Uji kuantitatif selanjutnya yaitu SDS-PAGE.

Metode SDS-PAGE adalah suatu

teknik pemisaha molekul-molekul protein berdasarkan perbedaan berat molekul.
Prinsip dari SDS PAGE yaitu dengan memanfaatkan perbedaan kemampuan migrasi
dari masing-masing molekul protein. Kemampuan migrasi setiap molekul akan
berbeda disebabkan adanya perbedaan berat molekul protein (Davis, 1994). Perbedaan
metode elektroforesis dengan metode SDS PAGE yaitu terdapat pada gel yang
digunakan. Elektroforesis menggunakan gel agarosa sebagai medium, sedangkan SDS
PAGE menggunakan gel berupa poliakrilamid.
Metode SDS PAGE dimanfaatkan untuk mendenaturasi protein menjadi bentuk
yang lebih sederhana dan mengubah molekul menjadi bermuatan negatif. Metode SDS-
PAGE menggunakan gel poliakrilamid yang terbentuk dari hasil polimerisasi monomer
akrilamid dan bisakrilamid. Polimerisasi tersebut diinisiasi oleh Amonium Persulfat
(APS) yang dapat membentuk radikal bebas.
Perlakuan yang pertama yaitu preparasi alat SDS-PAGE. Lempengan kaca
sandwich untuk membuat gel dibersihkan menggunakan etanol agar terhindar dari
kontaminan lalu didiamkan sampai kering. Lempengan kaca terdapat dua ukuran
panjang dan lebih pendek, hal itu bertujuan untuk mencetak gel bawah dan gel atas.
Lempengan kaca dipasang pada alat dan diberi sekat antar lempengannya untuk
memasukkan gel, kemudian diputar baut dari alat tersebut untuk mempererat
lempengan kaca agar tidak terjadi kebocoran. Lempengan kaca yang sudah terpasang
diisi dengan akuades untuk memastikan agar tidak terjadi kebocoran.
Perlakuan selanjutnya yaitu preparasi gel SDS-PAGE. Gel SDS-PAGE terdiri
dari dua jenis, yaitu gel bawah dan gel atas. Perbedaan dari kedua gel tersebut yaitu
terdapat pada Tris HCl. Tris HCl pada gel atas mempunyai pH 6.8 sedangkan Tris HCl
pada gel bawah mempunyai nilai pH 8. Langkah pertama yaitu membuat gel bawa yang
terdiri dari penambahan H2O, akrilamida, Tris HCl pH 8 dan SDS. Amonium persulfat
dan TEMED (Tetrametilendiamina) ditambahkan pada bahan-bahan tersebut ketika
akan dimasukkan kedalam lempengan kaca karena Amonium persulfat dan TEMED
berfungsi untuk membekukan gel. Akrilamid dan bisakrilamid akan menghasilkan
sebuah gel poliakrilamid melalui reaksi polimerisasi dan menghasilkan sebuah radikal
bebas dengan penambahan ammonium persulfat serta TEMED. Ammonium persulfat
berperan sebagai inisiator dan TEMED berperan sebagai katalisator. SDS pada
komposisi ini berfungsi untuk membuat molekul menjadi bermuatan negatif serta dapat
mendenaturasi protein. Gel atas dan gel bawah yang telah dibuat, dimasukkan ke dalam
lempengan kaca yang sudah terpasang dan diuji kebocorannya serta sisir dimasukkan
agar terbentuk sumur.
Perlakuan selanjutnya adalah preparasi sampel, sampel protein (keju) yang
telah disiapkan sebanyak 10 𝜇𝐿 kemudian dimasukkan ke dalam tabung eppendorf.
Sampel keju yang telah disiapkan kemudian ditambahakan dengan campuran larutan
SDS-Page. Larutan campuran SDS-Page terdiri dari 30𝜇𝐿 Tris HCL, 250 𝜇𝐿 gliserol,
100 𝜇𝐿 SDS, 50 𝜇𝐿 BPB, 45 𝜇𝐿 ddH2O, dan 25 𝜇𝐿 𝛽 −merkaptoetanol. Sampel protein
yang telah disiapkan kemudian ditambahan dengan campuran larutan SDS-Page
setelah itu terjadi perubahan warna yaitu larutan sampel yang tidak berwarna berubah
menjadi kuning-jingga. Perubahan yang terjadi tersebut dikarenakn terjadinya
denaturasi protein akibat penambahan SDS.
Larutan SDS yang ditambahkan pada percobaan ini berfungsi untuk untuk
memberikan memberikan muatan negatif pada protein yang akan dianalisis, dimana
SDS yang ditambahkan dapat mendenaturasi protein, membentuk protein yang lebih
sederhana serta menyamakan kondisi pada protein. Larutan SDS yang ditambahkan
tersebut memiliki muatan negatif yang dapat menghancurkan sebagian struktur
kompleks protein dan secara kuat akan tertarik ke arah anoda ketika ditempatkan dalam
sebuah medan listrik. Bromofenol (BPB) yang ditambahkan berfungsi sebagai pemberi
warna sekaligus untuk mengetahui terjadinya proses running. Larutan
𝛽 −merkaptoetanol yang ditambahkan berfungsi untuk memutus ikan disulfide pada
protein sehingga pita yang awalnya berbentuk globular akan berubah menjadi bentuk
lurus.
 Sampel yang telah ditambahkan larutan campuran SDS-Page kemudian
dipanaskan, pemanasan yang dilakukan bertujuan untuk mendenaturasi protein yang
terkandung dalam sampel. Sampel yang telah dipanaskan kemudian didinginkan
terlebih dahulu sebelum di analisis. Analisis sampel dilakukan dengan metode
elektroforesis, metode elektroforesis adalah suatu metode analisa yang digunakan
untuk separasi atau pemisahan molekul dari molekul besar yang komponen
penyusunnya serupa. Elektriforesis digunakan untuk memisahkan komponen atau
molekul bermuatan yang berdasarkan pada perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah
medan listrik. Analisis dengan metode elektroforesis dilakukan dengan mengeset set
alat elektroforesis kemudian ke dalam set alat elektroforesis dimasukkan gel akrilamid
yang telah di siapkan dan juga buffer tank ke dalam tank elektroforesis sampai batas
sumur. Larutan running yang digunakan dalam elektroforesis merupakan campuran
buffer running 25 mM, 250 mM glisin dan 0,1% SDS/ stok 5X 15.1 gr Tris Base, 94
gr glisin 50 mL 10% SDS, ditambahkan akuades hingga 1000 mL. Larutan running
dimasukkan ke dalam kompartmen hingga memenuhi kompartmen upper dan lower.
Sampel protein keju kemudian diinjeksikan ke dalam masing-masing sumur yang
terbentuk pada gel atas, setelah itu kompartmen ditutup dan dihubungkan elektrode
pada buffer atas dan buffer bawah pada kutub positif dan kutub negatif pada elektroda.
Elektroforesis dilakukan dengan tegangan sebesar 40-100 V dengan arus listrik 5 A.
Elektroforesis dihentikan apabila warna biru tracking dye (BPB) telah mencapai sekitar
0,5 cm dari bagian bawah gel.
Gel poliakrilamid pada percobaan ini berfungsi untuk mencegah difusi akibat
timbulnya panas pada arus listrik. Buffer pada elektroforesis berfungsi untuk
penghantar listrik yang akan membantu pemisahan sampel keju saat proses
elektroforesis. Protein -protein pada sampel akan terpisah karena adanya proses
separasi pada protein akibat adanya gaya listrik yang melewati gel poliakrilamid yang
memisahkan molekul-molekul protein menjadi pita-pita. Sampel yang telah di
elektroforesis selanjutnya dilakuakn proses staining dan destaining dengan cara
merendam gel poliakrilamid ke dalam larutan pewarna. Larutan pewarna dibuat dengan
mencampurkan 1 gr CBB, 450 mL CH3OH, 100 mL CH3OOH dan akuades hingga 100
mL kemudian di kocok perlahan pada temperatur ruang hingga larutan warna dapat
diikat oleh protein. Larutan yang telah di rendam dalam larutan pewarna kemjudian
dicuci dengan larutan pelepas warna. Larutan pelepas warna atau destaining terbuat
dari campuran 100 mL CH3OH, 100 mL CH3OOH, dan akuades hingga 100 mL.
Larutan destaining berfungsi untuk menghilangkan CBB yang tersisa serta
memperjelas pita protein yang terbentuk. Proses estaining tersebut dilakukan dengan
cara menggoyangakan gel yang direndam, pengoyangan tersebut bertujuan untuk
mempercepat pelepasan larutan warna. Hasil elektoforesis yang diperoleh adalah
sebagai berikut :

Gambar 4.1 Hasil Uji Elektroforesis

Hasil elektroforesis yang dilakukan pada sampel keju menunjukkan bahwa
tidak adanya pita- pita protein yang terbentuk. Pita-pita protein yang tidak terbentuk
tersebut mengakibatkan Retension Factor (RF) tidak dapat dihitung yang
mengakibatkan nilai BM dari sampel keju tidak dapat diketahui. Pita-pita protein tyang
tidak terbentuk dapat diakibatkan beberapa faktor diantaranya ukuran atau bentuk
molekul yang terlalu kecil, konsentrasi gel yang rendah, suhu pada saat denaturasi yang
tidak sesuai.