Enumerasi mikroba 

adalah teknik yang digunakan untuk mengestimasi jumlah

mikroorganisme dalam suatu bahan atau sampel. Pengertian enumerasi mikorba
tersebut menyatakan bahwa jumlah mikroorganisme dalam suatu bahan sangat
bervariasi dan sulit diketahui dengan pasti, sehingga diperlukan cara perhitungan
tertentu untuk mengetahui jumlah mikroorganisme dalam suatu bahan. Teknik
enumerasi mikroba ada dua yakni metode enumerasi mikroba secara langsung dan
cara tidak langsung (Gandjar dkk. 1992).

Enumerasi Mikroba Secara Langsung

Enumerasi mikroorganisme secara langsung merupakan cara perhitungan terhadap
total dari jumlah sel mikroba dalam suatu sampel secara mikroskopik. Enumerasi
secara langsung dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu metode perhitungan
dengan kamar hitung (Counting chamber) dan perhitungan dengan preparat olesan
(Smear count). Metode perhitungan dengan kamar hitung prinsipnya mirip seperti
perhitungan sel darah merah. Keduanya memakai kamar hitung hemositometer
(haemocytometer) untuk menerima sampel yang sangat kecil yang disebar di atas
kotak-kotak dalam kamar hitung. Selanjutnya, jumlah mikroorganisme dalam
kotak-kotak tersebut dikalikan dengan volume sampel sehingga didapatkan
jumlah mikroorganisme per ml sampel (Gandjar dkk. 1992; Talaro 2002).  Berikut
adalah gambar hemositometer!

Gambar 1. Bagian hemositometer. 

Cara kerja menggunakan hemositometer untuk enumerasi bakteri adalah:

1. Menentukan plot ( 5 kotak yang bergaris tebal dan terdiri dari atas kotak
kecil-kecil).
2. Menghitung jumlah bakteri yang ada dalam masing-masing kotak yang
besar (bakteri yang tepat pada garis tepi dihitung satu kali).
3. Menjumlah bakteri dari seluruh kotak yang besar kemudian dirata-rata.
4. Menghitung konsentrasi bakteri/ml dengan cara memasukkan ke rumus
volume

Sementara itu, perhitungan menggunakan metode preparat olesan dilakukan

dengan membuat preparat oles dari volume tertentu dan disebar di gelas objek
dengan luas tertentu pula. Setelah itu, dengan mengetahui luas bidang mikroskop
dan jumlah mikroorganisme yang ada dalam bidang, maka jumlah
mikroorganisme per ml sampel dapat diketahui (Gandjar dkk. 1992). Kelebihan
enumerasi mikroorganisme secara langsung adalah dapat menghitung jumlah
mikroorganisme lebih cepat dan dapat mengetahui informasi tambahan tentang
mikroba yang sedang dihitung (Madigan dkk. 2011). Kekurangan dari
perhitungan mikroorganisme secara langsung ialah sel bakteri yang mati dianggap
seperti sel yang hidup, sel bakteri yang motil sulit dihitung dengan pasti, dan sel
yang sedang dihitung perlu mencapai jumlah konsentrasi yang memadai untuk
dihitung, sekitar 10 juta bakteri per ml (Tortora dkk. 2010). 

Enumerasi Mikroba Secara Tidak Langsung

Perhitungan mikroorganisme secara tidak langsung mempunyai berbagai metode
yang berbeda. Metode-metode yang dapat dilakukan untuk menghitung
mikroorganisme secara tidak langsung antara lain dengan turbidometer, dengan
cara kimia, dengan cara volume total, dengan cara berat kering, dengan kultur
tabung putar, dan enumerasi mikroba dengan metode total plate count (TPC)
(Gandjar dkk. 1992). Keuntungan menggunakan metode enumerasi
mikroorganisme secara tidak langsung adalah perhitungan hanya kepada mikroba
yang masih hidup sehingga hasilnya lebih akurat. Kekurangan dalam metode
perhitungan tidak langsung adalah membutuhkan waktu inkubasi yang lama
sehingga hasilnya tidak didapat dengan waktu yang cepat. Perhitungan mikroba
secara tidak langsung memiliki sensitifitas yang tinggi sehingga metode tersebut
cocok digunakan untuk deteksi sensitif dari kontaminasi mikroba pada makanan
dan materi yang lain (Madigan dkk. 2011).
.
Salah satu metode enumerasi mikroorganisme secara tidak langsung ialah total
plate count (TPC) atau enumerasi mikroba dengan metode angka lempeng total
(ALT). Metode enumerasi mikroorganisme dengan TPC mempunyai prinsip
hanya menghitung jumlah bakteri yang hidup, yaitu yang dapat membelah dan
membentuk keturunan. Dengan kata lain, metode total plate count disebut juga
dengan metode viable count. Metode total plate count tidak dapat menghitung
setiap sel tunggal bakteri, akan tetapi menghitung jumlah koloni yang jelas terlihat
atau representatif (Madigan dkk. 2011).  
Penghitungan jumlah koloni berdasarkan pada alasan bahwa setiap koloni yang
terlihat merupakan hasil dari pemebelahan sel tunggal bakteri, walaupun
sebenarnya tidak selamanya tepat (Hogg 2005; Tortora dkk. 2010).  Mengingat
hal tersebut, metode total plate count diekspresikan dalam colony forming unit
(CFU), bukannya sel tunggal, per unit volum (Hogg 2005). Colony forming unit
merupakan unit yang membentuk koloni, satu koloni merepresentasikan satu sel
tunggal.  Metode perhitungan mikroorganisme total plate count dapat dilakukan
dengan dua jalan, yaitu secara spread-plate dan pour-plate (Madigan dkk. 2011). 

Umumnya, koloni yang dihitung pada metode TPC sulit dihitung karena koloni
yang akan dihitung sangat banyak. Untuk mengatasi hal tersebut, diperlukan suatu
serial pengenceran. Sampel yang akan diperiksa biasanya diencerkan sebanyak 10
kali pada setiap seri. Pengenceran dilakukan sampai konsentrasi tertentu,
kemudian diambil sejumlah volume tertentu dari pengenceran dan ditanam secara
pour plate atau spread plate di atas medium yang sesuai. Setelah diinkubasikan,
ambil cawan petri yang mempunyai pertumbuhan koloni antara 30 – 300 koloni.
Jumlah mikroorganisme per 1 ml sampel dapat diperoleh dengan mengkalikan
jumlah CFU yang terhitung dengan volume sampel yang diinokulasikan,
kemudian dibagi dengan pengenceran yang digunakan (Gandjar dkk. 1992;
Madigan dkk. 2011; Tortora dkk. 2010:).

Ketika melakukan metode TPC, sampel harus diencerkan terlebih dahulu. Hal
tersebut bertujuan agar koloni mikroba lebih mudah dihitung. Jika tidak dilakukan
pengenceran, jumlah koloni akan sangat padat dan sulit dihitung.  Menurut
standar, jumlah koloni yang baik untuk dihitung pada setiap cawan petri berkisar
antara 30 sampai 300 koloni.

Untuk menghitung sampel mikroba maka langkah pertama yang dilakukan adalah
dengan melakukan pengenceran sampel. Masing-masing seri pengenceran
diinokulasikan ke dalam cawan petri secara spread plate.  Selain itu, sampel
diinokulasi secara duplo yang bertujuan untuk membandingkan hasil inokulasi
pada kedua cawan petri (Jutono dkk. 1980). Berikut gambar cara enumerasi total
mikroba dengan metode TPC:
Cara enumerasi mikroorganisme dengan total plate count

1. Sediakan tabung reaksi sesuai dengan jumlah pengenceran, misal 5

tabung. Masing-masing tabung diisi dengan medium atau aquades
sebanyak 9 ml.
2. Membuat pengenceran sampel yang akan diperiksa mulai dari 10-1 hingga
10-5. Caranya yakni memasukkan 1 ml sampel atau inokulum awal ke
dalam tabung reaksi pertama kemudian kocok, maka konsentrasi tabung
reaksi pertama adalah 10-1. Selanjutnya ambil 1 ml larutan dari tabung
reaksi pertama ke dalam tabung reaksi kedua dan kocok hingga homogen,
maka tabung kedua konsentrasi menjadi 10-2. Lakukan proses tersebut
hingga tabung ke-5
3. Sediakan 5 cawan petri yang berisi medium bakteri. Beri tanda sesuai
dengan urutan pengenceran tabung reaksi.
4. Ambil masing-masing pengenceran dari kelima tabung sesuai dengan jenis
pengenceranya ke dalam cawan petri.
5. Inkubasikan biakan bakteri tersebut selama 24-48 jam di dalam inkubator.
6. Hitung jumlah koloni yang tumbuh pada setiap pengenceran. Jumlah
bakteri yang ada dalam 1 ml sampel adalah berbanding terbalik dengan
pengenceran. Sebagai contoh hasil dari pengenceran 10-5 terdapat 10
koloni, maka jumlah bakteri adalah 10 x 10-5 sel bakteri per 1 ml sampel.

Pengamatan koloni dilakukan selama tahap 24 jam dan 48 jam. Hal tersebut
dikarenakan pertumbuhan sudah mulai terlihat secara signifikan pada waktu 48
jam, kemungkinan pada waktu tersebut merupakan fase log dari pertumbuhan
mikroba. Fase log merupakan fase mikroba mengalami pembelahan sel. Ketika
pengamatan pada tahap 24 jam dilakukan, kemungkinan mikroba masih berada
pada fase lag, yaitu fase mikroba tidak mengalami pembelahan sel dan
peningkatan aktivitas metabolisme (Tortora dkk. 2010).

Satuan yang dipakai dalam penghitungan TPC adalah CFU (Colony Forming
Units).  Satuan tersebut digunakan karena lebih dari satu mikroorganisme dapat
hidup dalam satu koloni.  Rumus yang digunakan adalah:

CFU = rerata koloni : (Jumlah vol. inokulasi x faktor pengenceran)