PENENTUAN KADAR TRIGLISERIDA, HDL DAN LDL DALAM SAMPEL DARAH

Nama : HIDAYATURAHMAN
NIM : 19231021
Kelas : A
Asisten : Annisa Ayu

I. Tujuan
Praktikum ini bertujuan untuk menentukan:
1. Kadar trigliserida dalam darah dengan metode GPO-PAP
2. Kadar HDL Kolesterol dalam darah dengan metode CHOD-PAP
3. Kadar LDL Kolesterol dalam darah

II. Alat dan Bahan

Peralatan yang digunakan pada praktikum ini adalah mikropipet, sentrifuge, kuvet, spektrofotometer
dan alat gelas. Bahan yang digunakan pada penentuan trigliserida adalah larutan reagen trigliserida,
larutan standar trigliserida 200 Mg/dL dan sampel darah. Reagen GPO-PAP terdiri dari :
1. Good’s buffer pH 7,2 dengan konsentrasi 50 mmol/L
2. 4-Chlorophenol dengan konsentrasi 4 mmol/L
3. ATP dengan konsentrasi 2 mmol/L
4. Mg2+ dengan konsentrasi 15 mmol/L
5. Glycerokinase (GK) dengan konsentrasi ≥ 0,4 kU/L
6. Peroxidase (POD) dengan konsentrasi ≥ 2 kU/L
7. Lipoprotein lipase (LPL) dengan konsentrasi ≥ 4 kU/L
8. 4-Aminoantipyrine dengan konsentrasi 0,5 mmol/L
9. Glycerol-3-phosphate-oxidase (GPO) dengan konsentrasi ≥ 1,5 kU/L
Bahan yang digunakan pada penentuan HDL Kolesterol adalah larutan reagen Kolesterol, larutan
presipitasi dan larutan standar HDL …. Mg/dL dan sampel darah. Reagen PEG/CHOD-PAP terdiri dari :
1. Good’s buffer pH 6,7 dengan konsentrasi 50 mmol/L
2. Phenol dengan konsentrasi 5 mmol/L
3. 4-Aminoantipyrine dengan konsentrasi 0,3 mmol/L
4. Cholesterol esterase (CHE) dengan konsentrasi ≥ 200 U/L
5. Cholesterol oxidase (CHO) dengan konsentrasi ≥ 50 U/L
6. Peroxidase (POD) dengan konsentrasi ≥ 3 kU/L

III. Cara Kerja

a. Pengambilan sampel darah
Pengambilan sampel darah umumnya menggunakan teknik venipunktur. Venipunktur
adalah proses pengambilan darah melalui pembuluh vena dengan menggunakan jarum kecil.
Prosedurnya adalah lengan akan dibalut dengan pengikat lengan atau tourniquet oleh dokter atau
petugas medis. Tujuannya untuk memperlambat aliran darah dan menjadikan pembuluh vena
lebih menonjol. Hal ini membuat proses pengambilan darah lebih mudah. Kemudian letak
 pembuluh vena diidentifikasi oleh petugas medis lalu area tersebut dibersihkan dengan alkohol.
Darah diambil menggunakan jarum. Bekas tusukan ditutup menggunakan plester.

b. Penentuan kadar trigliserida dalam darah dengan metode GPO-PAP

Sampel darah dipersiapkan terlebih dahulu ± 2 mL, kemudian sampel disentrifuge. Plasma
darah yang dihasilkan dipipet sebanyak 0,010 mL menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke
dalam kuvet yang telah disiapkan dengan ketentuan seperti pada Tabel 1.
Tabel 1. Jumlah blanko, standar, sampel dan reagen yang digunakan untuk penentuan TG
Kuvet Blanko (μL) Standar (μL) Sampel (μL)
Darah - - 10
Larutan standar - 10 -
Akuades 10 - -
Reagen 1000 1000 1000

Ketiga larutan dalam kuvet diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37°C atau 15 menit pada
suhu 25oC. Absorbansi sampel, blanko, dan standar reagen diukur pada panjang gelombang 505
nm (Hg 546 nm) dalam 60 menit.

c. Penentuan kadar HDL Kolesterol dalam darah dengan metode PEG/CHOD-PAP

Sampel darah dipersiapkan terlebih dahulu ± 0,1 mL, kemudian sampel ditambahkan 0,1
mL reagen presipitasi dan campuran disentrifug pada 2500 – 3000 rpm selama 5 menit. Plasma
darah yang dihasilkan dipipet sebanyak 0,050 mL menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke
dalam kuvet yang telah disiapkan, dengan ketentuan seperti Tabel 2.
Tabel 2. Jumlah blanko, standar, sampel dan reagen yang digunakan HDL Kolesterol
Kuvet Blanko (μL) Standar (μL) Sampel (μL)
Darah - - 10
Larutan standar - 10 -
Akuades 10 - -
Reagen 1000 1000 1000
Ketiga larutan dalam kuvet diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37°C atau 15 menit pada
suhu 25oC. Absorbansi sampel, blanko, dan standar reagen diukur pada panjang gelombang 505
nm (Hg 546 nm) dalam 60 menit.

IV. Hasil dan Pembahasan

a. Penentuan Trigliserida
Trigliserida merupakan senyawa yang terdiri dari gliserol dan asam lemak dimana dalam
darah merupakan jenis lemak non kolesterol. Penentuan trigliserida dalam serum/plasma dapat
menggunakan reaksi enzimatik dengan prinsip metode kolorimetrik enzimatik (GPO-PAP) yaitu
pengukuran trigliserida setelah pemecahan enzimatik dengan lipoprotein lipase. Indikatornya
adalah quinoneimine yang dihasilkan dari 4 – aminoantipyrine dan 4 – klorofenol oleh hidrogen
peroxsidase di bawah aksi katalitik dari peroxsidase kemudian membentuk kompleks warna yang
dapat diukur kadarnya mengunakan spektrofotometer. Senyawa kompleks yang terbentuk adalah
4-(p-benzokinon-monoimino)-fenazon yang berwarna kuning kecoklatan yang kemudian diukur
serapannya pada panjang gelombang 546 nm (Guder, 2001).
 tahapan reaksi penentuan ini ada 3 tahap yaitu:
1. Reaksi hidrolisis TG
Enzim lipase/LPL
Trigliserida + H2O Gliserol + asam lemak

2. Reaksi oksidasi gliserol

Gliserol kinase
Gliserol + ATP Gliserol-3-phospate + ADP

Gliserol-3-phospate + ADP GPO Dihydroxyaceton phospate + H2O

3. Reaksi pembentukan kompleks berwarna

Peroxidase
2H2O2 + Aminoantipyrine + Quinoneimine + HCl + 4H2O
4-Chlorophenol

Tabel 3. Tahapan penambahan reagen pada penentuan TG

No Tahapan prosedur Pengamatan
1 Penambahan reagen Warna larutan menjadi pink kecoklatan.
o
2 Inkubasi pada suhu 37 C Penggunaan suhu 37oC karena suhu tersebut merupakan suhu
selama 5 menit optimum untuk reaksi enzimatis dan reaksi semakin cepat
berlangsung.
3 Panjang gelombang Dibaca pada 500 nm.
4 Blanko Fungsi penggunaan larutan blangko adalah sebagai pelarut dan
untuk mengetahui besarnya serapan oleh zat yang bukan analit.
5 Pembacaan absorbansi Pembacaan harus sesegera mungkin dilakukan karena
maksimal 60 menit setelah dikhawatirkan jika terlalu lama, larutan akan mengalami
inkubasi kerusakan maka pembacaan harus sesegara mungkin.

Tabel 4. Hasil pengukuran spektrofotometri pada penentuan TG

No Keterangan A1 A2 A3 A rata-rata
1 Standar 0,123 0,233 0,211 0,189
2 Sampel 1 0,484 0,472 0,485 0,4803
3 Sampel 2 0,429 0,397 0,419 0,415

,
C 1= ×C = × 200 = 508,2539 (mg/dL)
,

C 1 = 508, 2539 × 0,0114 = 5,794 0 (mmol/L)

,
C 2= ×C = × 200 = 439,1534 (mg/dL)
,

C 2 = 439, 1534 × 0,0114 = 5,0063 (mmol/L)

 Hasil analisis menunjukkan bahwa level TG dalam darah pada sampel 1 adalah 508,2539 (mg/dL)
atau 5,7940 mmol/L dan pada sampel 2 adalah 439,1534 (mg/dL) atau 5,0063 mmol/L dibandingkan
dengan nilai ekspektasi TG pada orang dewasa adalah 150 mg/dL atau 1500 mg/L. Beberapa
interferen pada pemeriksaan ini adalah:
1. Gliserol
2. Asam askorbat
3. Billirubin, kadar billirubin tinggi menyebabkan gangguan
4. Hemolisis, hemolisis berlebihan mengganggu reaksi dan kolorimetri
5. Carryover, merupakan kesalahan hasil suatu sampel yang disebabkan pengaruh dari sampel yang
diperiksa sebelumnya

b. Penentuan HDL Kolesterol

HDL merupakan bagian dari komponen lipoprotein yang berdensitas tinggi. Penentuan HDL
kolesterol dalam darah dapat dilakukan dengan metode enzimatik PEG/CHOD-PAP yang
memiliki prinsip metode menggunakan alfa-siklodekstrin tersulfat dengan adanya Mg2+ yang
membentuk kompleks dengan kandungan apoB lipoprotein dan kolesteril esterase yang
digabungkan dengan polietilen glikol dan kolesterol oksidase untuk pengukuran kolesterol HDL.
Tahapan reaksi pada penentuan ini ada 4 tahapan yaitu :
1. Reaksi blocking ApoB
ApoB mengandung lipoprotein + α-siklodekstrin + Mg2+ + dekstran SO4  larut non-rekatif
kompleks dengan lipoprotein yang mengandung ApoB.
2. Reaksi hidrolisis HDL kolesterol ester

HDL-Cholesterol esters HDL-unesterified cholesterol +fatty acid

3. Reaksi oksidasi enzimatik

Unesterified chol + O2 Cholestenone +H2O2

4. Pembentukan kompleks berwarna

Peroxidase
Qunoneimine dye + H2O
H2O2 + 5-aminophenazone +N-
ethyl-N-(3-methylphenyl)-
N’_succinyl ethylene diamine +
H2O + H+

Tabel 5. Tahapan penambahan reagen pada penentuan HDL Chol

No Tahapan prosedur Pengamatan

1 Presipitasi
Reagen + presipitan
2 Penambahan reagen Serum mengalami presipitasi menjadi jernih
Reagen + serum
3 Penambahan reagen CHOD- Warna larutan menjadi pink kecoklatan
PAP
4 Inkubasi pada suhu 37oC Penggunaan suhu 37oC karena suhu tersebut merupakan suhu
selama 5 menit optimum untuk reaksi enzimatis dan reaksi semakin cepat
berlangsung.
5 Panjang gelombang Dibaca pada 500 nm
6 Blanko Fungsi penggunaan larutan blangko adalah sebagai pelarut dan
untuk mengetahui besarnya serapan oleh zat yang bukan analit.
7 Pembacaan absorbansi Pembacaan harus sesegera mungkin dilakukan karena
maksimal 60 menit setelah dikhawatirkan jika terlalu lama, larutan akan mengalami
inkubasi kerusakan maka pembacaan harus sesegara mungkin.

Tabel 4. Hasil pengukuran spektrofotometri pada penentuan HDL Chol

No Keterangan A1 A2 A3 A rata-rata
1 Standar 0,825 0,826 0,826 0,8256
2 Sampel 1 0,463 0,463 0,463 0,463
3 Sampel 2 0,308 0,302 0,308 0,306

,
C 1= ×C × 2 (mg/dL) = ,
× 200 × 2 (mg/dL) = 224,322 (mg/dL)

,
C 1= ×C × 2 (mg/dL) = × 200 × 2 (mg/dL) = 148,256 (mg/dL)
,

Hasil analisis menunjukkan bahwa level HDL Chol dalam darah 361,3527 (mg/dL) pada sampel 1 dan
314,4927 (mg/dL) pada sampel 2 dibandingkan dengan nilai ekspektasi HDL Chol pada orang dewasa
adalah ≤ 40 mg/dL atau 400 mg/L. Beberapa interferen pada pemeriksaan ini adalah:
1. Ikterik, bila kadar billirubin terkonjugasi 16 mg/dl, billirubin tidak terkonjugasi 14 mg/dl
2. Hemolisis, bila konsnetrasi hemoglobin 700 mg/dl
3. Lipemi berhubungan dengan trigliserida
4. Intosikasi asetaminofen menyebabkan hasil rendah palsu

c. Penentuan LDL Kolesterol

Pemeriksaan LDL Chol dilakukan dengan metode tidak langsung menggunakan data konsentrasi
kolesterol total, TG dan HDL Chol. Formula yang digu nakan adalah formula Fridewald :

mg Trigliserida
LDL sampel 1 = Total kolesterol − − kolesterol HDL
dl 5

,
LDL sampel 1 338,7209 − −224,322 mg/dl = 12,74832 mg/dl

439,153
LDL sampel 2 358,4884 − 4 148,256 mg/dl = 122,40172 mg/dl

LDL rata-rata = 67,57502 mg/dl

 Hasil analisis menunjukkan bahwa sampel mengandung LDL Chol rata-rata sebesar 67,57502
mg/dl, di mana pada sampel 1 12,74832 mg/dl dan sampel2 122,40172 mg/dl dibandingkan
dengan LDL Chol orang dewasa adalah <100 mg/dl atau <1000 mg/L. Nilai TG/5
mengekspresikan nilai lipoprotein tinggi gliserida. Secara umum, kadar LDL Chol
direpresentasikab sebagai penyebab utama penyakit jantung coroner.

V. Kesimpulan
Kesimpulan yang dapat ditarik dari praktikum kali ini adalah

1. Kadar trigliserida dalam darah dapat ditentukan dengan metode GPO-PAP. Kadar trigliserida yang
didapatkan yaitu pada sampel 1 adalah 508,2539 (mg/dL) atau 5,7940 mmol/L dan pada sampel 2
adalah 439,1534 (mg/dL) atau 5,0063 mmol/L dibandingkan dengan nilai ekspektasi TG pada orang
dewasa adalah 150 mg/dL sehingga sampel darah termasuk sangat tinggi kadar trigliseridanya.

2. Kadar HDL Kolesterol yang didapatkan yaitu 361,3527 (mg/dL) pada sampel 1 dan 314,4927
(mg/dL) pada sampel 2 dibandingkan dengan nilai ekspektasi HDL Chol pada orang dewasa adalah
≤ 40 mg/dL sehingga sampel darah termasuk tinggi kadar HDL kolesterolnya.

3. Kadar LDL yang didapatkan yaitu pada sampel 1 12,74832 mg/dl dan sampel2 122,40172 mg/dl,
rata-ratanya sebesar 67,57502 mg/dl dibandingkan dengan LDL Chol orang dewasa adalah <100
mg/dl sehingga sampel darah termasuk optimal. Namun pada sampel 2 termasuk tinggi.

VI. Daftar Pustaka

BAB II TINJAUAN PUSTAKA. http://www.repository.unimus.ac.id diakses 1 Desember 2020

Fahmi, N F dan Najma, N L. 2019. Perbedaan Kadar Trigliserida Pada Perokok Tembakau Dan Perokok
Elektrik. STIKes Ngudia Husada Madura
Putri Wirawati, Ida Ayu. 2018. Pemeriksaan Profil Lipid. Denpasar: Universitas Udayana