MAKALAH

BIOTEKNOLOGI
“POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) DAN SEQUENCING”

Dosen Pengampu Mata Kuliah: Dr. Yuni Ahda, M.Si

Oleh
Kelompok 2
Elmayana Fradila (19177008)
Yanti Elfika Desti (18177038)

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI

PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS NEGERI PADANG
2020

1
 KATA PENGANTAR

Puji syukur ke hadirat Allah SWT yang telah melimpahkan Rahmat dan Karunia-Nya

sehingga makalah Bioteknologi Pendidikan yang membahas tentang “Polymerase Chain Reaction

(PCR) Dan Sequencing” ini dapat terselesaikan sebagaimana mestinya. Shalawat serta salam tidak

lupa kita haturkan kepada junjungan Baginda Nabi Besar Muhammad SAW atas bimbingan beliau

sehingga kita dapat keluar dari zaman yang belum memiliki ilmu pengetahuan seperti yang kita

rasakan sekarang ini.

Ucapan terimakasih kepada dosen pengampu mata kuliah bioteknologi yang telah

memberikan kami kesempatan untuk membuat makalah ini sebagai pedoman, acuan, dan sumber

belajar.

Akhir kata, Penyusun menyadari bahwa masih terdapat banyak kesalahan baik dari segi

bahasa, tulisan, maupun kalimat yang kurang tepat dalam makalah ini, oleh karena itu, kritik dan

saran yang bersifat membangun dari para pembaca sangat diharapkan demi kesempurnaan makalah

berikutnya.

Padang, September 2020

Penulis

DAFTAR ISI

2
KATA PENGANTAR ................................................................................... i

DAFTAR ISI .................................................................................................. ii

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang ........................................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah ...................................................................................... 1

1.3 Tujuan Penulisan Makalah ....................................................................... 1

BAB II PEMBAHASAN

2.1 Polymerase Chain Reacton (PCR) ............................................................

2.2 Tujuan Polymerase Chain Reacton (PCR)................................................. 2

2.3 Cara kerja Polymerase Chain Reacton (PCR)............................................ 4

2.4 Manfaat Polymerase Chain Reacton (PCR) ……………………………..

2.5 Sequencing .................................................................................................

2.5.1 Prinsip Dasar DNA Sequencing .....................................................

2.5.2 Metode Sekuensing ........................................................................

2.5.3 Proses DNA Sequencing ................................................................

BAB III PENUTUP

3.1 Kesimpulan ................................................................................................ 7

3.2 Saran .......................................................................................................... 7

DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 8

3
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Bioteknologi diartikan sebagai penerapan prinsip ilmu dan rekayasa dalam pemanfaatan

makhluk hidup (bakteri, fungi, virus, dan lain-lain) maupun produk dari makhluk hidup

(enzim,alkohol) dalam proses produksi untuk menghasilkan barang dan jasa. Bioteknologi

secara umum berarti meningkatkan kualitas suatu organisme melalui aplikasi teknologi.

Aplikasi teknologi tersebut dapat memodifikasi fungsi biologis suatu organisme dengan

menambahkan gen dari organisme lain atau merekayasa gen pada organisme tersebut.

Bioteknologi tradisional merupakan bioteknologi yang memanfaatkan mikroba, proses

biokimia, dan proses genetik yang terjadi secara alami. Produk dari bioteknologi tradisional

tersebut antara lain: tempe, oncom, yoghurt, dan keju. Bioteknologi tradisional ini terus

mengalami perkembangan hingga ditemukannya struktur DNA yang diikuti dengan

penemuan lainnya. Dengan ditemukannya struktur DNA dan berkembangnya ilmu

pengetahuan tentang DNA, muncullah istilah bioteknologi modern. Bioteknologi modern

merupakan bioteknologi yang didasarkan pada manipulasi atau rekayasa DNA.

Bioteknologi yang didasarkan pada manipulasi DNA ini dilakukan dengan

memodifikasi gen spesifik dan memindahkannya pada organisme yang berbeda, seperti

bakteri, hewan, dan tumbuhan. Produk dari bioteknologi modern, misalnya insulin, kloning

domba Dolly, antibodi monoklonal. Dalam aplikasinya, bioteknologi menerapkan berbagai

macam disiplin ilmu. Disiplin ilmu tersebut antara lain: mikrobiologi (tentang mikroba),

biologi sel (tentang sel), genetika (tentang pewarisan sifat makhluk hidup), dan biokimia

(tentang makhluk hidup dilihat dari aspek kimianya). Salah satu pokok bahasan yang penting

untuk di pahami yaitu mengenai Polymerase Chain Reaction atau yang lebih dikenal dengan

istilah PCR. PCR adalah suatu metode in vitro untuk menghasilkan sejumlah fragmen DNA

spesifik dengan panjang dan jumlah skuens yang telah ditentukan dari jumlah kecil template

4
kompleks. Polymerase Chain Reacton (PCR) adalah suatu teknik sintesis dan amplifikasi

DNA secara in vitro. Teknik ini pertama kali dikembangkan oleh Karry Mullis pada tahun

1985. Teknik PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah

jutaan kali hanya dalam beberapa jam. Dengan diketemukannya teknik PCR di samping juga

teknik-teknik lain seperti sekuensing DNA, telah merevolusi bidang sains dan teknologi

khususnya di bidang diagnosa penyakit genetik, kedokteran forensik dan evolusi molekular.

PCR ditemukan pada akhir tahun 1980an, teknik ini dipakai secara cepat, intensif dan

meluas pada hampir semua cabang ilmu hayati, termasuk mikrobiologi medis dan veteriner

(VILJOEN et al., 2005). Sebagai alat diagnosis penyakit menular, PCR secara langsung

menempati posisi yang sangat dominan karena kemampuannya mendeteksi secara

cepat dan akurat keberadaan agen penyakit walaupun keberadaannya dalam spesimen sangat

sedikit. Segmen spesifik nukleotida agen penyakit digandakan jutaan kali oleh PCR sehingga

hasil gandaan yang disebut amplikon dapat divisualisasi. Elektroforesis agarose dengan

pewarnaan ethidium bromida merupakan cara yang paling banyak dipakai untuk

memvisualisasi amplikon tersebut. Limit deteksi cara ini untuk fragmen DNA sepanjang 600

bp adalah 7,72 X 109 buah atau setara dengan 5 ng. Fragmen sebanyak itu mengisyaratkan

bahwa reaksi PCR harus efisien mengamplifikasi template dalam sampel (OROSKAR et al.,

1996). Kenyataannya, PCR sering tidak efisien disebabkan banyak faktor seperti adanya

inhibitor pada sampel, primer, enzim polimerase atau reagen yang lain yang kurang optimum.

1.2 Rumusan Masalah

1.   Apa yang dimaksud dengan Polymerase Chain Reacton (PCR)?
2.   Bagaimana tujuan Polymerase Chain Reacton (PCR)?
3.   Bagaimana cara kerja Polymerase Chain Reacton (PCR)?
4. Bagaimana manfaat Polymerase Chain Reacton (PCR)?
5. Apa yang dimaksud dengan sekuensing?

5
1.3 Tujuan Pembahasan
1.   Menjelaskan defenisi Polymerase Chain Reacton (PCR)
2.   Menjelaskan bagaimana tujuan Polymerase Chain Reacton (PCR)
3.   Menjelaskan bagaimana cara kerja Polymerase Chain Reacton (PCR)
4. Menjelaskan bagaimana manfaat Polymerase Chain Reacton (PCR)
5. Menjelaskan defenisi sekuensing

6
 BAB II
PEMBAHASAN
2.1 Polymerase Chain Reacton (PCR)

Polymerase Chain Reacton (PCR) adalah suatu teknik sintesis dan amplifikasi DNA

secara in vitro. Teknik ini pertama kali dikembangkan oleh Karry Mullis pada tahun 1985.

Teknik PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan kali

hanya dalam beberapa jam. 

PCR adalah suatu teknik yang melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) dan

pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda. PCR adalah reaksi

polimerase berantai, yaitu reaksi yang melibatkan enzim polimerase yang dilakukan secara

berulang-ulang. Yang diulangulang adalah proses pemisahan untai ganda DNA menjadi untai

tunggal, hibridisasi primer untuk mengawali replikasi DNA dilanjutkan dengan proses

penambahan basa pada cetakan DNA oleh enzim polimerase, untuk melakukan kegiatan ini

dibutuhkan tabung PCR yang bersifat responsive dengan perubahan suhu dan mesin thermal

cycle, suatu mesin yang mampu menaikkan dan menurunkan suhu dengan cepat, dan bahan-

bahan untuk membuat reaksi PCR (Zuhriana, 2010).

2.2 Tujuan Polymerase Chain Reacton (PCR)

Adapun tujuan dari penggunaan metode PCR ini adalah untuk melipatgandakan suatu

sekuens nukleotida atau meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari

jumlah semula, sekitar 106 - 107 kali secara in vitro.

2.3 Cara Kerja Polymerase Chain Reacton (PCR)

Prinsip dari PCR adalah memperbanyak suatu DNA dari dua menjadi

empat, kemudian delapan, dan seterusnya hingga terbentuk jutaan salinan. Hal ini dapat

dicapai dengan menggunakan suatu enzim yang disebut polimerase. Proses pelipat gandaan

7
ini dicapai dalam tiga tahap : denaturation, annealing (peleburan/ penempelan), dan

elongation atau extension (pemanjangan). Ketiga tahap ini membentuk satu siklus

amplifikasi.

a. Denaturation: DNA untai ganda atau double-stranded DNA didenaturasikan pada

suhu 90-97°C menjadi sebuah DNA untai tunggal atau single-stranded DNA.

b. Annealing: DNA tersebut “dilebur” (annealing) pada suhu 50-60°C dengan dua

primer. Primer adalah sebuah fragmen DNA yang akan menempel pada gen yang ditarget

dan berperan sebagai dasar (template) untuk pembentukan untaian baru.

c. Elongation: enzim DNA polimerase memanjangkan (elongation) primer dengan

deoksinukleotida trifosfat (dNTP) sebagai substrat sehingga diperoleh DNA salinan dari

DNA aslinya. Ketiga tahap ini terus diulang sampai diperoleh jumlah salinan yang

diinginkan. Sebagai contoh amplifikasi dengan 30 siklus akan menghasilkan lebih dari satu

miliar salinan DNA (Kubista et al., 2006). Hasil PCR konvensional nantinya akan dibacakan

dengan menggunakan elektroforesis. Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk

memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik

molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarose.

Komponen- komponen yang diperlukan pada proses PCR adalah template DNA;

sepasang primer, yaitu suatu oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan nukleotida

yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA templat; dNTPs (Deoxynucleotide

triphosphates); buffer PCR; magnesium klorida (MgCl2) dan enzim polimerase DNA

(Handoyo and Rudiretna, 2001).

Pada proses PCR diperlukan beberapa komponen utama yang dibutuhkan untuk

melakukan amplifikasi yaitu:

a. DNA cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan dilipat gandakan. Dua hal penting

tentang cetakan adalah kemurnian dan kuantitas.

8
 b. Oligonukleotida primer, yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek (18 – 28 basa

nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA.

c. Deoksiribonukelotida trifosfat (dNTP) yang diperlukan untuk reaksi polimerasi.

d. Enzim DNA Polimerase, yaitu enzim yang melakukan katalisis reaksi sintesis rantai

DNA. Enzim polimerase taq tahan terhadap pemanasan berulang-ulang yang akan membantu

melepaskan ikatan primer yang tidak tepat dan meluruskan wilayah yang mempunyai struktur

sekunder.

e. Komponen pendukung lain adalah senyawa buffer.

Kusuma (2010:7) menjelaskan tahapan pada proses PCR secara ringkas sebagai

berikut.

1. Denaturasi

o
Pada tahap ini molekul DNA dipanaskan sampai suhu 95 C yang

menyebabkan terjadinya pemisahan untai ganda DNA menjadi untai DNA tunggal. Untai

DNA tunggal inilah yang menjadi cetakan bagi untai DNA baru yang akan dibuat.

Gambar 1. Untai DNA mengalami denaturasi

Sumber: Kusuma, 2010

2. Penempelan (Annealing)

Enzim Taq polimerase dapat memulai pembentukan suatu untai DNA baru jika ada

seuntai DNA berukuran pendek (DNA yang mempunyai panjang sekitar 10 sampai 30

pasang basa) yang menempel pada untai DNA target yang telah terpisah. DNA yang

pendek ini disebut primer. Agar suatu prmi er dapat menempel dengan tepat pada

9
 0
target, diperlukan suhu yang rendah sekitar 55 C selama 30-60 detik.

Gambar 2. Penempelan primer dengan untai DNA yang telah terdenaturasi

Sumber: Kusuma, 2010.

3. Pemanjangan (Ekstension)

Setelah primer menempel pada untai DNA target, enzim DNA polimerase akan

memanjangkan sekaligus membentuk DNA yang baru dari gabungan antara primer, DNA

cetakan dan nukleotida.

Gambar 3. Pemanjangan DNA

Sumber : Innis M., et al., 1990 dalam Kusuma, 2010

Secara ringkas ketiga tahapan dari proses amplifikasi pada siklus pertama dapat

dilihat pada gambar di bawah ini.

10
 Gambar 4. Siklus Amplifikasi DNA dengan PCR
Sumber : Yusuf, 2010

Ketika tiga tahap di atas dilakukan pengulangan, maka untai DNA yang baru

dibentuk akan kembali mengalami proses denaturasi, penempelan dan pemanjangan untai

DNA menjadi untai DNA yang baru. Pengulangan proses PCR akan menghasilkan

amplifikasi DNA cetakan baru secara eksponensial. Produk PCR dapat diidentifikasi

melalui ukurannya dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa. Metode ini terdiri atas

menginjeksi DNA ke dalam gel agarosa dan menyatukan gel tersebut dengan listrik.

Hasilnya untai DNA kecil pindah dengan cepat dan untai yang besar diantara gel

menunjukkan hasil positif.

11
 Gambar 5. Metode elektroforesis produk PCR
Sumber: Yusuf, 2010.

Ketiga tahap siklus tersebut diulang sesuai dengan jumlah siklus amplifikasi. Pada

siklus pertama dua untai tunggal DNA cetakan akan disalin menjadi 2 DNA untai ganda.

Pada siklus kedua, 2 DNA cetakan untai ganda masing-masing akan bertindak sebagai

cetakan sehingga pada siklus kedua dihasilkan jumlah 4 DNA untai ganda. Pada siklus

berikutnya akan dihasilkan jumlah DNA secara eksponensial, dimana pada siklus ketiga

DNA akan disalin menjadi 8 kali, siklus ke 10 menjadi 1.024 kali, siklus 30 menjadi

1.073.741.824 dan seterusnya. Pada akhir siklus, DNA cetakan akan digandakan secara

eksponensial sehingga dihasilkan DNA dalam jumlah yang berlipat ganda hanya dalam

waktu yang relatif singkat sekitar 3-4 jam.

2.4 Manfaat Polymerase Chain Reacton (PCR)

Penggunaan PCR dalam bidang kesehatan maupun kedokteran sudah banyak dirasakan.

Selain memfasilitasi analisis gen, PCR juga banyak dikembangkan dalam aplikasi praktis.

12
Sebagai contoh teknik dan aplikasi PCR dapat disebutkan sebagai berikut: kloning hasil PCR,

sekuensing hasil PCR, kajian evolusi molecular, deteksi mutasi (penyakit genetik;

determinasi seks pada sel prenatal), kajian forensik (tersangka kriminal, tersangka ayah pada

kasus paternal), dan masih banyak lainnya. Dengan demikian, penemuan dan manfaat teknik

PCR ini berdampak sangat luas terhadap kemajuan sains dan teknologi secara umum.

- Kelebihan dan kekurangan PCR

PCR adalah teknologi canggih yang dapat mendeteksi DNA dengan cara amplifikasi

DNA. Hasil pemeriksaan PCR dapat membantu untuk menegakkan diagnosa sepanjang

pemeriksaan tersebut dikerjakan dengan cara yang benar dan sesuai. Keunggulan PCR

dikatakan sangat tinggi. Hal ini didasarkan atas spesifitas, efisiensi dan keakuratannya.

Masalah yang berkenaan dengan PCR yaitu biaya PCR yang masih tergolong tinggi dan

ketersediaan alat yang masih terbatas hanya di fasilitas-fasilitas kesehatan tertentu saja serta

memerlukan keterampilan khusus untuk membaca PCR karena tidak semua tenaga medis

dapat memahami PCR.

2.5 Pengertian Sequencing

Sequencing adalah penentuan urutan basa DNA dalam segmen molekul DNA yang

relatif pendek. Pengurutan ( sequencing ) asam nukleat memungkinkan kita mengetahui kode

genetic dari molekul DNA. Sequencing disebut juga metoda untuk membaca urutan basa-

basa nukleotida dari suatu gen.

2.5.1 Prinsip Dasar DNA Sequencing

DNA sequencing menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) sebagai

pijakannya. DNA yang akan ditentukan urutan basa ACGT-nya dijadikan sebagai cetakan

(template) untuk kemudian diamplifikasi (perbanyakan) menggunakan enzim dan bahan-

bahan yang mirip dengan reaksi PCR, namun ada penambahan beberapa pereaksi tertentu.

13
Proses ini dinamakan cycle sequencing.

Gambar.6. Proses Cycle Sequencing

Yang membedakan cycle sequencing dengan PCR biasa adalah:

1. Primer yang digunakan hanya satu untuk satu arah pembacaan, tidak dua (sepasang) seperti
PCR.
2. ddNTPs (dideoxy-Nucleotide Triphosphate) adalah modifikasi dari dNTPs dengan
menghilangkan gugus 3′-OH pada ribosa.

Gambar. 7. Struktur molekul dNTP dan ddNTP

Saat proses ekstensi, enzim polimerase akan membuat rantai baru DNA salinan dari

14
template dengan menambahkan dNTP-dNTP sesuai dengan urutan pada DNA cetakannya.

Jika yang menempel adalah ddNTP, maka otomatis proses polimerisasi akan terhenti karena

ddNTP tidak memiliki gugus 3′-OH yang seharusnya bereaksi dengan gugus 5′-Posfat dNTP

berikutnya membentuk ikatan posfodiester. Pada akhir cycle sequencing, yang dihasilkan

adalah fragmen-fragmen DNA dengan panjang bervariasi. Jika fragmen-fragmen tersebut

dipisahkan dengan elektroforesis, maka akan terpisah-pisah dengan jarak antar fragmennya

satu basa-satu basa.

2.5.2 Metode Sekuensing

Ada dua metode yang dapat digunakan untuk mengurutkan molekul DNA. Metode

Maxam Gilbert dan metode Sanger. Kedua metode tersebut menghasilkan fragmen-fragmen

DNA dengan panjang bervariasi, yang satu sama lain berbeda sebanyak satu basa tunggal.

Dari fragmen-fragmen tersebut kita dapat menarik kesimpulan mengenai sequence asam

nukleat molekul DNA yang diperiksa. Teknik yang digunakan adalah gel-gel poliakrilamid

pendenaturasi (denaturing polyacrylamide gels). Gel agarosa dapat memisahkan molekul-

molekul DNA dengan perbedaan panjang 30-50 basa, sedangkan gel poliakrilamid dapat

memisahkan molekul-molekul DNA dengan perbedaan panjang satu basa. Gel-gel

pendenaturasi menyebabkan molekul DNA menjadi beruntai tunggal dan tetap dalam

keadaan seperti itu sepanjang proses elektroforesis. Gel pendenaturasi mengandung urea dan

dijalankan dengan suhu yang ditinggikan. Kedua hal tersebut mendorong terjadinya

pemisahan kedua untai molekul DNA.

1. Metode Maxam-Gilbert

Metode Maxam-Gilbert merupakan metode yang didasarkan atas pemotongan DNA

didaerah spesifik oleh zat-zat kimiawi selain enzim. Akan tetapi, metode ini sekarang jarang

digunakan. Pada metode ini fragmen-fragmen DNA yang akan disekuens harus dilabeli

pada salah satu ujungnya, biasanya menggunakan fosfat radioaktif atau suatu nukleotida

15
pada ujung 3’. Metode Maxam-Gilbert dapat diterapkan baik untuk DNA untai ganda

maupun DNA untai tunggal dan melibatkan pemotongan basa spesifik yang dilakukan

dalam dua tahap. Molekul DNA terlebih dahulu dipotong-potong secara parsial

menggunakan piperidin. Pengaturan masa inkubasi atau konsentrasi piperidin akan

menghasilkan fragmen-fragmen DNA yang bermacam-macam ukurannya. Selanjutnya,

basa dimodifikasi menggunakan bahan-bahan kimia tertentu. Dimetilsulfat (DMS) akan

memetilasi basa G, asam format menyerang A dan G, hidrazin akan menghidrolisis C dan T,

tetapi garam yang tinggi akan menghalangi reaksi T sehingga hanya bekerja pada C. Dengan

demikian, akan dihasilkan empat macam fragmen, masing-masing dengan ujung G, ujung A

atau G, ujung C atau T, dan ujung C.

2. Metode Sanger

Metode yang pertama kali dikembangkan oleh Frederick Sanger pada tahun 1975,

yaitu dengan melakukan reaksi cycle sequencing pada empat tabung terpisah yang masing-

masing beris semua pereaksi yang dibutuhkan. Khusus untuk ddNTP, yang ditambahkan

hanya 1 jenis untuk setiap tabung. Setiap tabung diberi tanda, A jika yang ditambahkan

adalah ddATP, G jika ddGTP, C jika ddCTP dan T jika ddTTP. Setelah reaksi cycle

sequencing selesai, keempat hasil reaksi tersebut dirunning pada gel electrophoresis sehingga

fragmen-fragmen yang dihasilkan dapat terpisah. Urutan basa DNA dapat ditentukan dengan

mengurutkan fragmen yang muncul dimulai dari yang paling bawah (paling pendek).

Fragmen DNA dapat divisualisasi karena primer yang digunakan dilabel dengan radioaktif

atau fluorescent. Pada teknik lain, bukan primer yang dilabel melainkan dNTP. Jenis

Pelabelan Metode Sanger :

a. Dye Primers dengan Label Berbeda

Agar proses pemisahan fragmen pada gel electrophoresis bisa digabung dalam 1 lajur

saja, digunakanlah pelabel fluorescent dengan 4 warna berbeda untuk setiap reaksi cycle

16
sequencing. Dengan teknik ini visualisasi dan penentuan urutan basa dapat dilakukan dengan

lebih mudah karena keempat reaksi dipisahkan dalam satu lajur electrophoresis dengan 4

warna berbeda.

b. Dye-Terminators Sequencing

Para ilmuwan menemukan cara yang lebih simple untuk melabel ddNTP dengan 4

label fluorescent yang berbeda-beda untuk ddATP, ddCTP, ddGTP dan ddTTP. Dengan

demikian, reaksi cycle sequencing dapat dilakukan dalam 1 tabung reaksi dan diputar pada

satu lajur gel electrophoresis saja. Sangat simple dan cepat.

Dalam metode Sanger, sintesis DNA secara enzimatik terjadi melalui pembentukan

secara berurut ikatan fosfodiester antara gugus fosfat ujung 5’ bebas dari nukleotida baru

dengan gugus OH dari ujung 3’ rantai yang sedang memanjang . proses ini berlangsung

sepanjang molekul DNA. Dideoksinukleotida tidak mempunyai gugus OH pada ujung 3’nya,

melainkan gugus H. adanya dideoksinukleotida menyebabkan sintesis DNA terhenti, karena

ikatan difosfat tidak terbentuk. Pemanjangan rantai kan terhenti pada titik ini dan basa

terakhir diujung 3’ rantainya dalah sebuah terminator dideoksi. Modifikasi dari metode

sanger ini disebut dideoxy termination sequencing Dalam metode pengurutan Sanger,

digunakan empat campuran reaksi dalam pengurutan fragmen DNA. Tiap campuran reaksi

mengandung molekul DNA cetakan yang akan diurutkan, primer yang telah diberi label

dengan radioaktif, keempat macam deoksinukleotida. DNA polymerase dan empat

terminator dideoksi (ddATP, ddCTP, ddGTP, atau ddTTP). Jika salah satu dari terminator ini

digunakan pada untai DNA yang baru terbentuk, maka sintesis untai baru ini akan terhenti;

hasilnya adalah semua untai dengan panjang yang bervariasi pada campuran reaksi akan

berakhir dengan basa yang sama. Produk-produk radioaktif tersebut akan dipisahkan dengan

elektroforesis dan divisualisasikan melalui autoradiografi. Hasil autoradiografi dibaca dari

bawah gel (fragmen terpendek yang berhenti paling dekat dengan ujung 5’) kearah atas untuk

17
mengetahui sekuens basa komplementer dari untai cetakan.

Primer bersama-sama dengan DNA polimerase dan nukleotida ditambahkan ke

sampel. Melanjutkan langkah-langkah yang sama ke Proses PCR ke fase ekstensi

Sampel dibagi menjadi empat kelompok. The novalty dari metode ini melibatkan molekul

yang disebut dideoksinukleosida trifosfat (ddNTP), yang mirip dengan nukleotida normal

kecuali bahwa atom oksigen hilang dalam 3 ‘spot dari deoksiribosa. Mereka ditetapkan

sebagai ddTTP, ddATP, ddCTP, dan masing-masing sesuai ddGTP ke T, A, C, dan G. Tidak

adanya atom oksigen berakhir ekstensi primer reaksi ketika nukleotida normal digantikan

oleh ddNTP. Selain itu, masing-masing ddNTP neon memancarkan sinyal yang berbeda

untuk mengidentifikasi T, A, C, G basa.

Metode Sanger memerlukan:

1) DNA utas tunggal dalam jumlah cukup sebagai template DNA

2) Primer yang sesuai (sepotong kecil DNA yang berpasangan dengan template DNA dan

berfungsi sebagai starting point untuk replikasi

3) DNA polymerase (enzim yang mengkopi DNA, menambahkan nukleotida baru ke ujung 3

dari template

4) Sejumlah nukeotida normal 

5) Sejumlah kecil dideoxynucleotide yang dilabel (radioaktif atau dengan pewarna

fluorescent)

6) Template DNA direplikasi melibatkan nukeotida normal tetapi secara random dideoxy

(DD) nukleotida diambil (dipasangkan).

7) Penambahan dideoxy nukeotida menyebabkan reaksi berhenti

8) Hasilnya DNA dengan panjang yang bervariasi, masing-masing berhenti pada Dnukleotida

tertentu yang dilabel.

Karena tiap panjang yang berbeda bergerak dengan kecepatan yang berbeda selama

18
elektroforesis, maka urutannya dapat ditentukan.

Tahapan Sekuencing Metode Sanger

a. Tahapan sekuencing yang pertama adalah menyediakan dsDNA (double strand DNA)

b. Memotong dsDNA (double strand DNA) menjadi ssDNA (single strand DNA)

c. Mengambil template (cetakan) DNA dari ssDNA hasil potongan dari dsDNA tadi.

d. Menyediakan seluruh alat dan bahan untuk sekuensing DNA. Bahan untuk sekuensing

adalah template (cetakan) DNA, primer, dNTP, ddNTP dan enzym polymerase.

 Template DNA berfungsi sebagai cetakan. 

 Primer berfungsi sebagai landasan/pijakan yang mengenal situs spesifik pada DNA

template untuk memulai prooses polymerase. 

 dNTP (deoksi nukleotida triphospat) berfungsi sebagai sumber nukleotida pada proses

polymerase sekuensing. dNTP ada 5 jenis, yaitu dATP (deoksi adenin triphospat), dGTP

(deoksi guanin triphospat), dUTP (deoksi urasil triphospat), dCTP (deoksi citosin

triphospat), dan dTTP (deoksi timin triphospat).

19
 ddNTP (dideoksi nukleotida tri phospat) berfungsi untuk menghentikan/terminasi

proses enzim polymerase, sehingga proses perbanyakan nukleotida terhenti.

 Enzym polymerase berfungsi untuk reaksi polimerisasi atau perbanyakan nukleotida.

e. Menyiapkan 4 tabung reaksi. Masing-masing tabung reaksi diberikan ddNTP, yaitu

ddGTP, ddCTP, ddATP, dan ddTTP. Masing-masing tabung reaksi diisi dengan ddNTP

yang berbeda. Tabung pertama diisi dengan ddGTP, tabung kedua diisi dengan ddCTP,

tabung ketiga diisi dengan ddATP, dan tabung keempat diisi dengan ddTTP.

f. Setelah masing-masing tabung diisi dengan ddNTP, kemudian masing-masing tabung diisi

dengan dNTP, sebagai sumber nukleotida pada proses polimerasi. Yaitu dGTP, dCTP,

dATP dan dTTP.

g. Memasukkan dNTP ke dalam tabung reaksi tadi.

h. Kemudian memasukkan primer ke dalam tabung reaksi. Primer berfungsi mengenali situs

spesifik pada DNA template, juga berfungsi sebagai landasan/pijakan untuk memulai

polimerisasi.

20
i. Setelah pemberian primer, juga dimasukkan enzim polimerase (taq-polymerase). Enzim

polimerase memulai proses polimerisasi.

j. Enzim polymerase terus mengkatalisis pembentukan polinukleotida dari nukleotida dNTP

(deoksi nukleotida triphospat)

k. Pada saat enzim taq-polymerase mengkatalisis pembentukan ikatan antara nukleotida,

deoksi-nukleotida (ddNTP) hadir berikatan dengan polimer nukleotida sebelumnya.

l. Kehadiran ddNTP (deoksi-nukleotida) mengakibatkan terhentinya/terminasi proses

polimerase, sehingga dihasilkan rantai polinukleotida yang berbeda panjangnya.

21
Berikut ini gambar perbedaan struktur dNTP (deoksinukleotida tri phospat) dan ddNTP

(dideoksinukleotida tri phospat).

Nukleotida dengan nukleotida berikutnya, sehingga mengakibatkan terminasi/pengakhiran

proses polimerisasi.

m.Kehadiran ddNTP menghasilkan beberapa rantai polinukleotida berbeda.

n. Kegiatan nomor 9 sampai nomor 13 dilakukan pada semua tabung reaksi.

22
o. Keempat tabung reaksi tersebut dipersiapkan untuk dialirkan pada gel agarosa.

p. Perbedaan panjang polinukleotida tersebut, mengakibatkan perbedaan letak pada gel

agarosa. Polinukleotida yang paling pendek bermigrasi/pergerakannya paling cepat pada

gel agarosa.

q. Hasil pembacaan sekeuensing dari arah 5’ ke 3’ adalah rantai kompemen, yaitu 5’

AGCCGATCC 3’. Sehingga DNA templatenya adalah 5’ GGATCGGCT 3’.

2.5.3 Proses DNA Sequencing

1. Penyiapan yaitu penyiapan salah satu untai fragmen DNA yang dibagi dalam 4 bagian,

23
 kemudian setiap bagian diinkubasi dengan semua bahan yang diperlukan untuk sintesis
untas komplementer (primer, DNA polimerase, dan keempat deoksiribonukleotida
triphospat).
2. Sintesis untai DNA baru

Dimulai pada primer dan berlanjut hingga dideoksiribonukleotida dimasukkan yang

mencegah sintesis lebih lanjut. Dideoksiribonukleotida diselipkan begitu sering secara

random sebagai ganti ekuivalensi normalnya. Pada akhirnya dihasilkan serangkaian untai

radioaktif yang mempunyai panjang yang berbeda-beda.

3. Elektroforesis Gel
Untai DNA baru dalam setiap campuran, reaksi dipisahkan dengan cara
elektroforesis pada gel poliakrilamid yang dapat memisahkan untai-untainya, bahkan yang
hanya mempunyai perbedaan sekecil nukleotida panjangnya. Sampel diproses oleh
elektroforesis gel seperti biasa mengungkap urutan DNA komplementer label pada akhir
dari setiap fragmen.

24
 BAB III
PENUTUP
3.1 Kesimpulan
Kesimpulan dari makalah ini sebagai berikut.

1) Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction (PCR)

merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk melipatgandakansuatu sekuens

nukleotida tertentu secara in vitro.

2) Tujuan penggunaan PCR adalah untuk melipatgandakan suatu sekuens nukleotida

atau meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula,

sekitar 106-107 kali secara in vitro.

3) Tahapan kerja PCR secara umum adalah denaturasi, penempelan dan elongasi.

4) Sequencing adalah penentuan urutan  basa DNA dalam segmen molekul DNA yang

relatif pendek.

3.2 Saran

Penulis menyadari masih banyak terdapat kekurangan dalam proses pembuatan

makalah ini. Untuk itu, penulis dengan terbuka menerima saran atau kritikan dari rekan-rekan

serta pembaca yang membangun guna kesempurnaan makalah ini dan menambah wawasan

baru.

25
 DAFTAR PUSTAKA

Bruce, B. (Eds.). 1997. Genome Analysis, a laboratory manual. Vol 1 (Analyzing DNA).
USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Fadhilah, N. R, Febrina. M. Hatta. 2016. Penentuan Urutan Basa DNA Dalam Segmen

Molekul Dna (Dna Sequencing). Sukabumi: Universitas Muhammadiyah.

Fatchiyah, dkk. 2011. Biologi Molekular Prinsip Dasar Analisis. Jakarta: Erlangga.

Handoyo, D. dan Ari R. 2000. “Prinsip umum dan Pelaksaan Polymerase Chain Reaction
(PCR) (General principles and Implementation of Polymerase Chain Reaction)”.
Jurnal Unitas, Vol. 9, No. 1 (17-29).

Kusuma, SAF. 2010. Polymerase Chain Reaction (PCR). Bandung: Universitas Padjajaran.

Nejad AM, Narimani Z, Hosseinkhan N. 2013. Next Generation Sequencing and Sequence
Assembly. New York: Springer.

Sogandi. 2018. Biologi Molekuler: Identifikasi Bakteri Secara Molekuler. Jakarta:

Universitas 17 Aguatus 1945.

26