LAPORAN PRAKTIKUM

GENETIKA REKOMBINAN

ACARA PRAKTIKUM KE : V

DESAIN PRIMER

Nama : Muhammad Ilham Jasir

NIM : 24020118120028

Kelompok :4

Hari, tanggal : Kamis, 8 Oktober 2020

Asisten : Rizayu Winarsari

LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA

UNIVERSITAS DIPONEGORO

2020
 ACARA IV

DESAIN PRIMER

I. TUJUAN
I.1. Mampu mendesain primer DNA untuk kebutuhan PCR

II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Primer
Primer DNA adalah sekuens DNA yang komplemen terhadap sekuens yang akan
diamplifikasi, terutama dalam reaksi berantai polimerase (PCR). Batasannya, primer ini
akan menempel pada kedua ujung sekuens DNA yang ingin diamplifikasi dengan arah
yang berkebalikan (utas sense dan antisense). Dalam suatu reaksi berantai polimerase
digunakan dua primer, yaitu primer maju dan primer mundur. Kedua primer ini harus ada
dalam reaksi polimerasi agar amplifikasi DNA terjadi. Molekul primer dapat berupa
molekul DNA, RNA, atau bahkan protein spesifik. Biasanya, primer yang digunakan
pada PCR adalah molekul DNA. Pada akhir proses PCR akan terdapat sejumlah besar
fragmen-fragmen pendek DNA hasil amplifikasi. Setelah dilakukan amplifikasi, terdapat
berbagai cara untuk melihat hasilnya. Salah satu diantaranya adalah elektroforesis gel.
Primer maju (forward) dan primer mundur (reverse) bekerja berlawanan arah. Visualisasi
dengan elektroforesis gel dapat dilakukan setelah proses amplifikasi terjadi untuk melihat
hasil DNA yang terbentuk. Apabila terdapat delesi untuk suatu lokasi templat, akan
terjadi polimorfisme. Dengan elektroforesis gel, akan terlihat pita yang terputus-putus
apabila terdapat polimorfisme (Amoozegar,2014).
2.2 Desain Primer
Langkah mendesain primer untuk gen selulase pada Bacillus subtilis atau bglC.
Menentukan posisi bglC dalam  whole genom Bacillus subtilis. Mencari tahu enzim
restriksi yang tidak memotong sekuen gen dengan  menggunakan program  aplikasi
BIOEDIT. Memilih enzim restriksi yang akan digunakan untuk insersi gen dengan
mempelajari peta sirkuler dan situs pemotongan pET-21b. Restriksi yang sesuai dengan
pET-21ialah NdeI, NheI, BamHI, EcoRI, SacI, SalI, HindIII, NotI, XhoI, EagI, AvaI.
Menentukan posisi forward primer dan reverse primer dengan Genamics Expresion.
Posisi primer diupayakan berdekatan dengan start dan stop kodon serta mengarah ke situs
pemotongan enzim restriksi. Jika situs pemotongan enzim restriksi di dekat start dan stop
kodon sulit disesuaikan dengan posisi primer, dapat dilakukan mutasi situs pemotongan
pada  2-3 nukleotida. Mutasi 2-3 nukleotida pada sekuen gen selulase tidak akan
mengurangi daya lekat primer  terhadap untai DNA asalkan presentase Guanin (G) dan
Sitosin (C)  primer cukup tinggi. Mengecek desain primer dengan Primer Calculator
(pada Genamics Expression) dan atau dengan Oligocalculator. Mengecek desain primer
dengan Fast PCR untuk mengetahui tingkat spesifitas primer dan ukuran produk PCRnya
(Borah,2011).
2.2.1 NCBI
National Center for Biotechnology Information (NCBI, Pusat Nasional
Informasi Bioteknologi) adalah bagian dari United States National Library of
Medicine (NLM), sebuah cabang dari National Institutes of Health (NIH). NCBI
terletak di Bethesda, Maryland dan didirikan pada tahun 1988 melalui undang-
undang yang disponsori oleh Senator Claude Pepper. NCBI menyimpan
serangkaian basis data yang relevan untuk bioteknologi dan biomedis dan
merupakan sumber penting bagi alat-alat dan layanan bioinformatika. Database
utama seperti GenBank untuk urutan DNA dan PubMed, database bibliografi
untuk literatur biomedis. Database lainnya termasuk database NCBI Epigenomics.
Semua database tersebut tersedia secara online melalui mesin pencari Entrez.
NCBI dipimpin oleh David Lipman, salah satu penulis asli dari program
penyelarasan urutan BLAST dan banyak tokoh yang dihormati dalam
bioinformatika. Ia juga memimpin sebuah program penelitian intramural,
termasuk kelompok-kelompok yang dipimpin oleh Stephen Altschul (pembuat
dari BLAST yang lain), David Landsman, Eugene Koonin (penulis produktif di
genomika perbandingan), John Wilbur, Teresa Przytycka, dan Zhiyong Lu. David
Lipman mundur dari jabatannya pada Mei 2017. NCBI terdaftar di Registry of
Research Data Repositories re3data.org (Widodo,2010).
III. METODE
3.1 Alat
3.1.1 Laptop
3.1.2 Alat tulis
3.2 Bahan
3.2.1 Sofware NCBI
3.2.2 Bacillus acidicola 16s rRNA
3.3 Cara Kerja
3.3.1 Membuka website NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ kemudian search sekuen
gen organisme yang akan digunakan untuk desain primer, menggunakan Bacillus
acidicola 16s rRNA
3.3.2 Kemudian kita klik sekuens yang kita inginkan , kemudian copy Nomer sekuens
NR_024570.1.

3.3.3 Kemudian kita scroll kebawah, klik menu BLAST

3.3.4 Selanjutnya akan muncul seperti ini , kemudian klik primer blast

3.3.5 setelah di klik akan muncul tampilan seperti ini

3.3.6 untuk pengaturan nya tidak usah dirubah (default), kemudian kita klik get primer
dibagian bawah kiri.

3.3.7 klik check , tunggu beberapa menit hingga muncul hasil primernya.
3.3.8 hasil dari design primer

3.3.9

3.3.10
3.3.11
3.3.12
3.3.13
3.3.14 Hasil pasangan-pasangan primer dipilih yang terbaik
IV. HASIL PENGAMATAN

4.1 Sekuens DNA Template

>NR_041942.1 Bacillus acidicola strain 105-2 16S ribosomal RNA, partial sequence

TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACAT
GCAAGTCGAGCGAATCAA
TTGGGAGCTTGCTCCCTTTTGGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGG
TAACCTGCCTGTAAGACT
GGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACTTCTTCCTCCGCAT
GGGGGRATATTGAAAGAT
GGCTTCGGCTATCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGA
GGTAACGGCTCACCAAGG
 CAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGAC
ACGGCCCAGACTCCTACG
GGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAA
CGCCGCGTGAGTGATGAAG
GTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAAT
AGGGCGGTACCTTGACGG
TACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACG
TAGGTGGCAAGCGTTGTC
CGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGA
AAGCCCACGGCTCAACCG
TGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAA
TTCCACGTGTAGCGGTGAA
ATGCGTAGATATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGT
AACTGACGCTGAGGCGCG
AAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAAC
GATGAGTGCTAAGTGTTA
GAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGG
GAGTACGGCCGCAAGGC
TGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTT
TAATTCGAAGCAACGCGA
AGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCC
CCTTCGGGGGACAGAGT
GACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGT
CCCGCAACGAGCGCAAC
CCTTGACCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAGGGTGACTGCCGGTG
ACAAACCGGAGGAAGGT
GGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCT
ACAATGGATGGTACAAAG
GGCTGCAAGACCGCGAGGTTTAGCCAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGG
ATTGTAGGCTGCAACTCG
CCTACATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAA
TACGTTCCCGGGCCTTGT
ACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGT
AACCTTTTGGAGCCAGCC
GCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATC
GGAAGGTGCGGYTGGATC
ACCTCCTT

4.2 Hasil Desain Primer dari NCBI

Keselurahan 10 pair primer yang terbentuk setelah dilakukan analisis, primer pair 1
dianggap yang paling baik karena GC content pada primer beriksar 40-60% dengan
ujung 3’ sudah sesuai, basa nitrogen berakhiran G atau C sudah sesuai, panjang
nukleotida berkisar 18-30 basa sudah sesuai, hasil selisih dari Tm forward dan Tm
reverse tidak melebihi 5°C sudah sesuai, tidak ada pengulangan basa lebih dari tiga
kali, tidak ada primer yang saling komplemen lebih dari tiga kali berturut-turut, dan
product length nya adalah yang paling panjang dari primer yang lain.
V. PEMBAHASAN

Praktikum Genetika Rekombinan acara V yang berjudul “Desain Primer” telah

dilaksanakan pada hari Kamis, Oktober 2020 pada pukul 07.30 WIB yang dilaksanakan
secara daring melalui via Microsoft Teams. Tujuannya adalah Mampu mendesain primer
DNA untuk kebutuhan PCR.

Primer merupakan potongan DNA pendek utas tunggal (oligonukleotida), panjang primer
yang umum digunakan hanya berkisar antara 20 sampai 25 basa. Primer merupakan salah satu
bahan esensial yang diperlukan dalam Polymerase Chain Reaction (PCR). Menurut
Amoozegar (2014), bahwa Primer DNA adalah sekuens DNA yang komplemen terhadap
sekuens yang akan diamplifikasi, terutama dalam reaksi berantai polimerase (PCR).
Batasannya, primer ini akan menempel pada kedua ujung sekuens DNA yang ingin
diamplifikasi dengan arah yang berkebalikan (utas sense dan antisense). Dalam suatu reaksi
berantai polimerase digunakan dua primer, yaitu primer maju dan primer mundur. Kedua
primer ini harus ada dalam reaksi polimerasi agar amplifikasi DNA terjadi.

Cara mendesain primer yaitu membuka website NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

kemudian search sekuen gen organisme yang akan digunakan untuk desain primer. Kemudian
kita klik sekuens yang kita inginkan , kemudian copy Nomer sekuens. Kemudian kita scroll
kebawah, klik menu BLAST. Selanjutnya akan muncul seperti ini , kemudian klik primer
blast. untuk pengaturan nya tidak usah dirubah (default), kemudian kita klik get primer
dibagian bawah kiri. klik check , tunggu beberapa menit hingga muncul hasil primernya. hasil
dari design primer. Hasil pasangan-pasangan primer dipilih yang terbaik. Menurut orah
(2011), bahwa Langkah mendesain primer untuk gen selulase pada Bacillus acidicola atau
bglC. Menentukan posisi bglC dalam  whole genom Bacillus acidicola. Mencari tahu enzim
restriksi yang tidak memotong sekuen gen dengan  menggunakan program  aplikasi
BIOEDIT. Memilih enzim restriksi yang akan digunakan untuk insersi gen dengan
mempelajari peta sirkuler dan situs pemotongan pET-21b. Restriksi yang sesuai dengan pET-
21ialah NdeI, NheI, BamHI, EcoRI, SacI, SalI, HindIII, NotI, XhoI, EagI, AvaI. Menentukan
posisi forward primer dan reverse primer dengan Genamics Expresion. Posisi primer
diupayakan berdekatan dengan start dan stop kodon serta mengarah ke situs pemotongan
enzim restriksi. Jika situs pemotongan enzim restriksi di dekat start dan stop kodon sulit
disesuaikan dengan posisi primer, dapat dilakukan mutasi situs pemotongan pada  2-3
nukleotida. Mutasi 2-3 nukleotida pada sekuen gen selulase tidak akan mengurangi daya lekat
primer  terhadap untai DNA asalkan presentase Guanin (G) dan Sitosin (C)  primer cukup
tinggi. Mengecek desain primer dengan Primer Calculator (pada Genamics Expression) dan
atau dengan Oligocalculator. Mengecek desain primer dengan Fast PCR untuk mengetahui
tingkat spesifitas primer dan ukuran produk PCRnya.

Primer yang digunakan dalam amplifikasi umumnya terdiri dari dua jenis, yakni forward
dan reverse. Forward primer bergerak dengan arah 5′ –> 3′ untai DNA template. Sementara
reverse primer bergerak dengan arah 3′ –> 5′ untai DNA template. Kedua primer ini dapat
didesain dengan mengunakan program aplikasi yang terdiri dari BIOEDIT, GENAMICS
EXPRESSION, OLIGOCALCULATOR, dan FAST PCR. Menurut Chuan (2013), bahwa
Perancangan primer dilakukan berdasarkan sekuens basa atau asam amino yang konservatif.
Tingkat konservatif dapat diperoleh melalui penjajaran (alignment) beberapa sekuens. Bila
data asam amino tersedia dalam perancangan primer, maka terlebih dahulu data tersebut
dikonversi menjadi sekuens basa menurut urutan kodon tertentu. Ada beberapa hal yang perlu
diperhatikan dalam perancangan primer untuk mengoptimalkan perolehan hasil amplifikasi,
yaitu terbebas dari pembentukan struktur sekunder (hairpin/ struktur tusuk konde, dimer/ self-
dimer, dan cross dimer), besar amplikon, panjang primer, titik leleh (Tm), dan kestabilan
internal. Struktur sekunder pada primer dapat terjadi melalui tiga cara. Pertama, hairpin
(struktur tusuk konde), yaitu komplementasi melalui pelipatan kembali dirinya akibat adanya
ikatan intramolekul yang mampu memutar primer sehingga terjadi pengikatan sendiri. Kedua,
dimer adalah komplementasi antar sesama primer. Ketiga, cross dimer, yang prosesnya
hampir sama dengan dimer tetapi komplementasi terjadi antara primer forward dan reverse.

Kriteria primer yang baik yaitu GC content pada primer beriksar 40-60% dengan ujung 3’
berakhiran basa nitrogen G atau C untuk mempermudah binding. Panjang nukleotida berkisar
18-30 basa. Usahakan panjang basa yang efektif dan efisien. Melting temperature (Tm) antara
65°C dan 75°C, dan jarak 5°C antara satu sama lain. Hindari pengulangan basa lebih dari tiga
kali (c/: AAAAC, ATATATAT). Hindari primer yang saling komplemen lebih dari tiga kali
berturut-turut. Menurut Arumingtyas (2014), bahwa Dalam melakukan desain primer ada
beberapa kriteria untuk mendapatkan primer yang optimal diantaranya spesifisitas, panjang
primer 18-30 bp, kandungan %GC sekitar 40-60%, suhu leleh (Tm) optimal berkisar 52-
58oC, peniadaan basa Timin (T) pada 3’-end, primer bukan komplemennya sehingga
mencegah self-annealing/ dimmers dan mispriming, suhu disosiasi primer pada pasangan PCR
kira-kira sama. Desain primer yang spesifik dapat digunakan dalam identifikasi suatugen.

Hasil dari keselurahan 10 pair primer yang terbentuk setelah dilakukan analisis, primer
pair 1 dianggap yang paling baik karena GC content pada primer beriksar 40-60% dengan
ujung 3’ sudah sesuai, basa nitrogen berakhiran G atau C sudah sesuai, panjang nukleotida
berkisar 18-30 basa sudah sesuai, hasil selisih dari Tm forward dan Tm reverse tidak melebihi
5°C sudah sesuai, tidak ada pengulangan basa lebih dari tiga kali, tidak ada primer yang saling
komplemen lebih dari tiga kali berturut-turut, dan product length nya adalah yang paling
panjang dari primer yang lain.
VI. KESIMPULAN

6.1 Berdasarkan praktikum yang telah kami lakukan bahwa, untuk mendesain primer DNA
dengan membuka website NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ kemudian search
sekuen gen organisme yang akan digunakan untuk desain primer. Kemudian kita klik
sekuens yang kita inginkan , kemudian copy Nomer sekuens. Kemudian kita scroll
kebawah, klik menu BLAST. Selanjutnya akan muncul seperti ini , kemudian klik
primer blast. untuk pengaturan nya tidak usah dirubah (default), kemudian kita klik get
primer dibagian bawah kiri. klik check , tunggu beberapa menit hingga muncul hasil
primernya. hasil dari design primer. Hasil pasangan-pasangan primer dipilih yang
terbaik. Hasil primer yang paling baik yaitu GC content pada primer beriksar 40-60%
dengan ujung 3’, berakhiran basa nitrogen G atau C, panjang nukleotida berkisar 18-30
basa, jarak 5°C atau yaitu adalah hasil selisih dari Tm forward sama Tm reverse, tidak
ada pengulangan basa lebih dari tiga kali, tidak ada primer yang saling komplemen lebih
dari tiga kali berturut-turut, dan syarat tambahan primer paling baik itu product length
nya paling panjang dari primer yang lain.
 DAFTAR PUSTAKA

Amoozegar and E. Rezvannejad, “Primer design using gravitational search algorithm,” 2014
Iran. Conf. Intell. Syst., pp. 1–6.

Arumingtyas, E. L., A. Sugianto & M. R. Pahlevi. 2014. DNA polymorphism of the drought
tolerance gene GmDREB2 of Indonesian local varieties soybean (Glycine maxL.
Merr). Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences.
5(5):228-232.

Borah, P. 2011. Primer Designing for PCR. Science Vision. 11(3): P. 134 -136.
Chuan, L.Y., Y.H. Cheng, & C.H. Yang. 2013. Specific Primer Design for the Polymerase Chain
Reaction. Biotechnology Letter. 35: 1541–1549.

Widodo. 2010. Pengenalan Ncbi Untuk Analisis Dna, Protein Dan Senyawa Kimia.
Laboratorium Biosistem Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Brawijaya Malang.

HALAMAN PENGESAHAN

Lumajang,1 Oktober 2020

Mengetahui

Asisten Praktikan

Rizayu Winarsari Muhammad Ilham Jasir

24020117130088 24020118120028