PENENTUAN KADAR KOLESTEROL

PENDAHULUAN Kolesterol adalah lemak yang terdapat dalam aliran darah atau berada
dalam sel tubuh, yang sebenarnya dibutuhkan untuk pembentukan dinding sel
dan sebagai bahan baku beberapa hormon, namun apabila kadar kolesterol
dalam darah berlebihan, akan mengakibatkan penyakit jantung koroner dan
stroke. Kolesterol secara alami bisa dibentuk oleh tubuh sendiri, selebihnya
didapat dari makanan hewani, seperti daging, unggas, ikan, margarin, keju, dan
susu. Makanan yang berasal dari nabati, seperti buah, sayur, dan beberapa biji-
bijian, tidak mengandung kolesterol. Kolesterol sendiri tidak larut dalam darah,
untuk itu perlu berikatan dengan pengangkutnya yaitu lipoprotein, yaitu low-
density lipoprotein (LDL) atau high-density lipoprotein (HDL). Kolesterol yang
normal harus di bawah 200 mg/dl. Apabila di atas 240, anda berisiko tinggi
terkena serangan jantung atau stroke.

Mengukur kadar kolesterol dengan metode “CHOD-PAP” dengan

menjelaskan nilai normal kolesterol serta keadaan patologis dari hasil.
Melakukan diagnosa dini penyakit apa saja yang disebabkan oleh hasil
kolesterol abnormal / patologis melalui bantuan hasil praktikum yang
dilakukan. Metabolisme lipoprotein dapat dibagi atas 3 jalur, yaitu jalur
metabolisme eksogen, jalur metabolisme endogen dan jalur reverse
cholesterol transport pathway (RCTP). Makanan berlemak yang kita makan
terdiri dari trigliserida dankolesterol. Selain lemak yang berasal dari makanan,
dalam usus juga terdapat kolesterol dari hati yang dieksresi dari empedu ke
usus halus baik lemak diusus halus yang berasal dari makanan maupun berasal
dari hati disebut lemak eksogen. Trigliserid dan kolesterol dalam usus halus
akan diserap kedalam enterosit mukosa usus halus. Trigliserida akan diserap
sebagai asam lemak bebas sedang kolesterol akan diserap sebagai asam
sebagai kolesterol . Didalam usus halus asam lemak bebeas akan dirubah lagi
menjadi trigliserda, sedang kolesterol akan mengalami esterifikasi menjadi
kolesterol ester dan keduanya bersama fosfolipid dan apolipoprotein akan
membentuk lipoprotein yang dikenal dengan kilomikrom.

Metode Alat Kolorimetrik Enzimatik EndPoint

Metode Reagen CHOD – PAP

Prinsip Kolesterol ditentukan secara hidrolisis dan oksidasi enzimatik. Indikator

kolorimetri adalah quinoneimine yang dihasilkan dari 4-aminoantipyrine dan
fenol dengan katalisator peroksidase membentuk quinoneimine yang
berwarna merah. Intensitas warna sebanding dengan konsentrasi kolesterol
dan dapat ditentukan secara fotometrik. Absorbansi warna diukur pada
panjang gelombang 546 nm.
Reaksi Cholesterol ester + H2O CHE Cholesterol + Fatty Acid

Cholesterol + O2 CHO Cholesterol + 2H2O2

2H2O2 + 4-aminoantipyrine + phenol POD Quinoneimein + 4H2O

Persiapan  Serum , EDTA atau Plasma Heparin bebas dari hemolisis.

Spesimen  Kolesterol dalam serum atau plasma stabil hingga 5 hari pada 2-8ºC
dan selama beberapa bulan pada -20ºC

Alat dan Bahan Alat

• Tabung reaksi
• Rak tabung reaksi
• Mikropipet 1000 µl
• Mikropipet 10 µl
• Yellow tip
• Blue tip
• Kuvet
• Spektrofotometer
• Fotometer
• Auto Analyzer
• Stopwatch
• Waterbath

Bahan
• Reagen :
 R1 Monoreagent. 200 mmol/L pH 7.0, sodium cholate 1 mmol/L,
cholesterol esterase >250 mmol/L, cholesterol oksidase >250 U/L,
peroksidase > 1 KU/L, 4-aminoantipyrine 0.33 mmol/L, phenol 4
mmol/L, non-ionic tensioactives 2 g/L.

 Choleterol Standard. Cholesterol 200 mg/dL (5.18 mmol/L).

• Sampel : Serum
• Aquadest

Cara Kerja Spektrofotometer

1. Hubungkan Spektrofotometer ke sumber arus

2. Nyalakan spektrofotometer dengan menekan tombol ON pada main
spektrofotometer.
3. Tampilan program akan muncul dan memberitahukan bahwa proses
inisiasi sedang berlangsung, tunggu hingga proses selesai ditandai
dengan munculnya warna hijau dan tertulis status ready.
4. Biarkan selama 15 menit untuk pemanasan, setelah itu
spektrofotometer siap digunakan.
5. Ambil 3 tabung reaksi dan masing-masing tabung diberi label “blanko”,
 “standar”, dan “test”.
Masing-masing tabung diberi larutan sebagai berikut :
Tabung Blank Sample CAL. Standard
R1 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL
Monoreagent
Sample - 10 µl -
CAL. Standard - - 10 µl

6. Campuran dalam masing-masing tabung dihomogenkan.

7. Campuran diinkubasi 10 menit pada suhu ruang atau 5 menit pada
suhu 37ºC.
8. Masing-masing campuran dituang ke dalam kuvet.
9. Absorbansi campuran tadi dibaca dengan spektrofotometer pada
panjang gelombang 546 nm dengan titik nol sebagai blanko.
10. Hasil absorbansi dicatat dan dihitung kadar kolesterol total.
11. Setelah selesai bekerja, kuvet dikeluarkan dan dibersihkan dari
pelarutnya kemudian dikeringkan.
12. Spektrofotometer dimatikan dengan mengklik tombol OFF pada main
unit spektrofotometer

PERHITUNGAN
A. Sample x C Standard = ..... mg/dL total cholesterol
A. Standard

Fotometer
1. Sambungkan fotometer ke sumber arus listrik
2. Tekan tombol power on
3. Tunggu instrumen stabil dengan mendiamkan sekitar 10 menit
4. Hubungkan selang peristaltik dengan pompa
5. Mencuci alat dahulu dengan aquadest dengan cara selang
aspirator dicelupkan kedalam aquadest, lalu menekan tombol
washing pada monitor. Aquadest akan terhisap kedalam alat
dan dilakukan proses pencucian. Pencucian dilakukan untuk
mendorong gelembung gelembung udara atau kontaminan
yang terdapat didalam selang untuk masuk ke pembungan.
Pencucian dilakukan sebanyak 10 kali
6. Melakukan set up pada suhu kuvet
7. Ambil 3 tabung reaksi dan masing-masing tabung diberi label
“blanko”, “standar”, dan “test”.

Masing-masing tabung diberi larutan sebagai berikut :

 Tabung Blank Sample CAL. Standard
R1 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL
Monoreagent
Sample - 10 µl -
CAL. Standard - - 10 µl
8. Blanko, standar, dan sampel akan dihisap dan dianalisis hingga
keluar struk data hasil
9. Untuk mematikan alat, mencuci dengan desinfektan 10%
(deterjen dan aquadest)
10. Membilas dengan aquadest sebanyak 10 kali
11. Mencuci dengan udara agar alat yang dilalui cairan akan kering
12. Mengembalikan selang peristaltik pada keadaan semula
13. Membersihkan alat bagian luar dengan tisu dan menutup
kembali dengan plastik yang telah disediakan agar terhindar
dari debu dan kotoran
14. Memutuskan alat dari power supply

Auto Analyzer

Nilai Normal Klasifikasi Resiko Nilai Rujukan (mg/dl)

Nilai rujukan normal < 200
Resiko sedang 200 - 400
Resiko tinggi >240

Pemantapan Mutu  Penggunaan standar untuk menghitung hasil memungkinkan

diperolehnya akurasi yang tidak bergantung pada sistem atau
instrumen yang digunakan. Untuk memastikan kontrol kualitas yang
baik, setiap proses harus menyertakan satu set kontrol (normal dan
patologis).

 Jika nilai ditemukan di luar rentang yang ditentukan, periksa

instrumen, reagen, dan prosedurnya. Setiap laboratorium harus
menetapkan skema kendali mutu dan tindakan korektifnya sendiri jika
kendali tidak memenuhi toleransi yang dapat diterima.

Catatan  Liniertitas : 600 mg/dl. Sample dengan konsentrasi diatas 600 mg/dl
harus diencerkan dengan perbandingan 1+1, 1 bagian serum dan 1
bagian NaCl hasil pengukuran dikalikan 2

 Deteksi Terendah : 1.20 mg/dl

 Interferensi :
 1. Lipemia ( Intralipid 5 g/L ) dapat mempengaruhi hasil
2. Bilirubin ( 40 mg/dL ) tidak mempengaruhi hasil
3. Hemoglobin ( > 1 g/L ) dapat mempengaruhi hasil
4. Obat dan zat lain dapat mengganggu pengukuran

 Sumber Kesalahan
1. Volume reagen dan sample tidak sesuai
2. Waktu inkubasi tidak sesuai
3. Reagen Kadaluarsa
4. Penggunaan panjang gelombang tidak sesuai

Reference 1. Allain, C.C., Poon, L.S., C.S.G, Richmond, W and Fu, P.D. Clin. Chem.
20 : 470 (1974)
2. Richmond, W. Ann. Clin. Biochem. 29:577( 1992).
3. Young DS. Effects of drugs on clinical laboratory tests, 5th ed. ACC
Press, 2000.
4. SPESIAL REPORT. Executive Summary of the Third Report of the
National Chelesterol Education Program (NCEP) Ezpert Panel on
Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol im
Adults (Adult Treatment Panel III). JAMA. 285:2486 (2001)