnya menyebar. Pada pemupukan
dengan metode permukaan, terlebih dahulu dibuat agar cawan kemudian
sebanyak 0,1 ml sampel yang telah diencerkan dipipet pada permukaan media
agar-agar tersebut. Kemudian diratakan dengan batang gelas melengkung yang
steril selanjunya di iknkubasi 370C selama 2 x 24 jam. Jumlah koloni dalam
sampel dapat dihitung sebagai berikut (Yunita dkk, 2015).
(Anggraeni, 2012).
III. METODOLOGI
III.1 Alat
1. Pipet steril
2. Cawan petri steril
3. Label
4. Spreader
5. Lampu spiritus
6. Colony counter
7. Vortex

III.2 Bahan
1. Kultur bakteri B. subtilis dalam medium Nutrient Broth
2. Enam buah tabung reaksi berisi 9 ml akuades steril
3. Medium Plate Count Agar

III.3 Cara Kerja

1. Pengenceran dilakukan dengan mengambil 1 ml kultur bakteri dan
dimasukkan ke dalam tabung reaksi pertama, kemudian dihomogenkan
di vortex lalu diberi label (10−1 ).
2. Pengenceran dilanjutkan dengan mengambil 1 ml sampel dari tabung
reaksi pertama untuk dimasukkan kedalam tabung reaksi berikutnya (
−2
10 ¿.
3. Pengenceran dilakukan sebanyak enam tabung reaksi (10−6 ¿ .
4. Ditanam dengan metode sebar (spread plate), dan diinkubasi pada
suhu 30℃, selama 18-24 jam.
5. Diamati dan dihitung jumlah koloni yang tumbuh dari setiap
pengenceran untuk memperoleh jumlah mikroba per ml sampel.
 IV. HASIL PENGAMATAN

Sampel/ Jumlah koloni per pengenceran

Kultur Plate Count (CFU)
10-3 10-4 10-5 10-6
mikroba
Ikan asin TBUD 397 47 8 >3,0x106
kakap batu
(4,7 x 106)
Bakteri TBUD 460 292 24 <3,0x107
Coliform
(2,9 x 107)
dalam Es
Dung-dung
Saus Cabai TBUD TBUD 126 104 <3,0x108
(1x 108)
V. PEMBAHASAN
Praktikum Mikrobiologi Umum Acara ke VII yang berjudul
“Enumerasi Mikroba” memiliki tujuan yaitu agar mahasiswa dapat memahami
teknik enumerasi mikroba dengan metode Total Plate Count. Selain itu,
mahasiswa juga diharapkan mampu melakukan perhitungan mikroba dengan
metode Total Plate Count. Praktikum ini dilaksanakan secara daring
menggunakan aplikasi Microsoft Teams pada hari Rabu, 28 April 2021 pukul
10.30-13.20. Beberapa alat yang digunakan untuk praktikum ini, yaitu pipet
steril, cawan petri steril, label, spreader, lampu spiritus, colony counter, dan
vortex. Sedangkan bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum ini
diantaranya kultur bakteri B. subtilis dalam Nutrient Broth, sebanyak enam buah
tabung reaksi berisi 9 ml akuades steril, dan medium Plate Count Agar.

V.1 Enumerasi Mikroba

Enumerasi mikroba adalah teknik perhitungan jumlah mikroba dalam
suatu media tanpa mengidentifikasi jenis mikroba yang digunakan (bakteri,
jamur, yeast). Enumerasi mikroba dapat dilakukan melalui berbagai macam
uji penduga seperti uji kuantitatif (dengan metode MPN), uji penguat, dan uji
pelengkap. Tujuan enumerasi adalah untuk mengetahui jumlah mikroba yang
mungkin ada pada suatu bahan terutama bahan makanan yang disimpan
dengan waktu tertentu secara kualitatif. Hal ini sesuai dengan pendapat
Jawetz et al. (2013) yang mengatakan bahwa penetapan jumlah bakteri
dilakukan dengan menghitung jumlah sel bakteri yang mampu membentuk
koloni di dalam media biakan atau membentuk suspen dalam larutan biakan
mikroba. Perhitungan pada enumerasi mikroba ini dibagi menjadi dua cara,
yaitu secara langsung dan secara tidak langsung. Hal ini sesuai dengan yang
diungkapkan oleh Lily (2011) bahwa teknik enumerasi mikroba secara
kuantitatif dapat dilakukan dengan perhitungan jumlah bakteri dengan metode
secara langsung atau tidak langsung dari suatu sampel.

5.1.1 Secara Langung (Direct Method)

Enumerasi secara langsung atau yang lebih dikenal dengan
direct method merupakan cara perhitungan terhadap total dari jumlah
sel mikroba dalam suatu sampel secara mikroskopik tanpa
menumbuhkan terlebih dahulu bakteri yang akan dihitung.
Penghitungan secara langsung pada prinsipnya adalah menghitung
jumlah keseluruhan mikroba yang terdapat pada suatu sampel kultur
tanpa membedakan kondisi mikroba tersebut apakah masih hidup atau
tidak. Enumerasi secara langsung dapat dilakukan dengan dua
metode. Hal ini juga sejalanb dengan yang diungkapkan Brooks et al.
(2011) bahwa penghitungan mikroba secara langsung dapat
menggunakan metode perhitungan dengan kamar hitung (counting
chamber) dan perhitungan dengan preparat olesan (smear count).
Metode Counting Chamber merupakan suatu metode penghitungan
jumlah mikroba secara langsung dengan cara Petroff-Hausser
Bacteria Chamber, yakni menghitung jumlah mikroba dalam satuan
isi yang sangat kecil. Alat yang digunakan berupa haemocytometer
yang mempunyai volume tertentu sehingga satuan isi yang terdapat
dalam satu bujur sangkar juga tertentu. Ruang hitungnya terdiri dari 9
kotak besar dengan luas 1 mm2. Satu kotak besar ditengah dibagi
menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0,2 mm. Satu kotak sedang
dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Dengan demikian satu kotak besar
tersebut berisi 400 kotak kecil. Tebal dari ruang hitung ini adalah 0,1
mm. Sel mikroba yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang
hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat
diketahui. Dari perhitungan jumlah bakteri melalui metode counting
chamber dengan menggunakan kotak hemositometer terlihat jumlah
koloni bakteri yang tersebar tidak merata pada kotak saat diamati
dibawah mikroskop. Dengan cara counting chamber jumlah bakteri
dapat dihitung baik dalam bentuk cair maupun padat. Pada metode
ini  yaitu dengan  hemasitometer terdapat bagian kotak-kotak dengan
ukuran tertentu. Hal ini juga sejalan dengan pendapat Fardiaz (2013),
counting chamber pada prinsipnya merupakan sebuah alat berupa
lempeng gelas (grid) yang pada permukaannya di buat petak-petak
yang sangat kecil berbentuk bujur sangkar dengan luas dan kedalam
tertentu. Jumlah sel pada unit perluasan grid dapat dihitung secara
 langsung di bawah pengamatan mikroskop sehingga menghasilkan
ukuran jumlah sel per volume chamber.
Beberapa hal yang menjadi kelebihan dari metode secara
langsung ini yang diungkapkan oleh Fardiaz (2013) adalah peneliti
dapat menghitung jumlah mikroorganisme dengan lebih cepat dan
dengan ongkos biaya yang murah, tetapi hal yang menjadi
kekurangan adalah tidak bisa membedakan antara mikroba yang
hidup dan mikroba yang sudah mati. Selain itu, mikroba yang motil
sulit dihitung dengan pasti dan mikroba yang sedang dihitung perlu
mencapai jumlah konsentrasi yang memadai untuk dihitung.

5.1.2 Secara Tidak Langsung (Indirect Method)

Metode enumerasi mikroba yang lainnya yakni secara tidak
langsung (indirect method) adalah suatu cara/ metode perhitungan
mikroba dengan hanya menghitung mikroba yang masih hidup saja.
Hal ini dilakukan dengan cara memindahkan mikroba ke dalam suatu
media yang digunakan sebagai kultur. Perhitungan mikroba tidak
langsung dapat dilakukan dengan dua metode. Kedua metode tersebut
diklasifikasikan berdasarkan tingkat kekeruhannya melalui alat
spektrofotometer dan juga berdasarkan berat keringnya, yakni melalui
alat gravimetri dan Total Plate Count. Pada metode perhitungan tidak
langsung, perlu dilakukan proses pengkulturan mikroba terlebih dahulu
minimal 24 jam. Hal ini sesuai dengan pendapat Brooks et al. (2011)
bahwa enumerasi mikroba indirect method ini membutuhkan waktu
yang cukup lama. Jenis perhitungan yang paling umum digunakan
adalah Total Plate Count karena memiliki kelebihan yakni kapasitas
untuk menghitung mikroba yang lebih baik. Hal ini sejalan dengan
yang diungkapkan Madigan et al. (2011) bahwa indirect method ini
merupakan satu metode enumerasi kuantitatif melalui pendekatan
analisis secara tidak langsung. Metode ini dilakukan terhadap mikroba
yang masih hidup saja sehingga hasilnya lebih presisi. Perhitungan
secara tidak langsung dapat dilakukan dengan menggunakan cawan
petri (Total Plate Count), perhitungan melalui pengenceran dengan
jumlah sel yang berbeda pada masing-masing pengenceran,
 perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (metode MPN), dan
kalorimeter (turbidimetri). Perhitungan mikroba secara tidak langsung
memiliki sensitivitas dan presisi yang tinggi dan membuat metode ini
cocok digunakan untuk mendeteksi secara sensitif dari adanya
kontaminasi.

V.2 Total Plate Count

Total Plate Count (TPC) adalah salah satu metode enumerasi mikroba
secara tidak langsung dengan mengaplikasikan metode pengenceran secara
bertingkat. Pengujian TPC ini dimaksudkan untuk menunjukkan jumlah
mikroba yang terdapat dalam suatu produk dengan cara menghitung koloni
bakteri yang ditumbuhkan pada media agar. Satuan yang digunakan dalam
metode TPC ini adalah Colony Forming Unit (CFU/ml) dengan penghitungan
koloni menggunakan suatu alat yang disebut colony counter. Syarat
perhitungan mikroba dengan metode TPC ini bahwa mikroba harus memenuhi
perolehan jumlah sel per mL sample sebanyak 30-300 koloni. Dari sekian
banyak data yang diperoleh di tabel pengamatan, pengenceran dengan jumlah
yang didapatkan 30 hingga 300 koloni bakteri lah yang dianggap valid dan
dapat dihitung menggunakan metode TPC. Menurut Total Plate Count (TPC)
merupakan salah satu cara untuk Yunita dkk. (2015), mempermudah dalam
pengujian mikroorganisme dari suatu sampel dan dapat menunjukkan adanya
mikroorganisme patogen ataupun non patogen dengan pengamatan secara
visual yang kemudian dihitung berdasarkan TPC untuk standar tes pada
bakteri. Langkah kerja dalam melakukan metode TPC ini adalah dengan
mengambil 1 ml kultur bakteri dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi
pertama untuk diencerkan, kemudian dihomogenkan dalam vortex lalu diberi
label (10-1). Setelah itum, pengenceran kembali dilakukan dengan mengambil
1 ml sampel dari tabung reaksi pertama untuk dimasukkan ke dalam tabung
reaksi berikutnya (10-2). Pengenceran ini diulangi sebanyak 6 kali hingga (10-6)
di 6 tabung reaksi dengan mengambil sampel mikroba dari pengenceran
sebelumnya secara berurutan. Setelah tahap pengenceran, mikroba
diinokulasikan dengan metode sebar (spread plate) atau tuang (pour plate) dan
diinkubasi pada suhu 30‫ﹾ‬C selama 18-24 jam. Setelah itu, sampel diamati dan
dihitung jumlah koloninya yang tumbuh dari setiap pengenceran. Fungsi
perlakuan pengenceran bertingkat pada TPC adalah untuk menghindari
penumpukan koloni mikroba yang tersuspensi dalam cairan sehingga
menyebabkan kesulitan dalam perhitungan koloni mikroba. Selanjutnya,
campuran di-vortex guna menghomogenkan campuran tersebut. Hal ini sejalan
dengan pendapat Yunita dkk. (2015) bahwa vortex berfungsi untuk
menghomogenkan kedua-duanya, baik sampel maupun larutan ujinya.
Cara perhitungan TPC dilakukan dengan colony counter dengan batas
koloni 30-300 CFU/mL. Untuk menentukan hasil CFU, adalah jumlah koloni
terhitung (N) dikali dengan 1/faktor pengenceran lalu dikali lagi dengan
jumlah suspensi yang diinokulasi (S). Hal ini sesuai dengan pendapat
Anggraeni (2012) bahwa perhitungan koloni bakteri dilakukan secara manual
pada tiap pengenceran yang idealnya jumlah koloni tiap cawan berkisar antara
30-300 CFU/mL. Selain itu, untuk menentukan CFU, rumusnya adalah = N x
1/10x x S dengan N adalah jumlah koloni terhitung, x
adalah tingkat
pengenceran, dan S adalah jumlah suspensi yang diinokulasikan. Satuan akhir
untuk perhitungan jumlah bakteri adalah CFU/ml. Tentunya, tidak semua hasil
perhitungan koloni bakteri dari pengenceran ikut dihitung, karena jika di luar
aturan valid yakni 30< jumlah koloni bakteri <300 maka informasinya tertulis
TBUD (terlalu banyak untuk dihitung). Berdasarkan data yang diperoleh pada
tabel pengamatan, hasil perhitungan TPC pada ikan asin kakap batu adalah
sekitar 4,7 x 106 koloni bakteri teramati. Kemudian, untuk hasil perhitungan
TPC pada bakteri coliform didapatkan hasil kurang lebih sebanyak 2,9 x 107
CFU/ml. Yang terakhir, pada perhitungan TPC saus cabai didapatkan hasil
koloni bakteri sekitar 1 x 108 CFU/ml.
VI. KESIMPULAN
VI.1 Enumerasi mikroba dapat dilakukan menggunakan metode Total Plate
Count yang merupakan salah satu teknik penghitungan koloni mikroba
secara tidak langsung melalui pengenceran bertingkat yang bertujuan agar
koloni mikroba tidak saling menumpuk dan menjadi lebih mudah untuk
dihitung. Pada setiap pengencerannya, mikroba akan diinkubasi terlebih
dahulu dengan metode spread plate/ pour plate pada media di cawan petri,
kemudian diinkubasi 18-24 jam hingga setelah itu mikroba dapat diamati dan
dihitung jumlah koloninya.
VI.2 Enumerasi mikroba dapat dilakukan menggunakan metode Total Plate
Count dengan rumus Colony Forming Unit/ml (CFU/ml) = jumlah koloni
terhitung (N) x 1/faktor pengenceran (1/10x) x jumlah suspensi yang
diinokulasi (S). Pada perhitungan TPC harus memenuhi syarat 30< jumlah
koloni bakteri <300 untuk memperoleh jumlah sel per ml sampel. Terakhir,
perhitungan koloni dapat dilakukan dengan menggunakan colony counter.
LAMPIRAN
 DAFTAR PUSTAKA

Yunita, M. Hendrawan, Y. & Yulianingsih, R. 2015. Analisis Kuantitatif

Mikrobiologi Pada Makanan Penerbangan (Aerofood ACS) Garuda
Indonesia Berdasarkan TPC (Total Plate Count) Dengan Metode Pour Plate.
Jurnal Keteknikan Pertanian Tropis dan Biosistem. Vol. 3. 3. pp 237-248.
Anggraeni, D.M. 2012. Uji Disinfeksi Bakteri Escherichia Coli Menggunakan
Kavitasi Water Jet. Depok: Universitas Indonesia.
Fardiaz, S. 2013. Mikrobiologi pengolahan pangan. Departemen Pendidikan dan
Kebudayan Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Pusat Antar Universitas
Pangan dan Gizi Institut Pertanian Bogor. Bogor. 3-23.
Brooks, G.F., Carroll K.C., Butel J.S., Morse S.A. & Mietzner T.A. 2011. Jawetz,
Melnick & Adelberg Medical Microbiology. Translated by Nugroho, A.W.,
D. Ramadhani, H. Santasa, N. Yesdelita & W.K. Nirmala. Jakarta: EGC
Medical Publisher.
Madigan, M. T., Martinko, J. M., Stahl, D. A., & Clark, D. P. 2011. Brock Biology of
Microorganisms 13th Edition. Benjamin Cummings (Vol. 53)
Lily, M. 2011. “Improving Notification of Critical Laboratory Results”. Medical
Journal of Malaysia, 65, 74.
Jawetz, E., Melnick, J. L., & Adelberg, E. A. 2013. “Medical Microbiology Climate
Change”. The Physical Science Basis Journal (Vol. 53).
 LEMBAR PENGESAHAN

Semarang, 3 Mei 2021

Mengetahui,
Asisten Praktikan

Ade Frisky Rahmayanti Auxensius Rexer Fransenda

24020219130057 24020220130027