BIOKIMIA
Disusun Oleh :
Npm : 210106103
Kelas : Farmasi C
FAKULTAS KESEHATAN
2
KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis ucapkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmat-Nya
dan karunianya penulis dapat menyelesaikan makalah ini tepat pada waktunya.
Adapun tema dari makalah ini adalah “ISOLASI DNA BAKTERI”.
Penulis
i
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR..................................................................................................i
DAFTAR ISI................................................................................................................ii
BAB I PENDAHULUAN............................................................................................1
1.1 LATAR BELAKANG...................................................................................1
1.2 Rumusan Masalah........................................................................................2
1.3 Tujuan............................................................................................................2
BAB II PEMBAHASAN.............................................................................................3
2.1 DNA................................................................................................................3
2.1.1. Definisi DNA..........................................................................................3
2.1.2. Fungsi DNA............................................................................................4
2.2 Isolasi DNA Bakteri......................................................................................4
2.2.1. Bakteri....................................................................................................4
2.2.2. Isolasi DNA.............................................................................................5
2.2.3. Tahap dan Prinsip Isolasi DNA............................................................5
2.2.4. Isolasi DNA Bakteri...............................................................................6
BAB III PENUTUP...................................................................................................11
3.1 Kesimpulan..................................................................................................11
DAFTAR PUSTAKA....................................................................................................
ii
BAB I PENDAHULUAN
1
Isolasi DNA adalah prosedur rutin untuk mengumpulkan DNA untuk
analisis molekuler atau forensik. Isolasi DNA merupakan salah satu teknik
yang paling dasar dan penting dalam studi DNA. Isolasi/ekstraksi DNA
diperoleh dengan cara merusak atau memecahkan dinding sel sehingga DNA
keluar dari dalam sel. Isolasi DNA dilakukan dengan cara mengkultur koloni
bakteri dari hasil seleksi bakteri dalam pengujian seleksi ekstra selular. Isolasi
DNA merupakan tahap awal atau tahap pra analitik yang harus dilakukan
sebelum melakukan PCR.
Secara umum, isolasi DNA genom bakteri melibatkan tiga tahapan
yaitu perusakan sel, ekstraksi DNA, dan purifikasi DNA. Prokariot memiliki
DNA inti yang terkonsentrasi di wilayah yang tidak diselubungi oleh
membran ganda (nukleus) seperti pada sel eukariot. Tahap isolasi DNA
berhubungan dengan kualitas dan kuantitas DNA serta berperan penting
dalam keberhasilan PCR. Variasi proses pelisisan dan kemurnian DNA
menjadi dasar yang berpengaruh pada keberhasilan analisis DNA dengan
berbagai metode.
1.3 Tujuan
2
BAB II PEMBAHASAN
2.1 DNA
3
pada sistem yang peka terhadap kebutuhan energi seperti sistem saraf
dan otot (Yosephi, V et al 2016).
2.2.1. Bakteri
Identifikasi bakteri dapat dilakukan dengan menggunakan
metode konvensional dan molekuler. Metode konvensional dapat
dilakukan dengan berdasarkan pada karakteristik fenotip yaitu
pewarnaan Gram, morfologi dan reaksi biokimia. Namun, metode
identifikasi bakteri secara konvensional ini memiliki beberapa
kelemahan. Metoda ini tidak dapat digunakan untuk organisme yang
belum teridentifikasi. Lebih lanjut, kita kadang-kadang dihadapkan
dengan organisme yang menunjukkan karakteristik biokimia yang
tidak cocok dengan pola setiap genus dan spesies yang dikenal.
4
Sementara itu, identifikasi organisme yang ketika dikultur tumbuhnya
lambat menjadi sangat sulit (Woo dkk., 2013).
Karena karakter fisik dan biokimiawi merupakan karakter yang tidak
statis dan berubah karena adanya stress dan evolusi, maka hal ini juga
mempengaruhi hasil identifikasi (Ochman et al., 2015).
Faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan generasi
organisme adalah suhu, pH, oksigen, konsentrasi garam, dan nutrisi
adalah beberapa faktor yang lebih umum yang dapat berubah dalam
lingkungan normal bakteri.
5
eukaryot. Pada kebanyakan bakteri, molekul DNA berukuran besar
terorganisasi dalam bentuk kromosom sirkular. Proses pengeluaran
DNA dengan cara diekstraksi atau dilisiskan biasanya dilakukan
dengan homogenasi dengan penambahan bufer ekstrasi atau bufer lisis
untuk mencegah rusaknya DNA (Maftuchah, 2015).
Secara umum, tahap isolasi DNA dimulai dari pengambilan
sampel, pelisisan membran dan/atau dinding sel, ekstraksi DNA,
presipitasi DNA, pemurnian DNA, dan pengawetan DNA. Isolasi
DNA juga berfungsi sebagai media pembelajaran genetik, dapat
mengetahui kelainan genetik yang diderita, dapat mengetahui agen
penyebab penyakit infeksi, dan lain-lain (Maftuchah, 2015).
Prosedur:
6
1. Tumbuhkan bakteri dalam media LB cair
(Lactose Broth) dalam waktu 12-24 jam suhu
370C.
2. Ambil sebanyak 250 uL dan masukkan ke
dalam 0.5/1,5 mL tabung Eppendorf.
3. Sentrifuse 3000 rpm selama 5 menit, buang
supernatan.
4. Tambahkan 50 μL 1x PCR-buffer/ TE Buffer
5. Tambahkan 1 μL Proteinase K (10 mg/mL).
6. Bekukan minimal 1 jam pada -80°C agar
jaringan sel rusak.
7. Panaskan selama 1 jam pada 60°C dan didihkan
selama 15 menit pada 95°C (dalam mesin PCR).
8. Simpan suspensi DNA yang terbentuk pada -
20°C atau dapat digunakan langsung untuk
PCR.
b. Isolasi DNA genom (kromosom) bakteri
menggunakan Metode Reagen Kit.
Berikut ini salah satu prosedur umum isolasi DNA dari
kultur bakteri menggunakan PrestoTM Mini gDNA
Bacteria Kit. Peralatan yang digunakan antara lain:
tabung sentrifugasi, mikropipet, mikrotip, frezeer,
vortex, mesin sentrifugasi, GD column, collectiontube,
dan inkubator. Bahan yang diperlukan antara lain kultur
murni bakteri, ddH2O, proteinase K, buffer TE, dan
bahan dari PrestoTM MinigDNA Bacteria Kit.
Secara umum tahapan yang dilakukan ialah
persiapan sampel, lisis, pengikatan DNA, pencucian
DNA, dan elusi DNA. Adapun langkah kerjanya adalah
sebagai berikut:
1. Tahap persiapan sampel bakteri gram negatif,
sekitar 1 x 109 sel bakteri dimasukkan ke dalam
tabung mikrosentrifuge ukuran 1,5 mL.
2. Lakukan sentrifugasi selama 1 menit dengan
kecepatan 14.000-16.000 x g. Supernatan hasil
sentrifugasi dibuang.
7
3. Tambahkan GT Buffer sebanyak 180 μL dan
pelet dilarutkan kembali dengan menggunakan
vortex atau pipet.
4. Tambahkan Proteinase K sebanyak 20 μL
(pastikan ddH2O telah ditambahkan
sebelumnya).
5. Inkubasi pada suhu 60°C minimal selama 10
menit. Selama inkubasi, tabung dibalik setiap 3
menit.
6. Pada tahapan lisis, tambahkan 200 μL GB
Buffer ke dalam sampel dan dicampur hingga
merata dengan cara divortex selama 10 detik.
7. Inkubasi pada suhu 70°C minimal selama 10
menit. Selama inkubasi, tabung dibalik setiap 3
menit.
8. Selanjutnya pada tahap pengikatan DNA,
tambahkan 200 μL etanol absolut pada lisat
sampel dan dengan segera dicampur dengan
cara dikocok. Jika terjadi pengendapan,
pisahkan sebisa mungkin dengan menggunakan
pipet.
9. GD Column diletakkan pada Collection tube2
mL. Campuran (termasuk endapan) dipindahkan
ke dalam GD Column selanjutnya disentrifugasi
dengan kecepatan 14.000-16.000 x g selama 2
menit.
10. Collection tube ukuran 2 mL yang berisi materi
sisa dipisahkan selanjutnya GD Column
diletakkan pada Collection tube ukuran 2 mL
yang baru.
11. Pada tahap pencucian, tambahkan 400 μL of
W1 Bufer pada GD Column. Disentrifugasi
dengan kecepatan 14-16.000 x g selama 30
detik selanjutnya materi pada collection tube
dipisahkan.
12. GD Column diletakkan kembali pada collection
tube 2 mL. Ditambahkan 600 μL Wash Buffer
8
(pastikan etanol telah ditambahkan) pada GD
Column. Disentrifugasi pada kecepatan 14.000-
16.000 x g selama 30 detik selanjutnya materi
pada collection tube dipisahkan.
13. GD Column diletakkan kembali pada collection
tube 2 mL. Disentrifugasi kembali selama 3
menit pada kecepatan 14.000-16.000 x g untuk
mengeringkan kolom matrik dan selanjutnya
dilakukan elusi DNA.
14. GD Column kering dipindahkan pada tabung
mikrosentrifuge 1,5 mL bersih. Ditambahkan
pre-heated Elution Buffer ke dalam tengah
kolom matrik. Didiamkan sedikitnya 3 menit
agar Elution Buffer terserap sempurna.
Disentrifugasi dengan kecepatan 14.000-16.000
x g selama 30 detik untuk menghasilkan DNA
yang murni.
15. Setelah proses isolasi selesai, kemudian
dilanjutkan dengan analisis isolat DNA.
Analisis DNA dapat dilakukan secara kualitatif
maupun kuantitatif.
B. Isolasi DNA plasmid Bakteri (Preparasi Mini plasmid DNA
Bakteri)
Bahan yang digunakan:
Koloni bakteri dan Media Luria Berthani (LB) :
Larutan I: 50 mM glukosa; 25 mM Tris-HCl (pH 8,0);
dan larutan 1 mM EDTA (pH 8,0).
Larutan II: 5M NaOH dan 10% Sodium Dodecyl
Sulphat (SDS).
Larutan III: 5 mL kalium asetat dan asam asetat glasial.
Lain-lain: Fenol, Etanol absolut, etanol 70% dan buffer
TE pH 7,6.
Prosedur kerja:
1. Ambil stok bakteri yang berisi plasmid dari satu koloni yang
diinginkan, masukkan ke dalam tabung sentrifuga berisi
medium LB cair (broth).
9
2. Tumbuhkan (inokulasi) pada shaker inkubator bersuhu 37 oC,
goyang dengan kuat selama 12-16 jam.
3. Sentrifugasi tabung yang berisi inokulum dengan kecepatan
10.000 rpm pada suhu 4oC selama 5 menit.
4. Buang supernatan, tambahkan pelet sel bakteri dengan 100
μL larutan pertama, vortex keras selama 5 menit sampai
terlarut.
5. Tambahkan 200 μL larutan kedua (larutan ini harus dibuat
segar menjelang akan digunakan). Bolak balik keras 2-4 kali,
kemudian inkubasi pada suhu ruang selama 5 menit.
6. Tambahkan 150 μL larutan ketiga, vortex 2-3 menit,
kemudian inkubasi dalam es selama 3-5 menit.
7. Sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 oC
selama 5 menit.
8. Pindahkan supernatant ke tabung baru, tambahkan 1x volume
phenol-saturated buffer TE, kemudian vortex kuat selama 5
menit.
9. Sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu ruang
selama 5 menit.
10. Pindahkan supernatan bagian atas yang bening ke tabung
baru, tambahkan 2x volume etanol absolut, kocok dengan
tangan dan biarkan beberapa menit.
11. Sentrifugasi dengan kecepatan dengan kecepatan 10.000 rpm
pada suhu 4oC selama 5 menit.
12. Tambahkan pelet yang diperoleh dengan 500μL etanol 70%,
kemudian vortex selama 2 menit.
13. Sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 oC
selama 5 menit.
14. Ulangi langkah no. 12 dan 13 sekali lagi.
15. Kering anginkan pelet akhir. Kemudian tambahkan 50 μL
buffer TE (pH 7,6). Setelah larut, simpan di freezer pada
suhu-20oC.
(Nurhayati & Darmawati 2017)
10
BAB III PENUTUP
3.1 Kesimpulan
11
DAFTAR PUSTAKA
Faatih, M. (2012). Isolasi Dan Digesti Dna Kromosom Isolation And Digestion Of
Chromosomal Dna. Jurnal Penelitian Sains & Teknologi, 10(1), 61 – 67
Maftuchah., Aris Winaya dan Agus Zainudin. 2015. Teknik Dasar Analisis Biologi
Molekuler. Editor: Ali, Ikhwan. Deepublish. Yogyakarta.
Purba, D., Warouw, V., Rompas, R. M., Sumilat, D. A., Kreckhoff, R. L., & Ginting,
E. L. (2020). Analisis Komunitas Bakteri Pada Sampah Plastik. Ilmiah
Platax, 8(2), 38-42.
Romlah, S., Naully, P. G., & Nuraisyah, S. (2018). Perbandingan Efektivitas Metode
Iolasi DNA (Boilling Water dan CTAB) Pada Bakteri Klebsiella
pneumoniae. Dies Natalis ke-16 STIKES Jenderal Achmad Yani Cimahi
PINLITAMAS, 1(1), 628-632
Samah, E., & Ernita, M.(2020). Isolasi DNA Bakteri Pendegradasi Sulfat dari Tanah
Masam dengan Metode Molekular. Jurnal Pertanian Tropik, 7(1), 84-91
Wasdili, F. A. Q., & Gartinah, T. (2018). Penentuan Kualitas Isolasi DNA Salmonella
Typhimurium Dengan Metode Spektrofotometri dan Elektroforesis. Prosiding
PIN-LITAMAS, 1(1), 1.
Woo Patrick C. Y., Ng Kenneth H. L., Lau Susanna K. P., Yip Kam-tong, Fung Ami
M. Y., Leung Kit-wah, Tam Dorothy M. W., Que Tak-lun, dan Yuen Kwok-
yung. (2013). Usefulness of the MicroSeq 500 16S Ribosomal DNA-Based
Bacterial Identification System for Identification of Clinically Significant
Bacterial Isolates with Ambiguous Biochemical Profiles. Journal of Clinical
Microbiology; 41(5)