MAKALAH TEKNIK PEMERIKSAAN BIOLOGI

MOLEKULER

ISOLASI DNADARI SPUTUM

Dosen Pembimbing : Sri Ujiani, S.Pd, M.Biomed

Disusun : Kelompok 6
1. Khansa Yoan Abesha 1713353042
2. Tika Anggraini 1713353044
3. Diah Yulia Citra 1713353045
4. Ratna Sri Indrayani 1713353047
5. Happya Ghaziani 1713353048
6. Dwi Prahesti 1713353049
7. Ananda Putri Pravita B. 1713353050
8. Adika Afri Dermawan 1613353046

POLITEKNIK KESEHATAN TANJUNG KARANG

PRODI DIPLOMA IV ANALIS KESEHATAN
2020

i
 KATA PENGANTAR

Dengan menyebut nama Allah SWT yang Maha Pengasih lagi Maha Penyayang, kami
panjatkan puja dan puji syukur atas kehadirat-Nya, yang telah melimpahkan rahmat, hidayah,
dan hidayah-Nya kepada kami, sehingga kami dapat menyelesaikan makalah teknik
pemeriksaan biologi molekuler ini yang berjudul “ISOLASI DNA DARI SPUTUM”

Makalah ini telah kami susun dengan maksimal dan mendapatkan bantuan dari berbagai
pihak sehingga dapat memperlancar pembuatan makalah ini. Untuk itu kami menyampaikan
banyak terima kasih kepada semua pihak yang telah berkontribusi dalam penyusunan
makalah ini.
Kami menyadari bahwa makalah ini belum sempurna. Oleh karena itu, saran dan kritik yang
membangun dari rekan-rekan sangat dibutuhkan untuk penyempurnaan makalah ini. Atas
perhatiannya kami ucapkan banyak terima kasih.

Bandar Lampung, januari 2020

Kelompok 6

ii
 DAFTAR ISI

Kata Pengantar .................................................................................................................... (ii)

Daftar Isi ............................................................................................................................ (iii)

Bab I : Pendahuluan

1.1 Latar Belakang ................................................................................................. (1)

1.2 Rumusan Masalah ............................................................................................ (2)

1.3 Tujuan .............................................................................................................. (2)

Bab II : Pembahasan

2.1 Pengertian isolasi DNA ..................................................................................... (3)

2.2 Manfaat Isolasi DNA........................................................................................ (4)

2.3 Tahapan Isolasi DNA........................................................................................(4)

2.4 Pengertian sputum ............................................................................................. (13)

2.5 Alat dan Bahan .................................................................................................. (14)

2.6 Cara kerja isolasi DNA dari sputum ................................................................. (15)

Bab III : Penutup

3.1 Kesimpulan .................................................................................................... (18)

3.2 Saran ............................................................................................................... (18)

DAFTAR PUSTAKA .........................................................................................................(19)

iii
iv
i
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Deoxyribonucleic acid atau DNA merupakan senyawa kimia yang paling penting dalam
makhluk hidup.DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk
hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya. Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan
membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional
dalam sel organisme. DNA genom meliputi gen danintergen (Suryo, 2004).

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk
mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat
pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus
berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA
mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein
histon. Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya
mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki
pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA
prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot
berbentuk linier dan memiliki protein histon (Kirsman, 2010).

DNA dapat mengalami denaturasi dan renaturasi. Selain itu DNA juga bisa diisolasi.
Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi esktrak sel,
pemurnian DNA dari ekstrak sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat
dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat
memberikan hasil yang berbeda, hal ini karena adanya senyawa polifenol dan
polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA...
Semakin tinggi kadar air maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit,
sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit (Donata, 2007).

Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsipisolasi DNA yaitu
dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untukmemisahkan campuran
berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar

1
 akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas
tabung . Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu
supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Rachmat, 2012).

Prinsip – prinsip dalam mengisolasi DNA (Tohib, 2012) :

1. melisis sel secara fisik, dengan cara penggerusan.

2. pemecahan dinding sel.
3. pemecahan membran sel.
4. pemisahan DNA dari bahan yang lain.

Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau
pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA.
Selain itu ada 2 prinsip lagi dalam melakukan isolasi DNA, yaitu sentrifugasi dan
presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan
berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi
yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan
terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang
bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi.

1.2 Rumusan masalah

1. Apa yang dimaksud dengan isolasi DNA?

2. Apa manfaat dari isolasi DNA ?
3. Apa saja tahapan dari isolasi DNA ?
4. Apa yang dimaksud dengan sputum?
5. Bagaimana cara kerja dari isolasi DNA dari sputum?

1.3 Tujuan

1. Mengetahui pengertian dari isolasi DNA

2. Dapat mengetahui apa saja manfaat dari isolasi DNA.
3. Dapat mengetahui apa saja tahapan dari isolasi DNA.
4. Mengetahui apa itu sputum yang merupakan sampel untuk pemeriksaan dengan
teknik biomol
5. Mengetahui bagaimana cara kerja atau tahapan tahapan ari isolasi DNA dari
sputum?

2
 BAB II
PEMBAHASAN

2.1 Pengertian Isolasi DNA

Gambar 1. Struktur DNA

(Sumber: Priyani, 2004)

Isolasi DNA merupakan proses untuk mendapatkan DNA murni dari makhluk hidup
untuk keperluan bioteknologi. Secara spesifik untuk mengisolasi DNA yang mencangkup
gen tertentu dapat dilakukan dengan beberapa teknik, yaitu:
1. Isolasi DNA genom dan dilanjutkan pemotongan DNA genom menggunakan enzim
endonuklease retriksi.
2. Mengisolasi mRNA yang merupakan hasil transkripsi gen yang dimaksud kemudian
dilanjut dengan membuat turunan (Complementery DNA/cDNA),
3. Menyintesis nukleotida yang menyusun gen tersebut (membuat gen sintetik) dengan
teknik sintesis kimiawi.
4. Melakukan implifikasi DNA dengan teknik (Polimerase Chain Reaction). (Yuwono,
2008)

Isolasi Dna merupakan suatu proses untuk mendapatkan DNA murni yang dapat
digunakan untuk keperluan pemeriksaan atau diagnosa. DNa dapat di isolasi dari bergabai
sal yang memiliki inti sel, karena DNA terletak di dalam inti sel. beberapa sumber DNA

3
 yang dapat dipergunakan dalam isolasi DNA adalah urine, darah, biopsi,rambut, gigi,
kuku , sputum dan lainya.
2.2 Manfaat Isolasi DNA

Isolasi DNA diperlikan untuk analisis genetik, yang digunakan untuk tujuan ilmiah, medis
atau forensik. Para ilmuan menggunakan sejumlah DNA untuk di sejumlah aplikasi,
seperti pengenalan DNA ke dalam sel dan binatang atau tanaman , atau untuk tujuan
diagnostik. Dalam obat aplikasi yang terakhir adalah yang paling umum. Di sisi lain , ilmu
forensik perlu memulihkan DNA untuk identifikasi individu ( bagi pemerkosa misalnya ,
pencuri kecil, kecelakaan atau korban perang) , penentu ayah , dan pabrik atau identifikasi
hewan. Berikut beberapa manfaat lain dari isolasi DNA yaitu sebagai berikut :

 Menghancurkan membrane sel

 Disosiasi protein sel
 Pemisahan DNA dari komponen terlarut lainnya
 Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel.
 Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan pustaka genomik
 Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan (template ) dalam prosedur
perbanyakan DNA secara in vitro melalui teknik PCR.

2.3 Tahapan Isolasi DNA

Menurut Lubis (2013), molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi
untuk berbagai macam keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui
elektroforesis. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan
lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga
yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti
selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. Ada beberapa hal yang perlu diperhatikan
dalam proses isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya
kontaminan seperti protein dan RNA; metodenya harus efektif dan bisa dilakukan untuk
semua spesies metode yang dilakukan tidak boleh mengubah struktur dan fungsi molekul
DNA; dan metodenya harus sederhana dan cepat. Isolasi DNA bergantung pada:
1. Banyaknya DNA yang ingin didapatkan dari isolasi.
2. Jenis organisme yang akan diisolasi DNA nya.

4
 Isolasi DNA hewan berbeda dengan tumbuhan. Isolasi DNA organisme prokaryotik
juga berbeda dengan isolasi DNA organisme eukaryotik. Untuk mendapatkan DNA
berkualitas, setiap step harus dilakukan dengan benar. DNA yang baik ciri-cirinya adalah
transparan dan tidak lengket seperti jelly. Jika lengket seperti jelly, berarti terdapat
banyak polisakarida dalam isolate (Faatih, 2009).
Prisnsip isolasi DNA pada berbagai jenis sel atau jaringan pada berbagai organisme
pada dasarnya sama namun memiliki modifikasi dalam hal teknik dan bahan yang
digunakan. Bahkan beberapa teknik menjadi lebih mudah dengan menggunakan kit yang
diproduksi oleh suatu perusahaan sebagai contoh kit yang digunakan untuk isolasi DNA
pada tumbuhan seperti Kit Nucleon Phytopure sedangkan untuk isolasi DNA pada hewan
digunakan GeneJETTM Genomic DNA Purification Kit. Namun tahapan-tahapan isolasi
DNA dalam setiap langkahnya memiliki protokol sendiri yang disesuaikan dengan
keperluan. Penggunaan teknik isolasi DNA dengan kit dan manual memiliki kelebihan
dan kekurangan. Metode konvensional memiliki kelebihan harga lebih murah dan
digunakan secara luas sementara kekurangannya membutuhkan waktu yang relatif lama
dan hasil yang diperoleh tergantung jenis sampel (Faatih, 2009).
Isolasi DNA dapat menggunakan Wizard Genomic DNA Purification Kit atau
Genomic DNA Mini Kit. Wizard Genomic DNA Purification Kit dirancang untuk
mengisolasi DNA dari leukosit, jaringan hewan dan tumbuhan, yeast, bakteri gram
positif dan bakteri gram negatif. Prinsip isolasi DNA menggunakan Wizard Genomic
DNA Purification Kit yaitu lisis, ekstraksi, homogenisasi, presipitasi protein, rehidrasi
DNA. Lisis bertujuan untuk menghancurkan dinding sel maupun membran sel. Ekstraksi
bertujuan untuk menghancurkan sel sehingga materi yang ada di dalam sel dapat keluar.
Homogenisasi bertujuan untuk mencampurkan zat. Homogenisasi biasanya dilakukan
setiap penambahan suatu zat. Teknik-teknik homogensasi meliputi flicking, thawing,
inverting, dan vortexing. Presipitasi atau pengendapan bertujuan untuk memisahkan
supernatant dengan pellet. Rehidrasi DNA merupakan teknik pemurnian DNA dengan
cara mengeringkan atau menguapkan (Faatih, 2009).
Genomic DNA Mini Kit merupakan salah satu metode untuk pemurnian DNA dari
jaringan hewan dan serangga. Prinsip isolasi DNA menggunakan Genomic DNA Mini Kit
yaitu lisis, ekstraksi, dan presipitasi. Sama seperti prinsip Wizard Genomic DNA
Purification Kit, lisis bertujuan untuk menghancurkan dinding atau menbran sel.
Ekstraksi dilakukan agar sel hancur sehingga isi sel keluar. Presipitasi dilakukan untuk

5
menghasilkan supernatant dan pellet. Akan tetapi, dalam Genomic DNA Mini Kit
dibutuhkan GD column (Faatih, 2009).
Perusakan dinding sel biasanya menggunakan nitrogen cair yang memiliki suhu -
169˚C. Penggunakan nitrogen cair ini dimaksudkan untuk membekukan sel, setelah sel
beku lalu sel dirusak (digerus) sampai benar benar halus dengan mortar agar dinding sel
rusak. Lisis membran sel yaitu proses untuk meluruhkan membran sel pada nukleus.
Teknik ini umumnya dilakukan menggunakan larutan deterjen kationik yaitu CTAB. Hal
ini dikarenakan waktu isolasi yang relatif cepat serta tahapan metode yang relatif lebih
mudah. Bufer CTAB merupakan detergen kationik yang dapat melisis membran sel dan
mampu mengendapkan polisakarida serta senyawa-senyawa fenolik (Faatih, 2009).
Penggunakan CTAB berfungsi untuk mengurangi kontaminan, mengurangi
browning dan untuk menjaga DNA agar tidak rusak. Komponen-komponen yang
terkandung dalam bufer CTAB adalah Tris-Cl, EDTA, NaCl, CTAB, PVP, dan
merkaptoetanol. Tris-Cl berfungsi untuk mendenaturasi protein. NaCl berfungsi sebagai
bahan penetral pada gula fosfat DNA. EDTA berfungsi sebagai penghancur sel dengan
cara mengikat ion magnesium yang diperlukan oleh sel untuk menjaga keutuhan
selubung sel secara keseluruhan. Larutan CTAB, PVP, dan merkaptoetanol berfungsi
untuk mendegradasi senyawa-senyawa metabolit sekunder sekaligus mengurangi
browning akibat oksidasi (Lubis, 2013).
Pemurnian (purifikasi) DNA bertujuan untuk menghilangkan beberapa kontaminan
seperti senyawa sekunder (fenol), polisakarida, RNA dan juga protein. Pemurnian dari
kontaminan protein dan RNA dilakukan menggunakan senyawa kloroform
isoamilalkohol, asam asetat, dan enzim RNAse. Senyawa kloroform isoamilalkohol dan
asam asetat berfungsi mendenaturasi protein sedangkan enzim RNAse berfungsi
melisiskan RNA dari ekstrak DNA tersebut. Presipitasi (pemekatan) DNA dilakukan
menggunakan isopropanol dingin yang bertujuan agar DNA tersebut
mengendap/mengumpul sekaligus memisahkannya dari garam-garam mineral sisa
CTAB. Pelet hasil presipitasi oleh isopropanol ini dibersihkan menggunakan alkohol
70%. Pemurnian ini merupakan tahapan paling penting dalam Isolasi DNA. Karena bila
ada kontaminan selain DNA maka hasil isolasi DNA yang dilakukan diangap gagal.
Kontaminasi ini dapat menurunkan kualitas DNA hasil isolasi dan mengakibatkan data
yang didapat tidak valid (Faatih, 2009).
Reagent-reagent yang umum digunakan dalam teknik isolasi DNA yaitu nitogen
cair, polyvinyl pyrrolidone (PVP), bufer CTAB, mercaptoethanol, CHISAM, isopropanol

6
dingin, bufer Tris-EDTA (TE), RNAse, dan ethanol 70%. Sedangkan alat-alatnya adalah
sebagai berikut, yaitu mortar dan pestle, tabung nitrogen, tube eppendorf 1,5 ml atau 2
ml, mikropipet, oven, freezer, mesin elektrofotometer, mesin spektrofotometer, mesin
sentrifuse, pipet tip 1000 µl dan 20 µl (Faatih, 2009).

Gambar 2. Tahapan Isolasi DNA

(Sumber: Faatih, 2009)

Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau penghancuran
membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal isolasi
DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel. Tahap penghancuran sel atau jaringan
memiliki beberapa cara yakni dengan cara fisik seperti menggerus sampel dengan
menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan metode
freezing-thawing dan iradiasi. Cara lain yakni dengan menggunakan kimiawi maupun
enzimatik. Penghancuran dengan menggunakan kimiawi seperti penggunaan detergen
yang dapat melarutkan lipid pada membran sel sehingga terjadi destabilisasi membran
sel. Sementara cara enzimatik seperti menggunakan proteinase K seperti untuk
melisiskan membran pada sel darah serta mendegradasi protein globular maupun rantai
polipeptida dalam komponen sel (Lubis, 2013).
Pada proses lisis dengan menggunakan detergen, sering digunakan Sodium Dodecyl
Sulphate (SDS) sebagai tahap pelisisan membran sel. Detergen tersebut selain berperan
dalam melisiskan membran sel juga dapat berperan dalam mengurangi aktivitas enzim
nuklease yang merupakan enzim pendegradasi DNA. Selain digunakan SDS, detergen
yang lain seperti Cetyl Trimethylammonium Bromide (CTAB) juga sering dipakai untuk
melisiskan membran sel pada isolasi DNA tumbuhan. Parameter keberhasilan dalam

7
penggunaan CTAB bergantung pada beberapa hal. Pertama, Konsentrasi NaCl harus di
atas 1.0 M untuk mencegah terbentuknya kompleks CTAB-DNA. Karena jumlah air
dalam pelet sel sulit diprediksi, maka penggunaan CTAB sebagai pemecah larutan harus
dengan NaCl dengan konsentrasi minimal 1.4 M (Lubis, 2013).
Kedua, ekstrak dan larutan sel yang mengandung CTAB harus disimpan pada suhu
ruang karena kompleks CTAB-DNA bersifat insoluble pada suhu di bawah 15°C. Ketiga,
penggunaan CTAB dengan kemurnian yang baik akan menentukan kemurnian DNA
yang didapatkan dan dengan sedikit sekali kontaminasi polisakarida. Setelah
ditambahkan CTAB, sampel diinkubasikan pada suhu kamar. Tujuan inkubasi ini adalah
untuk mencegah pengendapan CTAB karena CTAB akan mengendap pada suhu 15°C.
Karena efektivitasnya dalam menghilangkan polisakarida, CTAB banyak digunakan
untuk purifikasi DNA pada sel yang mengandung banyak polisakarida seperti terdapat
pada sel tanaman dan bakteri gram negatif seperti Pseudomonas, Agrobacterium, dan
Rhizobium (Lubis, 2013).
Dalam penggunaan buffer CTAB seringkali ditambahkan reagen-reagen lain seperti
NaCl, EDTA, Tris-HCl, dan 2-mercaptoethanol. NaCl berfungsi untuk menghilangkan
polisakarida sementara 2-mercaptoethanol befungsi untuk menghilangkan kandungan
senyawa polifenol dalam sel tumbuhan. 2-mercaptoethanol dapat menghilangkan
polifenol dalam sel tanaman dengan cara membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa
polifenol yang kemudian akan terpisah dengan DNA. Senyawa polifenol perlu
dihilangkan agar diperoleh kualitas DNA yang baik. Polifenol juga dapat menghambat
reaksi dari enzim Taq polimerase pada saat dilakukan amplifikasi. Di samping itu
polifenol akan mengurangi hasil ektraksi DNA serta mengurangi tingkat kemurnian
DNA. Penggunaan 2-mercaptoethanol dengan pemanasan juga dapat mendenaturasi
protein yang mengkontaminasi DNA (Lubis, 2013).
Konsentrasi dan pH dari buffer yang digunakan harus berada dalam rentang pH 5
sampai 12. Larutan buffer dengan pH rendah akan mengkibatkan depurifikasi dan
mengakibatkan DNA terdistribusi ke fase fenol selama proses deproteinisasi. Sedangkan
pH larutan yang tinggi di atas 12 akan mengakibatkan pemisahan untai ganda DNA.
Fungsi larutan buffer adalah untuk menjaga struktur DNA selama proses penghancuran
dan purifikasi sehingga memudahkan dalam menghilangkan protein dan RNA serta
mencegah aktivitas enzim pendegradasi DNA dan mencegah perubahan pada molekul
DNA. Untuk mengoptimalkan fungsi larutan buffer, dibutuhkan konsentrasi, pH,
kekuatan ion, dan penambahan inhibitor DNAase dan detergen (Lubis, 2013).

8
 Pada tahapan ekstraksi DNA, seringkali digunakan chelating agent seperti
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) yang berperan menginaktivasi enzim DNase
yang dapat mendenaturasi DNA yang diisolasi, EDTA menginaktivasi enzim nuklease
dengan cara mengikat ion magnesium dan kalsium yang dibutuhkan sebagai kofaktor
enzim DNAse. DNA yang telah diekstraksi dari dalam sel selanjutnya perlu dipisahkan
dari kontaminan komponen penyusun sel lainnya seperti polisakarida dan protein agar
DNA yang didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi. Fenol seringkali digunakan
sebagai pendenaturasi protein, ekstraksi dengan menggunakan fenol menyebabkan
protein kehilangan kelarutannya dan mengalami presipitasi yang selanjutnya dapat
dipisahkan dari DNA melalui sentrifugasi (Lubis, 2013).
Setelah sentrifugasi akan terbentuk 2 fase yang terpisah yakni fase organik pada
lapisan bawah dan fase aquoeus (air) pada lapisan atas sedangkan DNA dan RNA akan
berada pada fase aquoeus setelah sentrifugasi sedangkan protein yang terdenaturasi akan
berada pada interfase dan lipid akan berada pada fase organic. Selain fenol, dapat pula
digunakan campuran fenol dan kloroform atau campuran fenol, kloroform, dan isoamil
alkohol untuk mendenaturasi protein. Ekstrak DNA yang didapat seringkali juga
terkontaminasi oleh RNA sehingga RNA dapat dipisahkan dari DNA ekstrak dengan
cara pemberian RNAse (Lubis, 2013).

Gambar 3. Fase-fase pada Isolasi DNA

(Sumber: Lubis, 2013)

Asam nukleat adalah molekul hidrofilik dan bersifat larut dalam air. Disamping itu,
protein juga mengandung residu hidrofobik yang mengakibatkan protein larut dalam
pelarut organik. Berdasarkan sifat ini, terdapat beberapa metode deproteinisasi
berdasarkan pemilihan pelarut organik. Biasanya pelarut organik yang digunakan adalah

9
fenol atau kloroform yang mengandung 4% isoamil alkohol. Penggunaan kloroform
isoamil alkohol (CIA) berdasarkan perbedaan sifat pelarut organik. Kloroform tidak
dapat bercampur dengan air dan kemampuannya untuk mendeproteinisasi berdasarkan
kemampuan rantai polipeptida yang terdenaturasi untuk masuk atau termobilisasi ke
dalam fase antara kloroform – air. Konsentrasi protein yang tinggi pada fase antara
tersebut dapat menyebabkan protein mengalami presipitasi. Sedangkan lipid dan
senyawa organik lain akan terpisah pada lapisan kloroform (Lubis, 2013).
Proses deproteinisasi yang efektif bergantung pada besarnya fase antara kloroform-
air. Proses ini dapat dilakukan dengan membentuk emulsi dari air dan kloroform. Hal ini
hanya dapat dilakukan dengan penggojogan atau sentrifugasi yang kuat karena kloroform
tidak dapat bercampur dengan air. Isoamil alkohol berfungsi sebagai emulsifier dapat
ditambahkan ke kloroform untuk membantu pembentukan emulsi dan meningkatkan luas
permukaan kloroform-air yang mana protein akan mengalami presipitasi. Penggunaan
kloroform isoamil alkohol ini memungkinkan untuk didapatkan DNA yang sangat murni,
namun dengan ukuran yang terbatas (20.000–50.000 bp). Fungsi lain dari penambahan
CIA ini adalah untuk menghilangkan kompleks CTAB dan meninggalkan DNA pada
fase aquoeus. DNA kemudian diikat dari faseaquoeus dengan presipitasi etanol (Lubis,
2013).
Setelah proses ekstraksi, DNA yang didapat dapat dipekatkan melalui
presipitasi.Pada umumnya digunakan etanol atau isopropanol dalam tahapan presipitasi.
Kedua senyawa tersebut akan mempresipitasi DNA pada fase aquoeus sehingga DNA
menggumpal membentuk struktur fiber dan terbentuk pellet setelah dilakukan
sentrifugasi. Presipitasi juga berfungsi untuk menghilangkan residu-residu kloroform
yang berasal dari tahapan ekstraksi (Faatih, 2009).
Prinsip-prinsip presipitasi antara lain pertama, menurunkan kelarutan asam nukleat
dalam air. Hal ini dikarenakan molekul air yang polar mengelilingi molekul DNA di
larutan aquoeus. Muatan dipole positif dari air berinteraksi dengan muatan negatif pada
gugus fosfodiester DNA. Interaksi ini meningkatkan kelarutan DNA dalam air.
Isopropanol dapat bercampur dengan air, namun kurang polar dibandingkan air. Molekul
isopropanol tidak dapat berinteraksi dengan gugus polar dari asam nukleat sehingga
isopropanol adalah pelarut yang lemah bagi asam nukleat; kedua, penambahan
isopropanol akan menghilangkan molekul air dalam larutan DNA sehingga DNA akan
terpresipitasi; ketiga, penggunaan isopropanol dingin akan menurunkan aktivitas
molekul air sehingga memudahkan presipitasi DNA (Faatih, 2009).

10
 Pada tahapan presipitasi ini, DNA yang terpresipitasi akan terpisah dari residu-
residu RNA dan protein yang masih tersisa. Residu tersebut juga mengalami koagulasi
namun tidak membentuk struktur fiber dan berada dalam bentuk presipitat granular.
Pada saat etanol atau isopropanol dibuang dan pellet dikeringkan dalam tabung, maka
pellet yang tersisa dalam tabung adalah DNA pekat. Proses presipitasi kembali dengan
etanol atau isopropanol sebelum pellet dikeringkan dapat meningkatkan derajat
kemurnian DNA yang diisolasi. Pencucian kembali pellet yang dipresipitasi oleh
isopropanol dengan menggunakan etanol bertujuan untuk menghilangkan residu-residu
garam yang masih tersisa. Garam-garam yang terlibat dalam proses ekstraksi bersifat
kurang larut dalam isopropanol sehingga dapat terpresipitasi bersama DNA, oleh sebab
itu dibutuhkan presipitasi kembali dengan etanol setelah presipitasi dengan isopropanol
untuk menghilangkan residu garam (Faatih, 2009).
Setelah dilakukan proses presipitasi dan dilakukan pencucian dengan etanol, maka
etanol kemudian dibuang dan pellet dikeringanginkan, perlakuan tersebut bertujuan
untuk menghilangkan residu etanol dari pelet DNA. Penghilangan residu etanol
dilakukan dengan cara evaporasi karena etanol mudah menguap. Pada tahap pencucian
biasanya etanol dicampur dengan ammonium asetat yang bertujuan untuk membantu
memisahkan kontaminan yang tidak diinginkan seperti dNTP dan oligosakarida yang
terikat pada asam nukleat (Rosana, 2014).
Setelah pellet DNA dikeringanginkan, tahap selanjutnya adalah penambahan buffer
TE ke dalam tabung yang berisi pellet dan kemudian disimpan di dalam freezer dengan
suhu sekitar -20ºC. Buffer TE dan penyimpanan suhu pada -20ºC bertujuan agar sampel
DNA yang telah diekstraksi dapat disimpan hingga waktu berminggu-minggu. Pelarutan
kembali dengan buffer TE juga dapat memisahkan antara RNA yang mempunyai berat
molekul lebih rendah dibandingkan DNA sehingga DNA yang didapatkan tidak
terkontaminasi oleh RNA dan DNA sangat stabil ketika disimpan dalam keadaan
terpresipitasi pada suhu -20ºC (Rosana, 2014).
Menurut Rosana (2014), isolasi DNA juga dapat dilakukan dengan menggunakan kit
yang sudah diproduksi oleh beberapa perusahan untuk mempermudah dan mempercepat
proses isolasi DNA. Kit isolasi juga disesuaikan dengan kebutuhan oleh konsumen dan
jenis sel yang akan digunakan.

11
 Gambar 4. Isolasi DNA
(Sumber: Rosana, 2014)
 Metode Isolasi DNA
1. Teknik Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)
Teknik pengujian polimorfisme DNA berdasarkan pada amplifikasi dari
segmen-segmen DNA acak yang menggunakan primer tunggal yang sekuen
nukleotidanya ditentukan secara acak. Primer tunggal ini biasanya berukuran 10
basa. PCR dilakukan pada suhu anealing yang rendah yang memungkinkan primer
menempel pada beberapa lokus pada DNA. Aturan sederhana untuk primer adalah
terdiri atas 18-28 susunan basa dengan persentase G+C 50-60% (Rosana, 2014).
2. Metode CTAB
Menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari
polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differensial of
solubility). Di samping diperoleh fragmen DNA, dengan metode CTAB juga akan
diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh berada di bawah pita DNA.
Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang diekstraksi (Rosana, 2014).
3. Phenol:Chloroform
Mengunakan senyawa Phenol-choloroform-isoamyl alcohol, Metode standard
untuk ekstraksi DNA, Akhir-akhir ini ditinggalkan, karena sifat toksik phenol
(Rosana, 2014).
4. Salting Out
Menggunakan garam konsentrasi tinggi (NaCl 6 M), untuk medenaturisasi protein
menggunakan Proteinase K untuk denaturasi protein (Rosana, 2014).
5. Guanidine Isothiocyanate

12
 Metode ini lebih cepat dibanding dua metode sebelumnya, Thiocyanate bersifat
toksik, untuk lisis dinding sel, memerlukan chloroform untuk denaturasi protein
(Rosana, 2014).
6. Silica Gel
Silica gel dapat mengikat DNA dengan perantaraan garam/buffer tertentu (NaI),
Cepat, tetapi recovery DNA kurang (Rosana, 2014).
7. PCR (Polymerase Chain Reaction)
Merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in
vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida.
Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA
untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut
mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif
(Rosana, 2014).

2.4 Pengertian Sputum

Sputum (dahak) adalah bahan yang dikeluarkan dari paru dan trakea melalui mulut.
Biasanya juga disebut dengan ecpectoratorian (Dorland, 1992).Sputum, dahak, atau
riak adalah sekret yang dibatukkan dan berasal dari tenggorokan, hidung atau mulut.
Perbedaan ini hendaknya dijelaskan kepada pasien yang dahaknya akan diperiksa.
Sputum yang dikeluarkan oleh seorang pasien hendaknya dapat dievaluasi sumber,
warna, volume, dan konsistennya karena kondisi sputum biasanya memperlihatkan
secara spesifik proses kejadian patologik pada pembentukan sputum itu sendiri.
Pemeriksaan sputum diperlukan jika diduga terdapat penyakit paru-paru. Membran
mukosa saluran pernafasan berespons terhadap inflamasi dengan meningkatkan
keluaran sekresi yang sering mengandung mikroorganisme penyebab penyakit.
Sputum berbeda dengan sputum yang bercampur dengan air liur. Cairan sputum lebih
kental dan tidak terdapat gelembung busa di atasnya. Sputum diambil dari saluran
nafas bagian bawah sedangkan sputum yang bercampur air liur diambil dari
tenggorokan.

13
2.5 Bahan dan Alat
 Bahan :
1. Sampel sputum
2. Larutan PBS (Phosphate Buffer Saline)
3. Suspensi diatom
4. Larutan TE (Tris-EDTA)
5. Larutan pelisis untuk isolasi DNA dari isolat MTB (guanidin tiosianat, Tris-
HCl, EDTA, dan Triton-X)
6. Larutan pelisis untuk isolasi DNA metagenomik (Tris HCl 100 mM pH 8;
EDTA 100 mM pH 8; NaCl 1,5 M; dan natrium fosfat 100 mM pH 8; dan SDS
2%)
7. Proteinase K
8. Etanol 70%
9. Aseton
10. NaOH
11. Kloroform
12. Isoamil alcohol
13. Isopropanol
Sedangkan untuk deteksi produk PCR dengan elektroforesis, bahan yang digunakan
adalah :
1. Agarosa (Promega)
2. TBE (Tris-Borat-EDTA) dan TAE (Tris-Asetat-EDTA)
3. EtBr (Ethidium Bromida).

 Peralatan :
1. alat-alat gelas yang biasa digunakan dalam laboratorium analisis
2. satu set pipet mikro 0,1-10 μL
3. tabung mikro (Eppendorf) 1,5 mL
4. vortex
5. shaker
6. rotator tipe H-SR 200
7. Biological Safety Cabinet Class II
8. Sorvall Biofuge Primo R Centrifuge

14
 9. Lemari pendingin
10. Waterbath
11. Thermalcycler (Sensoquest)
12. Kertas parafilm
13. Satu set alat elektroforesis
14. GelDoc (BioRad).

2.6 Cara Kerja Isolasi DNA dari Sputum

 Metode Isolasi DNA metagenomik dengan metode modifikasi Isolasi DNA dari
sputum menggunakan metode modifikasi dari Zhou et al. (1996) dan Patel et al.
(1997).
1. Sampel sputum ditambahkan dengan volume yang sama 1 M NaOH.
2. Kemudian disuspensi dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 1 jam.
3. Selanjutnya disentrifugasi pada 3000 x g selama 20 menit dan supernatan
dibuang.
4. Pelet sputum yang diperoleh disimpan pada -20ºC selama 1 jam, kemudian
diinkubasi pada 80°C selama 45 menit dan didinginkan ke dalam es selama 15
menit.
5. Suspensi di atas ditambah 0,5 mL buffer lisis dan dihomogenkan dengan
vorteks selama 1 menit dan diinkubasi pada 60º C selama 2 jam (setiap
interval 15 menit dihomogenkan dengan vorteks).
6. Setelah suspensi tercampur merata, ditambahkan 10 μL proteinase K (10
mg/mL).
7. Selanjutnya suspensi di atas diinkubasi pada 37°C dengan guncangan selama
45 menit.
8. Setelah itu suspensi disentrifugasi pada kecepatan 5000 x g selama 10 menit.
9. Supernatan dipindahkan ke dalam tabung mikro baru steril. Supernatan
tersebut ditambahkan campuran kloroform : isoamil alkohol (perbandingan
volume = 24 : 1), kemudian disentrifugasi pada 10.000 x g selama 15 menit.
10. Lapisan atas diambil, dipindahkan ke dalam tabung steril baru dan dicampur
dengan isopropanol sebanyak 1 kali volume.
11. Campuran ini diinkubasi pada suhu -20oC selama 2 jam.
12. Selanjutnya campuran tersebut disentrifugasi pada 10.000 x g selama 15
menit.

15
 13. Pelet yang diperoleh ditambah 100-200 μL etanol 70 %, dan disimpan pada -
20º C selama 15 menit, lalu disentrifugasi kembali pada 10.000 x g selama 15
menit.
14. Supernatan dibuang dan pelet dikeringkan pada suhu kamar, selanjutnya
dilarutkan dalam 200 μL buffer TE pH 8 (Tris Cl 10 mM, EDTA 1 mM pH 8).

 Isolasi DNA metagenomik dengan kit Isolasi DNA metagenomik dari sputum
pasien M. tuberculosis dilakukan dengan Kit (PowerSoil DNA Isolation Kit dari
MO BIO Laboratories, Inc.).
1. Sebanyak 900 μL sputum (hasil preparasi di atas) ditambahkan pada
tabung Power Bead kemudian divorteks.
2. Selanjutnya 60 μL larutan C1 ditambahkan pada campuran di atas dan
digetarkan dengan vorteks pada kecepatan maksimum selama 10 Cakra
Kimia (Indonesian E-Journal of Applied Chemistry) ISSN 2302-7274
Volume 3, Nomor 2, Oktober 2015 59 menit.
3. Campuran ini disentrifugasi pada kecepatan 10.000 x g selama 1 menit
pada suhu ruang.
4. Supernatan yang diperoleh dipindahkan ke collection tube berukuran 2 ml,
kemudian ditambahkan larutan C2 sebanyak 250 L, digetarkan dengan
vorteks selama 5 detik lalu diinkubasi pada suhu 4°C selama 5 menit,
setelah itu disentrifugasi pada suhu ruang pada kecepatan 10.000 x g
selama 1 menit.
5. Supernatan hasil sentrifugasi di atas diambil sebanyak 600 L, kemudian
ditaruh dalam collection tube berukuran 2 ml dan ditambahkan larutan C3
sebanyak 200 L.
6. Campuran ini digetarkan dengan vorteks, diinkubasi pada suhu 4°C
selama 5 menit, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 10.000 x g selama
1 menit.
7. Sebanyak 750 L supernatan dipindahkan dalam collection tube berukuran
2ml lalu ditambahkan 1200 L larutan C4 dan digetarkan dengan vorteks
selama 5 detik.
8. Campuran ini diambil sebanyak 675 L dan dimasukkan ke Spin Filter dan
disentrifugasi pada kecepatan 10.000 x g selama 1 menit pada suhu ruang.

16
 9. Supernatan yang tersisa dimasukkan ke Spin Filter dan disentrifugasi pada
kecepatan 10.000 x g selama 1 menit pada suhu ruang.
10. Larutan hasil saringan dalam collection tube dibuang. Spin Filter (yang
sudah mengikat DNA) ditambahkan 500 L larutan C5 dan disentrifugasi
pada kecepatan 10.000 x g selama 1 menit, lalu larutan hasil saringan
dibuang.
11. Spin filter disentrifugasi lagi pada kecepatan 10.000 x g selama 1 menit.
12. Sebanyak 100 L larutan C6 ditambahkan ke pusat filter dalam Spin Filter
yang sudah diletakkan dalam tabung mikro 1,5 mL baru, kemudian
disentrifugasi pada kecepatan 10.000 x g selama 1 menit.
13. Hasil sentrifugasi merupakan larutan DNA hasil elusi dari Spin Filter dan
disimpan pada suhu -20oC atau langsung digunakan untuk tahapan
berikutnya.

 Amplifikasi Daerah Promoter inhA dengan PCR Hasil Isolasi DNA metagenomik
sputum dan DNA isolat M. tuberculosis diamplifikasi dengan teknik PCR
menggunakan alat thermalcycler (Sensoquest). Sepasang primer yang digunakan
untuk amplifikasi adalah primer yang dipilih berdasarkan analisis pustaka.
1. Proses PCR diawali dengan predenaturasi awal pada 95°C selama 5 menit
2. Dilanjutkan dengan 45 siklus amplifikasi (denaturasi selama 1 menit pada
94°C, annealing pada suhu yang dioptimasi sebelumnya, dan polimerisasi
selama 1 menit pada 72°C) dan polimerisasi akhir pada 72°C selama 5
menit.

17
 BAB V

PENUTUP

3.1 Kesimpulan

3.2 Saran

18
 DAFTAR PUSTAKA

Asris., 2010. Definisi Isolasi DNA dan Manfaat Isolasi DNA.http://asris07. Student.ipb.ac.id.

Diakses pada tanggal 15 januari 2020, pada pukul 23.00 WITA.

Kirsman, 2010.Isolasi DNA Buah. http://kirsman83.weebl..com. Diakses pada 15 januari

2020, pada pukul 23.00 WITA.

Rachmat, 2012. Isolasi DNA. http://rachmatyusuf.blogspot.com. Diakses pada tanggal 15

januari 2020, pada pukul 23.00 WITA.

Tohib, 2012. Macam Metode Isolasi DNA. http://www.tohib.web.id. Diakses pada 15 januari

2020, pada pukul 23.00 WITA.

Lubis, N.A. 2013. Laporan Praktikum Isolasi Dna Manusia (Epitelial Mulut dan Darah) dan
Teknik Pcr dan Isolasi Protein dari Darah, Elektroforesis Agarose dan Sds-Page. Website:
http://openwetware.org/images/8/8f/
Lap._Praktikum_isolasi_DNA,_Protein_dan_Elektroforesis.pdf. Diakses Senin, 15 Januari
2020 pukul 19.47 WIB.

19