JUDUL

Penghitungan Jumlah Sel (Hemasitometer, Seri Pengenceran, Teknik Membran Filter, Most
Probable Number Methode)

DASAR TEORI
Perhitungan bakteri adalah suatu cara yang digunakan untuk menghitung jumlah colony
bakteri yang tumbuh pada suatu media pembiakan. Secara mendasar ada dua cara penghitungan
bakteri, yaitu secara langsung dan secara tidak langsung. Ada berbagai cara untuk mengukur
jumlah mikroorganisme, yaitu dengan hitung cawan (plate count), hitungan mikroskopis
langsung (direct microscopic count), atau dengan bantuan alat yang disebut colony counter.
Masing-masing cara memiliki kelebihan dan kekurangan. Beberapa cara perhitungan secara
langsung, antara lain adalah dengan membuat preparat dari suatu bahan (preparat sederhana
diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber). Sedangkan
perhitungan secara tidak langsung hanya mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan
yang masih hidup saja (viable count). Dalam pelaksanaannya ada beberapa cara yaitu
perhitungan pada cawan, perhitungan melalui pegenceran, perhitungan jumlah terkecil atau
terdekat (MPN methode), cara kekeruhan atau turbidimetri (Hadietomo,1990).
Hemasitometer
Haemocytometer sering digunakan untuk menghitung sel-sel darah, organel dalam sel,
sel-sel darah dalam cairan tulang punggung ke otak setelah melakukan tusukan lumbal atau jenis
sel lain (Waluyo, 2009).

Gambar 1. Haemocytometer

Haemocymeter adalah suatu ruang kaca dengan sisi yang menjulang dan kaca penutup
yang akan menahan cairan tepat 0.1 mm dari atas lantai ruang kaca. Ruang hitung memiliki total
luas permukaan 9 mm2 .Ada berbagai macam cara untuk mengukur jumlah sel, antara lain
dengan hitungan cawan (plate count), hitungan mikroskopis langsung (direct microscopic count)
yang menggunakan mikroskop serta ruang hitung (haemositometer) atau secara elektonis dengan
bantuan alat yang disebut penghitung coulter (coulter counter). Penghitungan secara langsung
dapat dilakukan secara mikroskopis yaitu dengan menghitung jumlah bakteri dalam satuan isi
yang sangat kecil. Alat yang digunakan adalah Petroff-Hauser Chamber atau Haemocytometer.
Jumlah cairan yang terdapat antara coverglass dan alat ini mempunyai volume tertentu sehingga
satuan isi yang terdapat dalam satu bujur sangkar juga tertentu (Yustiah, 2011).
Cara menghitung sel individu didalam volume sangat kecil biasanya dilakukan dengan
Counting Chamber. Counting Chamber diatur sedemikian rupa sehingga kotak-kotak dengan
luas tertentu dengan lapisan cairan dengan kedalaman yang diketahui dapat dimasukkan diantara
gelas objek dengan gelas tutup. Akibatnnya volume cairan yang menutupi setiap kotak diketahui
dengan tepat. Perhitungan langsung ini dikenal dengan jumlah sel total (Stainer, 2007).
Pada perhitungan mikroskopis langsung, sampel ditaruh disuatu ruang hitung seperti
Haemocytometer dan jumlah sel ditentukan secara langsung dengan bantuan mikroskop.
Keuntungan metode ini ialah pelaksaannya adalah cepat dan tidak memerlukan banyak peralatan.
Namun kelemahannya ialah tidak dapat membedakan sel-sel yang hidup dan yang mati. Dengan
perkataan lain hasil yang diperoleh ialah jumlah total sel yang didalam populasi (Campbell,
2009).
Perhitungan jumlah koloni atau mikroorganisme dengan cara “Reable Count” atau
disebut juga sebagai standar plate count didasarkan asumsi, bahwa setiap sel mikroorganisme
hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah diinkubasi dalam media biakan
dan lingkungan yang sesuai. Setelah masa inkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan
merupakan perkiraan ataudugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut (Bibiana,
2010)
Tujuan dari percobaan ini adalah untuk menentukan jumlah mikroba pada setiap seri
pengenceran, dan menentukan pengaruh pengenceran terhadap jumlah sel mikroba.

Seri Pengenceran
Teknik biakan murni untuk suatu spesies dikenal dengan beberapa cara, yaitu, cara
pengenceran, cara penuangan, cara penggoresan. Cara pengenceran, cara ini pertama dilakukan
oleh Lister pada tahun 1865. Lister berhasil memelihara murni Streptococcus lactis yang
diisolasi dari susu yang sudah masam. Caranya adalah dengan mengencerkan suatu suspensi
yang berupa campuran bermacam-macam spesies kemudian diencerkan dalam suatu tabung
tersindiri. Dari pengenceran ini kemudian diambil 1 ml untuk diencerkan lebih lanjut (Waluyo,
2007).
Cara penuangan yaitu, terdiri atas penginokulasian biakan campuran kedalam tabung uji
yang mengandung agar mencair yang telah didinginkan pada suhu 45o C. Isinya diaduk untuk
memencarkan bakteri keseluruhan medium. 70 Campuran itu kemudian dituangkan kedalam
cawan petri steril dan dibiarkan menjadi padat. Secara alternatif, inokulum ditempatkan pada
cawan petri kosong dan medium yang mencair dituangan diatasnya. Cawan ini diputar untuk
mencampur isinya sebelum medium menjadi padat (Volk dan Wheeler, 1988).
Cara penggoresan, cara ini dilakukan pada medium pembiakan padat bentuk lempeng.
Bila dilakukan dengan baik cara ini adalah cara yang paling praktis. Setiap laboratorium
memiliki cara atau metode pengerjaan yang berbedabeda, tetapi tujuannya adalah sama, yaitu
untuk membuat garis sebanyak mungkin pada permukaan lempeng medium pembiakan dengan
ose atau jarum bahan pemeriksaan yang terlepas pada garis-garis terakhir koloni-koloni bakteri
yang terbentuk akan terpisah agak jauh (Irianto, 2007)
Pada proses dilusi dapat dilakukan teknik pengenceran bertingkat. Tujuan dari
pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi
dalam cairan.Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung kepada
perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan
pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel
mikroorganisma dari pengenceran sebelumnya.
 Gambar 2. Teknik pengenceran bertingkat
Tujuan dari percobaan ini adalah untuk menentukan jumlah koloni mikroba melalui
metode pour plate, dan menentukan pengaruh pengenceran terhadap jumlah sel mikroba.

Teknik Membran Filter

Mula-mula disaring sejumlah volume tertentu suatu suspensi bahan atau biakan mikroba,
kemudian disaring dengan filter membran yang telah disterilkan terlebih dahulu. Dengan
menghitung jumlah sel rata-rata tiap saat satuan luas pada filter membran, dapat dihitung jumlah
sel dari volume suspense yang disaring. Jika perhitungan secara biasa susah, perlu dilakukan
pengecatan pada filter membran, kemudian filter membran dijenuhi dengan minyak imersi
supaya tampak transparan.

Gambar 3. Metode Membran Filtrasi

Keuntungan metode ini ialah pelaksanaannya cepat dan tidak memerlukan banyak peralatan.

Kelemahannya sebagai berikut:

a) Sel-sel mikroba yang telah mati tidak dapat dibedakan dari sel yang hidup. Karena itu
keduanya terhitung. Dengan kata lain hasil yang diperoleh ialah jumlah total sel yang ada di
dalam populasi. Pada beberapa macam sel eukariotik, penambahan zat warna tertentu
(misalnya biru metilen sebanyak 0,1 %) pada sampel yang akan dihitung dapat membedakan
sel hidup dari sel mati. Pada sel khamir misalnya baik sel hidup maupun sel mati akan
 menyerap biru metilen namun hanya sel hidup mampu mereduksi zat warna tersebut secara
enzimatik menjadi tidak berwarna; jadi sel-sel mati akan tampak biru.
b) Sel-sel yang berukuran kecil sukar dilihat di bawah mikroskop, seperti bakteri karena
ketebalan hemasitometer tidak memungkinkan digunakannya lensa obyektif celup minyak,
sehingga kalau tidak teliti tidak terhitung.  Hal ini biasanya diatasi dengan cara mewarnai sel
sehingga menjadi lebih mudah dilihat.
c) Untuk mempertinggi ketelitian, jumlah sel di dalam suspensi harus cukup tinggi, minimal
untuk bakteri 106 sel/mL. Hal ini disebabkan dalam setiap bidang pandang yang diamati harus
terdapat sejumlah sel yang dapat dihitung
d) Tidak dapat digunakan untuk menghitung sel mikroba di dalam bahan yang banyak
mengandung debris atau ekstrak makanan, karena hal tersebut akan mengganggu dalam
perhitungan sel.
e) Kelemahan lain adalah sulitnya menghitung sel yang berukuran sangat kecil seperti bakteri
karena ketebalan hemasitometer tidak memungkinkan digunakannya lensa obyektif celup
minyak. Hal ini biasanya diatasi dengan cara mewarnai sel sehingga menjadi lebih mudah
dilihat. Kadang-kadang sel cenderung bergerombol sehingga sukar membedakan sel-sel
individu. Cara mengatasinya ialah mencerai-beraikan gerombolan sel-sel tersebut dengan
menambahkan bahan anti gumpal seperti dinatrium etilen diamin tetraasetat dan Tween 80
sebanyak 0,1 %. (Natsir, 2007)

Tujuan dari percobaan ini adalah untuk menentukan jumlah koloni mikroba melalui
metode membrane filter.

Most Probable Number (MPN)

Salah satu metode yang digunakan adalah metode MPN (Most Probable Number), dalam
metode MPN digunakan medium cair di dalam tabung reaksi , dalam hal ini perhitungan
dilakukan berdasarkan jumlah tabung positif. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat
dengan mengamati timbulnya kekeruhan, atau terbentuknya gas di dalam tabung durham untuk
bakteri pembentuk gas. Umumnya untuk setiap pengenceran digunakan 3 atau 5 seri tabung.
Makin banyak tabung yang digunakan dalam perhitungan nilai MPN, akan menunjukkan tingkat
ketelitian yang lebih tinggi. Metode MPN biasanya dilakukan untuk menghitung jumlah bakteri
di dalam contoh berbentuk cair, meskipun dapat pula digunakan untuk contoh berbentuk padat
dengan terlebih dahulu disuspensikan dengan perbandingan 1 : 10 dari contoh tersebut dalam
buffer. Kelompok bakteri yang dapat dihitung dengan metode MPN juga bervariasi bergantung
pada media yang digunakan untuk pertumbuhannya ( Supardi I & Sukamto, 1999).
Metode MPN ini umumnya digunakan untuk menghitung jumlah bakteri pada air
khususnya untuk mendeteksi adanya bakteri koliform yang merupakan kontaminan utama
sumber air minum. Ciri-ciri utamanya yaitu bakteri gram negatif, batang pendek, tidak
membentuk spora, memfermentasi laktosa menjadi asam dan gas yang dideteksi dalam waktu 24
jam inkubasi pada 37º C. Metode MPN terdiri dari tiga tahap, yaitu uji pendugaan (Presumptive
test), uji penegas (Confirmed test), dan uji kelengkapan (Completed test).
Uji penduga dilakukan untuk mendeteksi bakteri E. coli yang teramat kecil porsinya
dalam air. Nilai MPN yang ditunjukkan berdasarkan kombinasi tabung positif dan negatif
tersebut tidak menunjukkan konsentrasi yang sebenarnya, namun berlaku sebagai penunjuk
angka bakteri E. coli dengan derajat kepercayaan (level of significant) dalam arti statistik
sebesar 95%.
Uji penguat atau penegas dilakukan agar uji positif pada uji penduga dapat lebih
tegas menunjukkan bahwa bakteri yang mengkontaminasi sampel air merupakan bakteri
coli fekal atau bakteri coli yang berasal dari tinja. Penentuan nilai MPN juga ditunjukkan
berdasarkan kombinasi tabung positif dan negatif yang dicocokkan dengan tabel MPN
(Rohmawati, dkk., 2012).

Tujuan dari percobaan ini untuk menentukan jumlah populasi sel yang terdapat pada
sampel dengan metode MPN, dan menentukan kualitas sampel air rawa pening secara
mikrobiologis berdasarkan metode MPN

HASIL
Hemasitometer,

Bidang Pandang Total

Pengenceran Kanan
Kanan Atas Tengah Kiri Atas Kiri Bawah
Bawah
10-1 15 35 31 25 30 136
10-2 5 4 8 11 159 187
10-3 7 5 6 8 7 33
10-4 6 5 5 6 7 29
 10-5 1 2 5 4 5 17

total sel per kamar

Rumus = jumlah sel / mL = x 10 5
5

 Pengenceran 10-1 33
jumlah sel / mL = x 10 5 = 6,6 x 105
5
136
jumlah sel / mL = x 10 5 = 27,2 x 105
5  Pengenceran 10-4

29
jumlah sel / mL = x 10 5 = 5,8 x 105
5
 Pengenceran 10-2
 Pengenceran 10-5
187
jumlah sel / mL = x 10 5 = 37,4 x 105
5 17
jumlah sel / mL = x 10 5 = 3,4 x 105
5
 Pengenceran 10-3

Seri Pengenceran Teknik Membran Filter

Pengenceran Jumlah Jumlah koloni = 1 koloni

10-2 375
10 -3
65 4 CFU
Jumlah koloni = 1 x 10
10-4 56 mL
-5
10 17

Total Plate Count :

1 1 1 1

TPC :
( 375 ×
10 )
−2 (
+ 65 ×
10 ) (
+ 56 ×
−3
10 )+(17 ×
−4
10 −5
)

CFU
TPC :59,0625 ×104
mL
MPN Berdasarkan tabel MPN Seri 9, nilai MPN

Konsentrasi Uji Uji jika sampel tidak mengandung bakteri

Sampel Penduga* Penguat* adalah 0,03. Sehingga jika diperhitungkan:
10-3 0 0
-4
10 0 0 1
10 -5
0 0 =1x ×indeks MPN
f . pengenceran
*) Jumlah tabung yang positif
1
=1x ×0,03=300 sel/ mL
10−4

PEMBAHASAN
Pada percobaan penghitungan jumlah sel terdapat 2 macam yaitu penghitungan jumlah
sel secara langsung dan tak langsung . Pada penghitungan secara langsung yaitu ada metode
hitungan cawan , teknik membrane filter, dan Metode Petroff-Hauser. Sedangkan pada
penghitungan secara tidak langsung yaitu ada metode most probable number (MPN). Pada
pembahasan ini akan dibahas satu-persatu mengenai metode-metode tersebut.
Seri Pengenceran
Untuk melaporkan hasil analisis mikrobiologi dengan metode hitungan cawan
digunakan suatu standard yang disebut Standard Plate Count (SPC). Sebelum dilakukan
perhitungan terlebih dahulu dilakukan pengenceran pada masing-masing sampel. Tujuan
daripada pengenceran adalah untuk memperluas bidang hidup sampel sehingga memudahkan
pada saat perhitungan mikroorganisme. Pengenceran dilakukan dengan mensuspensikan sampel
pada air destilat. Tahapan pengenceran dimulai dari membuat larutan sampel sebanyak 10 ml
(campuran 1 ml/1gr sampel dengan 9 ml larutan fisiologis) dalam percobaan ini bakteri yang
digunakan adalah E. coli . Dari larutan tersebut diambil sebanyak 1 ml dan masukkan kedalam 9
ml larutan fisiologis sehingga didapatkan pengenceran 10-2. Dari pengenceran 10-2 diambil lagi 1
ml dan dimasukkan kedalam tabung reaksi berisi 9 ml larutan fisiologis sehingga didapatkan
pengenceran 10-3, begitu seterusnya sampai mencapai pengenceran 10-5. Secara keseluruhan,
tahap pengenceran dijelaskan dalam gambar 2. Setelah dilakukan pengenceran, kemudian
dilakukan penanaman pada media agar PCA. Plate Count Agar (PCA) merupakan media padat,
yaitu media yang mengandung agar sehingga setelah dingin media tersebut akan menjadi padat.
PCA digunakan sebagai medium untuk mikroba aerobik dengan inokulasi di atas permukaan.
Media PCA ini baik untuk pertumbuhan total mikroba (semua jenis mikroba) karena di dalamnya
mengandung komposisi casein enzymic hydrolisate yang menyediakan asam amino dan
substansi nitrogen komplek lainnya serta ekstrak yeast mensuplai vitamin B kompleks. Media
PCA ini digunakan karena media ini yang paling cocok untuk kultur bakteri. Selanjutnya cawan
petri diinkubasikan selama 2 x 24 jam pada suhu 37 ºC. inkubasi dilakukan selama 2 x 24 jam
karena jumlah mikroba maksimal yang dapat dihitung langsung oleh mata.
Setelah dilakukan pengenceran dan inkubasi pada media kontrol ditemukan banyak
koloni kuman dengan bentuk bulat dan berwarna putih yang tumbuh pada permukaan media
PCA dan bakteri dapat dihitung secara langsung, dan berdasarkan pengenceran didapat hasil
jumlah koloni masing-masing cawan seperti pada tabel pengamatan. Dari hasil didapat pada 1 ml

4 CFU
kultur sampel E. Coli adalah sebanyak 9,0625 ×10 . Yang artinya dalam 1 mL larutan
mL

4 CFU
sampel mengandung 9,0625 ×10 sel bakteri. Sehingga berdasarkan hasil jumlah sel
mL
tersebut dikatakan sesuai dimana prinsip pengenceran adalah menurunkan jumlah sehingga
semakin banyak jumlah pengenceran yang dilakukan, makin sedikit jumlah mikrobia.

Hemasitometer
Hitungan mikroskopis langsung merupakan salah satu metode perhitungan jumlah
mikroba. Dasar hitungan dari metode ini adalah dengan menentukan jumlah sel rata-rata setiap
petak (ruangan) yang telah diketahui volumenya (Raharja, 2013). Pada perhitungan mikroskopis
langsung, sampel diletakkan di suatu ruang hitung seperti Haemocytometer (Gambar 1) dan
jumlah sel ditentukan secara langsung dengan bantuan mikroskop.
Berdasarkan percobaan yang dilakukan, untuk mengamati jumlah sel bakteri,
haemocytometer disterilkan kemudian diletakkan gelas penutup diatasnya. Pengenceran 10-1, 10-2
, 10-3, 10-4 dan 10-5 diamati secara berurutan dengan meneteskan larutan pada haemocytometer
dan diamati dibawah mikroskop. Hand counter digunakan untuk menghitung bakteri yang dapat
diamati. Pada metode ini didasarkan pada prinsip pengenceran lagi dimana bertujuan untuk
memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan sehingga jumlah
mikroba lebih mudah untuk diamati.
 Prinsip dari cara pemakaian alat ini adalah dengan menempatkan 1 tetes suspensi
mikrobia pada ruang hitung yang terdiri dari 9 kotak besar yang luasnya 1 mm 2. Hemositometer
dengan ukuran besar, 1 x 1 mm (1 mm2) ini dibagi dalam 3 cara: 0,25 x 0,25 mm (0,0625 mm2),
0,25 x 0,20 mm (0,05 mm2) dan 0,20 x 0,20 mm (0,04 mm 2). Pusat, 0,20 x 0,20 mm ditandai, 1 x
1 mm2 yang kemudian dibagi lagi menjadi 0,05 x 0,05 mm (0,0025 mm 2). Struktur sel-ukuran
yang akan dihitung adalah yang terletak antara tengah tiga baris di atas dan kanan alun-alun dan
dari tiga baris di bagian bawah dan kiri alun-alun. Sel bakteri yang tersuspensi akan memenuhi
volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui dan
dapat digunakan sebagai data dalam rumus untuk mengetahui jumlah sel mikrobia tiap ml.
Dalam hal ini mikroba yang akan diamat adalah Saccharomyces sp. Mikroba jenis ini
digunakan karena jenis mikroba ini dapat tumbuh dengan cepat dalam suatu media sehingga
untuk proses pengamatan dapat dengan relatif lebih cepat dilakukan. Setelah dilakukan
pengamatan pada mikroskop didapatkan hasil : Pengenceran 10-1 = 27,2 x 105, Pengenceran 10-2 =
37,4 x 105, Pengenceran 10-3 = 6,6 x 105, Pengenceran 10-4 = 5,8 x 105, Pengenceran 10-5 = 3,4 x
105. Yang artinya pada setiap sel terdapat 27,2 x 105 jumlah mikroba nya. Setelah dilakukan
perhitungan dapat terlihat bila jumlah pangkat pengenceran makin kecil maka jumlah bakteri
makin sedikit. Akan tetapi terlihat penyimpangan pada pengenceran 10-2 dimana jumlah selnya
melebihi jumlah sel yang ada pad pengenceran 10 -1. Hal tersebut dapat terjadi disebabkan karena
terdapat beberapa faktor sewaktu penghitungan sel yaitu:
1. Subyektivitas pengamatan, dimana pengamatan tidak dilakukan hanya dengan 1 praktikan
melainkan terdapat lebih dari 1 sehingga dapat dimungkinkan perbedaan penglihatan
sewaktu menghitung sel
2. Penumpukan koloni
Teknik Membran Filter
Pada metode selanjutnya dilakukan menggunakan teknik membrane filter. Pada teknif
membrane filter ini merupakan suatu teknik pemisahan campuran 2 atau lebih komponen tanpa
menggunakan panas. Komponen-komponen akan terpisah berdasarkan ukuran dan bentuknya,
dengan bantuan tekanan dan selaput semi-permeable. Hasil pemisahan berupa retentate (bagian
dari campuran yang tidak melewati membran) dan permeate (bagian dari campuran yang
melewati membran). Prinsip tekhnik filtrasi membran ini adalah dengan menyaring cairan
sampel melewati saringan yang sangat tipis. Membran ini memiliki pori-pori berukuran
mikroskopis dengan diameter lebih kecil daripada ukuran sel mikroba pada umumnya. Jadi
selama proses penyaringan berlangsung, sel-sel yang terdapat pada sempel akan terjebak dari
peralatan filtrasi kedalam cawan petri berisi media. Kertas membran ini bersifat solid sehingga
dapat menahan sel yang terjebak tetap pada posisinya dan kemudian dapat berkembang tanpa
bercampur dengan sel lain yang ikut terjebak juga. Nutrisi yang terdapat pada media akan
berdifusi dan terserap kedalam kertas membrane sehingga sel-sel yang tersebar acak dan kasat
mata itu dapat tumbuh menjadi koloni yang dapat dihitung dengan mata telanjang setelah
melewati masa waktu inkubasi tertentu. Bentuk, warna dan sifat lain dari masing-masing koloni
tergantung kepada jenis mikroba yang berada pada kertas membrane.
Dalam hal ini mikroba yang digunakan adalah E.Coli mikroba ini dilakukan
penyaringan menggunakan membran filter dan kemudian memban yang berisi sel-sel mikroba
tadi ditanam pada media NA. NA ini merupakan salah satu media yang umum digunakan dalam
prosedur bakteriologi seperti uji biasa dari air, sewage, produk pangan, untuk membawa stok
kultur, untuk pertumbuhan sampel pada uji bakteri, dan untuk mengisolasi organisme dalam
kultur murni. Selanjutnya cawan petri diinkubasikan selama 2 x 24 jam pada suhu 37 ºC.
inkubasi dilakukan selama 2 x 24 jam karena jumlah mikroba maksimal yang dapat dihitung
langsung oleh mata.
Terlihat pada hasil pengamatan hanya didapatkan 1 jumlah koloni yang ada pada cawan

CFU
petri dengan kata lain terdapat 1 x 104 pada sel E. Coli. PAda teknik membrane ini
mL
seharusnya pertumbukan mikroba akan terlihat hanya pada kertas membrane nya saja, akan
tetapi pada kenyataanya menunjukan mikroba yang terlihat menyebar ke seluruh permukaan
media sehinga terlihat hanya terdapat 1 koloni. Hal tersebut dapat terjadi karena ketidak sterilan
pada saat penanaman bakteri pada medium selain itu juga pada waktu filtrasi yang dilakukan.

MPN
Pada percobaan ini dilakukan untuk mengetahui kandungan / kualitas dalam sampel
dalam hal ini sampel yang digunakan ialah minuman perisa jeruk ‘Pulpy Orange’ yang sudah
kadaluarsa secara mikrobiologi untuk mengetahui ada tidaknya bakteri E. Coli dalam sampel
tersebut. Pemeriksaan ini dilakukan dengan uji mikroba menggunakan metode MPN. Metode
MPN merupakan salah satu metode perhitungan secara tidak langsung. Metode MPN terdiri dari
tiga tahap yaitu, uji dugaan (presumptive test), uji penetapan (confirmed test), dan uji pelengkap
(completed test). Metode MPN biasanya dilakukan untuk menghitung jumlah bakteri terutama E.
Coli. Bakteri E. Coli ini banyak dijumpai pada sistem pencernaan manusia yang ada dalam
dalam sampel. Uji ini mendeteksi sifat fermentatif coliform dalam sampel. Karena beberapa jenis
bakteri selain coliform juga memiliki sifat fermentatif, diperlukan uji konfirmasi untuk mengetes
kembali kebenaran adanya coliform dengan bantuan medium selektif diferensial. Uji
kelengkapan kembali meyakinkan hasil tes uji konfirmasi dengan mendeteksi sifat fermentatif
dan pengamatan mikroskop terhadap ciri-ciri coliform: berbentuk batang, Gram negatif, tidak-
berspora

Dalam metode MPN ini digunakan dengan dua tahap uju yaitu uji penduga dan uji
penguat. Uji penduga dalam percobaan ini dilakukan dengan menggunakan 9 tabung reaksi yang
berisi sampel dan media LB dimana masing-masing 3 tabung dengan konsentrasi 10 -3, 10-4, dan
10-5. Sedangkan untuk uji penguat menggunakan hasil yang positif dari uji penduga. Percobaan
diawali dengan pengenceran sampel dengan konsentrasi 10-3, 10-4, dan 10-5. Proses pengenceran
dilakukan didalam inkas agar alat yang digunakan tetap steril. Setelah itu, dimasukkan 1 ml
sampel dari masing-masing pengenceran sebanyak 3 kali ke dalam media cair LB . Setelah itu,
tabung reaksi didiamkan selama 2 hari. Setelah didiamkan selama 2 hari, hasil uji penduga dari
semua sampel negatif / tidak terdeteksi adanya bakteri karena pada media tidak muncul
gelembung udara dimana pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati
timbulnya kekeruhan, atau terbentuknya gas di dalam tabung.

Akan tetapi tidak semua hasil positif pada uji penduga ini ditunjukkan dengan timbulnya
gas dan kekeruhan, karena pada tabung tersebut bisa saja mikroba lainnya memiliki kemampuan
untuk mem-fermentasikan laktosa dengan membentuk gas, seperti contohnya bakteri asam laktat
dan beberapa khamir tertentu. Sehingga diperlukan uji penguat untuk memastikan bahwa bakteri
yang diuji merupakan bakteri koliform. Pada uji penguat ini digunakan media berupa Brilliant
Green Lactose Bile Broth (BGLBB) dimana dasar penggunaan media ini adalah karena sifat
selektif dari media BGLBB yang mengandung asam bile, dimana asam bile dapat menghambat
bakteri gram positif termasuk koliform. Dan pada uji penguat ini tidak ditemukan kembali hasil
yang positif karena pada ketiga tabung tersebut sama-sama tidak muncul gas sebagai indikasi
positif dan dengan hasil tersebut dapat diketahui nilai MPN-nya, yaitu sebesar 300 sel/ml.
Berdasarkan Standar Nasional Indonesia (SNI) No.01-3553 Tahun 2006, tentang persyaratan air
minum dalam kemasan, ditetapkan bahwa batas pencemaran mikroba yaitu 1,0 × 102 koloni/mL
air minum. Hal ini membuktikan bahwa sampel minuman perisa jeruk ‘Pulpy Orange’ yang
sudah kadaluarsa tidak layak untuk dikonsumsi karena nilai MPN-nya melebihi standar
maksimum SNI.

Adanya cemaran bakteri ini disebabkan karena berakhirnya masa simpan sampel, dimana
penurunan kualitas makanan/minuman pasti akan terjadi sejalan dengan bertambahnya umur.
Salah satu indikasi bahwa saat penurunan mutu telah tiba adalah dengan melihat kode atau
tanggal kadaluarsa yang tercantum disalah satu sisi dari kemasan. Beberapa faktor yang
mempengaruhi penurunan mutu diantaranya suhu, kelembaban, oksigen, dan sinar. Kecepatan
penurunan mutu tersebut tergantung jenis produk, kemasan, dan kondisi lingkungan
penyimpanan. Sehingga keberadaan dari bakteri koliform kemungkinan pertumbuhan
Salmonella, Shigella, dan Staphylococcus [ CITATION Eul08 \l 1057 ].

KESIMPULAN
Seri Pengenceran

1. Dapat ditentukan jumlah koloni mikroba melalui metode pour plate pada sampel adalah

CFU
9,0625 ×10 4 CFU/ mL.
mL
2. Dapat ditentukan bahwa semakin banyak dilakukan pengenceran maka akan semakin
sedikit jumlah koloni mikroba yang didapat

Teknik Memran Filter

CFU
1. Dapat ditentukan jumlah sel E. Coli melalui teknik membran filter adalah 1 x 104
mL

Hemasitometer

1. Dapat ditentukan jumlah mikroba untuk setiap seri pengenceran adalah :

 Pengenceran 1 = 27,2 x 105sel/mL
 Pengenceran 2 = 37,4 x 105sel/mL
  Pengenceran 3 = 6,6 x 105sel/mL
 Pengenceran 4 = 5,8 x 105, sel/mL
 Pengenceran 5 = 3,4 x 105sel/mL
2. Dapat ditentukan bahwa semakin banyak dilakukan pengenceran maka akan semakin
sedikit jumlah sel mikroba yang dapat dihitung.

MPN

1. Dapat ditentukan jumlah populasi sel yang terdapat pada sampel dengan metode MPN
yakni sebesar 300 sel/ ml.
2. Dapat ditentukan kualitas sampel minumam ini secara mikrobiologis berdasarkan metode
MPN tidak layak untuk dikonsumsi, karena karena nilai MPN-nya melebihi standar
maksimum SNI.

DAFTAR PUSTAKA
Bibiana, 2010. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT. Raya Grafindo Persada. Jakarta.

Campbell, A., 2009. Biologi.Erlangga. Jakarta

Eulis, T. M., Ellin, H., & Hadayati, Y. A. (2008). Analisa Kandungan N, P dan K pada lumpur
hasil ikutan Gasbio (sludge) yang terbuat dari feses sapi perah. Bogor: Seminar Nasional
Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan.

Hadioetomo, R.S. 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta: Gramedia.

Natsir. 2007. Biologi. Erlangga. Jakarta.

Raharja, D.A. 2013. Kuantitasi Mikroba: Hitungan Mikroskopis Langsung. Laporan Praktikum.
Program Keahlian Analisis Kimia Institut Pertanian Bogor. Bogor.

Rianto, K. 2007. Mikrobiologi Umum. CV Yrama Widya. Bandung.

Stainer J., 2007. Dunia Mikroba 1. Biantara Aksara. Jakarta.

Supardi dan Sukamto. 1999. Mikrobiologi dalam Pengolahan Pangan. Bandung:

Penerbit Alumni.

Volk, W.A., dan Wheeler, M.F., 1993. Mikrobiologi Dasar.Erlangga. Jakarta.

Waluyo, L,. 2007. Mikrobiologi Umum. UPT Penerbita UMM. Malang.

Waluyo, L., 2009. Mikrobiologi Umum. UPT Penerbitan UMM. Bandung

Yustiah yusi. 2011. Mikrobiologi dasar. http://blog.uad.ac.id/. Diakses tanggal 1 April 2018.

DAFTAR PUSTAKA
Lampiran Hasil Pengamatan

LAMPIRAN 1

Hasil Pengamatan

Seri Pengenceran

Teknik Membran Filter