Sodium dodecyl sulfate-

polyacrylamide gel electrophoresis

and western blotting analyses via
colored stacking gels
by: Makoto Hagiwara

Resume by: Kelompok 4

Fauzul Iman
Feliya Salsabila
Sindi Juliah

Dosen Pengampu:
Prof. Dr. Teuku Mohamad Iqbalsyah, S.Si, M.Sc
 Table Of Content
01 02
Introduction Experimental

03 04
Results and Conclusions
Discussion
 01
Introductions
 Pendahuluan
• Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) didirikan oleh Laemmli
pada tahun 1970 yang telah digunakan sebagai alat standar untuk analisis protein di
laboratorium di seluruh dunia.
• Tricine-SDS-PAGE dikembangkan oleh Schager dan Von Jagow pada tahun 1987 untuk
mendeteksi protein dengan massa molekul di bawah 20 kDa. Setelah protein dipisahkan dengan
SDS-PAGE lalu diwarnai menggunakan metode seperti Coomassie brilliant blue (CBB) dan silver
staining.
• Western blotting merupakan teknik yang populer untuk mendeteksi protein target dengan
antibodi spesifik melalui SDS-PAGE.
• Stacking gel (gel susun) yang digunakan untuk SDS-PAGE standar adalah transparan dan kurang
jelas. Oleh karena itu, memuat sampel ke dalam stcacking gel wells (sumur gel susun) dapat
menjadi tantangan tersendiri.
• Untuk mengatasi masalah ini, pewarna asam (tartrazine (kuning) , brilliant blue FCF (biru), or
new coccine (merah)) ditambahkan ke stacking gel SDS-PAGE. Meskipun beberapa negara telah
melarang penggunaannya, tartrazine, brilliant blue FCF, dan new coccine digunakan sebagai
pewarna makanan di Jepang dan negara lain.
• Dalam penelitian ini, gel SDS-poliakrilamida baru yang mengandung tartrazine, brilliant blue
FCF, dan new coccine disiapkan, dan kinerjanya diverifikasi oleh SDS-PAGE dan western blotting
analisis.
 02
Experimental
 Bahan
• Sel HeLa • DynaMarker Protein MultiColor III Ladder Marker
• DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) • Sample buffer (Tris-HCl, SDS, glyserol, 2-merkaptoetanol,
mengandung FBS (Fetal Bovine Serum) 10% BPB/Bromophenol blue)
• Penisilin 100 U/mL • Glisin
• Streptomisin 100 μg/mL • metanol
• Tartrazin • Tween 20
• FCF berlian biru • Reagen Chemiluminescene
• Kokin baru • Tikus anti-EEA1 IgG
• Membran PVDF • Kelinci anti-Rab5 IgG
• PVDF blocking reagent • HRP-conjugated anti-tikus IgG
• Ponceau-S • HRP-conjugated anti-kelinci IgG
• Gel SDS-PAGE • Buffer fosfat (PBS, NaCl, Na2HPO4, KCl, KH2PO4)
 Metode
1. Kultur Sel
• Sel dikultur dalam DMEM (media Dulbecco yang dimodifikasi Eagle) yang mengandung
serum janin sapi 10%, penisislin 100 U/mL dan streptomisin 100 μg/mL dalam inkubator
CO2 5% yang dilembabkan

2. Reagen dan Antibodi

• Reagen dan anibodi berasal dari tartrazin, FCF berlian biru dan kokin baru
• Disiapkan DynaMarker protein multicolor III ladder marker dan membran PVDF
• Disiapkan juga Ponceau-S, reagen pemblokiran pvdf, tikus anti EE-A1 IgG dan kelinci anti-
Arb5 IgG serta IgG anti-tikus terkonjugasi HRP dan IgG anti-kelinci terkonjugasi HRP
 Metode
3. SDS-PAGE dan Wastern Blotting
• Sel HeLa dihomogenisasi dalam Fosfat buffer salin (PBS, NaCl 137 mM, Na2HPO4 8,1 mM, KCl 2,68 mM,
KH2PO4 1,47 mM, [pH 7,4]) dengan homogenizer lalu disentrifuse dan dihasilkan lisat
• Stacking gel mengandung (tartrazin 0,035%, FCF berlian biru 0,02%, dan kokin baru 0,0375%)
• DynaMarker protein multicolor II ladeer marker atau lisat sel HeLa dalam sampel buffer SDS-PAGE
(konsentrasiakhir: Tris-HCl [62,5 mm, pH 6,8], SDS 2%, gliserol 10%, 2-merkaptoetanol 5%,
bromophenol blue 0,0025%) dikenai 12% SDS-PAGE engan buffer elektrolisis (Tris 25 mM, 250 mM
glisin, SDS 0,1%) menggunakan ruang elektrolisis
• Lalu diikuti dengan transfer dari gel ke membran PVDF dengan buffer transfer (Tris 20 mM, glisin 150
mM, metanol 10%) menggunakan alat tangki basah
 Metode
• Membran PVDF diwarnai dengan Ponceau-S dan dibilas dengan air
• Membran dicuci beberapa kali selama 5 menit sambil dikocok dengan PBS dan Tween 20
0,1% untuk menghilangkan Ponceau-S dari protein yang diwarnai
• Kemudian membran PVDF diinkubasi dengan reagen pemblokiran PVDF selama 60
menit pada suhu kamar dan dicuci 3 kali dengan TBST selama 5 menit sammbil dikocok
• Setelah memblokir, membran PVDF diinkubasi semalaman dengan antibodi primer pada
suhu 4ºC lalu dicuci 3 kali dengan PBST selaam 5 menit dengan
pengocokan
• Lalu membran PVDF diinkubasi dengan antibodi sekunder selama 60
menit pada suhu kamar dan dicuci dengan PBST minimal 3 kali sambilan
dikocok
• Membran PVDF ditaburi ImmunoStar LD dan pendaran terdeteksi
 03
Results
and discussions
 Hasil dan Pembahasan

Gambar 1. Standar (penumpukan gel tanpa pewarnaan) (A) dan elektroforesis yang lebih baik (menumpuk gel
dengan pewarna) (B–D); (B) tartrazine; (C) FCF berlian biru; (D) atau kokin baru, ditambahkan ke larutan gel
susun poliakrilamida. Setelah pemadatan gel, protein dielektroforesis menggunakan SDS-poliakrilamida gel.
Kemampuan gel didemonstrasikan menggunakan DynaMarker Protein Penanda Tangga MultiWarna III. SDS,
sodium dodecyl sulfat. (Untuk interpretasi referensi warna dalam legend gambar ini, pembaca dirujuk ke versi
Web artikel ini)
 Hasil dan Pembahasan

Gambar. (A) elektroforesis yang lebih baik (menumpuk gel dengan pewarna) (B–D)

Gambar. (B) tartrazine

 Hasil dan Pembahasan

Gambar. (C) FCF berlian biru

Gambar. (D) atau kokin baru

 Hasil dan Pembahasan

Gambar 2. Transfer dan efisiensi deteksi dengan western blotting menggunakan standar (A) dan gel susun pewarna
(B – D); (B) Western blotting menggunakan gel susun yang mengandung tartrazine; (C) FCF berlian biru; (D), atau
kokin baru, menunjukkan bahwa transfer ke membran PVDF dan deteksi sampel protein tetap tidak terpengaruh.
Efisiensi transfer protein diverifikasi menggunakan pewarnaan Ponceau-S, dan efisiensi deteksi protein diselidiki
menggunakan antibodi anti-Rab5 dan anti-EEA1. Waktu pemaparan sama dengan yang digunakan dalam analisis
western blotting.
 04
COnclusions
 Kesimpulan
• Gel SDS-poliakrilamida baru yang mengandung tartrazine, brilliant blue
FCF, dan new coccine dikembangkan berdasarkan proses SDS-PAGE
saat ini.
• Stacking gel yang baru memungkinkan visualisasi well (sumur) dan
pembuatan sampel yang mudah.
• Kinerja gel berwarna ini sebanding dengan gel standar tanpa warna
THANK
YOU!!!