LAPORAN SEMENTARA

ACARA II
REAGEN DAN PREPARASINYA

I. TUJUAN
1.1 Mampu mengetahui jenis-jenis reagen beserta fungsinya dalam Genetika Rekombinan
1.2 Mampu mengetahui rumus dan cara perhitungan reagen dalam Genetika Rekombinan

II. TABEL LEMBAR KERJA PRAKTIKUM

NO NAMA REAGEN GAMBAR REFERENSI CARA PREPARASI FUNGSI
1 Reagen (kit) 1. campurkan dATP bertindak sebagai building block
untuk isolasi (deoksiadenosin trifosfat) DNA yang diperlukan dalam
DNA atau PCR. dengan dTTP (deoksitimidin proses ekstensi DNA
trifosfat)
2. lalu campurkan dengan dCTP
(deoksisitidin trifosfat) dan
dGTP (deoksiguanosin trifosfat)

2 Reagen Isolasi
DNA secara
manual :
EDTA 0.5M 1. Semua bahan dilarutkan dalam 1. Menginaktifkan enzim DNAse
950 ml dH yang dapat merusak DNA
2O 2. Menghancurkan sel dengan
dan pH diatur 8,0 menghilangkan ion
2. Volume larutan ditambah sampai magnesium pada membran
mencapai 1 sel
liter
3. Sterilisasi menggunakan autoklaf
pada suhu
 121 C atau 15 lb/sq selama 20
menit
HCl 1M 1. campurkan seluruh bahan digunakan untuk mengontrol pH
dengan proses aliran larutan
memasukkan asam pada air
2. Pembuatan HCl 0.1 N dari stok
1 N:
3. Campurkan 10 ml stok 1N HCl
ke dalam 90 ml
aquades steril.

NaCl 5M 1. Larutkan 292 g NaCl dalam 800 NaCl berfungsi untuk

mL H2O.
2. Sesuaikan volume menjadi 1 L
dengan H2O.
3. Sterilkan dengan autoklaf.
Simpan larutan
NaCl pada suhu kamar
meminimalkan daya
ikatan antara DNA dan protein
dengan
merusak keseimbangan muatan
negatif dan
positif antara keduanya. Dengan
demikian
DNA akan lebih mudah
dipisahkan.
NaOH 10N 1. NaOH dilarutkan dalam 900 ml
air
2. kemudian
diaduk secara merata.
3. Setelah merata
ditambahkan air sampai volume
menjadi 1 L.
Detergen Pada awalnya gunakan terlebih
dahulu 900 ml air lalu
masukkan NaOH kemudian diaduk
secara merata. Setelah merata
ditambahkan air sampai volume 1
L. Larutan tidak usah disterilisasi
NaOH berfungsi untuk
melisiskan sel dan
menghilangkan/melarutkan
prtein.
1. Sodium dodecyl sulphate
(SDS) sebagai tahap pelisisan
membran
sel.
2. Detergen tersebut selain
berperan dalam melisiskan
membran sel
juga dapat berperan dalam
mengurangi aktivitas enzim
nuklease
yang merupakan enzim
pendegradasi DNA
3. Selain digunakan SDS,
detergen yang lain seperti cetyl
trimethylammonium bromide
(CTAB) juga sering dipakai
 untuk
melisiskan membran sel pada
isolasi DNA tumbuhan
Ammonium Campur bahan, kemudian sterilisasi
Asetat 10M reagen dengan filter 0.22 m.

Tris-HCl 1. Dinginkan medium untuk Berfungsi untuk memberikan

homogenisasi (0.32 M sucrose, kondisi pH yang
1 mM EDTA optimum dan menjaga kestabilan
2. Lalu tambahkan 10mM Tris- pH
HCl, pH 7.8) dan dounce
homogenizers pada suhu 4°C.

Larutan Fenol 1. Biasanya berbentuk cair, jernih sebagai pendenaturasi protein

dan tidak berwarna
sehingga dapat langsung
digunakan tanpa harus
didistilasi ulang.
2. Kristal fenol tidak disarankan
untuk dipakai
karena harus didistilasi terlebih
dahulu pada suhu
160oC untuk menghilangkan
hasil oksidasi seperti
kuinon.
3. Senyawa kuinon dapat
 memecah ikatan
fosfodiester dan dapat
menyebabkan ikatan silang
(cross-linking) DNA dan RNA
Larutan Fenol : 1. Disimpan dibawah larutan 100 untuk mendenaturasi protein dan
Kloroform : mM Tris-Cl pH menghilangkan senyawa-senyawa
Isoamil Alkohol 8.0 pada botol gelap pada suhu (lipid-protein)
4oC selama lebih yang mengkontaminasi DNA
dari 1 bulan

Alkohol/Etanol dipreparasi dengan distilasi, 1. Sterilisasi alat dan bahan

Absolut ekstraksi cair-cair dan ekstraksi 2. Membentuk endapan atau
fase padat terjadinya presipitasi
Alkohol/Etanol dipreparasi dengan distilasi, 1. Sterilisasi alat dan bahan
70% ekstraksi cair-cair dan ekstraksi 2. Membentuk endapan atau
fase padat terjadinya presipitasi

Buffer TE (Tris- 1. Jika yang dibutuhkan adalah untuk melarutkan DNA yang
EDTA) plasma, darah dengan dihasilkan dan menjaga DNA agar
antikoagulan (EDTA) tidak mudah rusak.
disentrifugasi dengan kecepatan
6000 rpm 10 meni
2. kemudian lapisan plasma di atas
lapisan sel diambil dengan pipet
secara hati-hati. Sampel siap
digunakan
RUMUS PENGENCERAN :

 V1.M1=V2.M2

KETERANGAN :

 V1 = Volume awal
 M1 = Konsentrasi zat mula-mula
 V2 = Volume setelah pengenceran
 M2 = Konsentrasi setelah pengenceran

LEMBAR PENGESAHAN

17, September 2020

Asisten Praktikan

Rizayu Winarsari Muhammad Ilham Jasir

24020117130088 24020118120028