LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

PCR
AMPLIFIKASI DNA BAKTERI
Gen 16S rRNA
(16S ribosomial Ribonucleic Acid)

Disusun oleh :
Intan Komalasari
P3.73.34.2.20.121
Dibimbing oleh dosen praktikum :
Agustiningsih, MBiomedSc.

KEMENTERIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA

POLITEKNIK KESEHATAN JAKARTA III
JURUSAN TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS
2020
I. Tujuan Praktikum
 Untuk mempelajari teknik PCR pada sampel hasil isolasi DNA Bakteri.
 Untuk mengamplifikasi sampel DNA bakteri E.colli dengan DNA target
gen 16s rRNA (16S ribosomial Ribonucleic Acid).

II. Metode pemeriksaan

PCR konvensional

III. Alat dan bahan

1. Alat
a. Mikropipet
b. Tips mikropipet
c. Rak microtube
d. Microtube 200 ul
e. Spin down
f. Thermal cycler
g. Bejana eletroforesa
h. Power supply
i. UV transiluminator
j. Laminar air flow, tanpa hepa filter/PCR hood
2. Bahan
a. Reagensia BiolineTM MyTaq HS mix
Komponen :
1) MyTaq HS Mix 2x
2) DNase-free water
3) Primer F (20 uM)
4) Primer R (20 uM)
b. DNA ekstraksi
c. Gel agarose 1%
d. TAE 1%
e. DNA bakteri E.colli yang sudah diekstraksi (template)
IV. Prinsip
PCR : Perbanyakan DNA spesifik dengan metode invitro dan
enzimatis, dilakukan dengan kondisi siklus, denaturasi yaitu memisahkan
 dua untai ganda menjadi tunggal, annealing yaitu penempelan primer
spesifik untuk memulai amplifikasi dan elongation yaitu pemanjangan
untai DNA spesifik dengan templatenya.
Elektroforesis menggunakan gel agarose : Molekul akan berpisah
atau migrasi berdasarkan atas ukurannya, dengan menggunakan medan
listrik yang dialirkan pada media gel agarose yang mengandung sampel
berupa DNA yang akan dipisahkan, pergerakan tersebut memanfaatkan
muatan listrik yang ada pada DNA. DNA yang bermuatan negatif akan
bergerak menuju kutub yang bermuatan positif, kecepatan gerak molekul
tergantung pada rasio muatan terhadap massanya, serta tergantung pula
pada bentuk molekulnya.

V. Prosedur Kerja
1. Tahap pembuatan master mix (untuk 3 reaksi yaitu reaksi sampel
DNA, kontrol negatif dan pippeting error) dilakukan pada
Laminar air flow tanpa hepa filter/PCR Hood di ruangan master
mix atau clean room.
a) Sebanyak 37,5 uL MyTaq HS Mix 2x dipipet dan dimasukkan
kedalam microtube 1.
b) Sebanyak 31,5 uL DNase -free water dipipet dan dimasukkan
kedalam microtube 1, kemudian dihomogenkan dengan cara
dipipet naik turun.
c) Sebanyak 1,5 uL primer F (20 uM) dipipet dan dimasukkan
kedalam microtube 1, kemudian dihomogenkan dengan cara
dipipet naik turun.
d) Sebanyak 1,5 uL primer R (20 uM) dipipet dan dimasukkan
kedalam microtube 1, kemudian dihomogenkan dengan cara
dipipet naik turun, kemudian di spindown.
e) Pada campuran diatas diambil masing-masing 24 uL dipipet dan
dimasukkan kedalam microtube baru yang sudah diberi identitas
dengan nama sp 1 (untuk sampel kelompok 1) dan neg 1 (untuk
untuk kontrol negatif kelompok 1). jadi total ada 2 microtube. Sisa
cairannya tidak digunakan hanya untuk pippeting error.
 f) Sebanyak 1 uL DNase free-water dipipet dan dimasukkan
kedalam microtube neg 1 sebagai kontrol negatif, kemudian
dispin down.
2. Tahap penambahan sampel DNA dilakukan di ruang
spesimen/ekstraksi.
a) Sebanyak 1 uL sampel DNA ekstraksi dipipet dan dimasukkan
kedalam microtube sp 1 sebagai sampel, kemudian di spindown
3. Tahap proses amplifikasi di ruang amplifikasi/ruang mesin.
a) Sebelum menggunakan alat thermal cycler, alat tersebut diatur
terlebih dahulu sesuai dengan kondisi pemeriksaan nya.
Suhu (oC) Waktu Siklus
Denaturasi awal 95 1 menit 1
Denaturasi 95 15 detik 30
Annealing 55 15 detik
Extension 72 10 detik

Tahap pengaturan alat thermal cycler :

1) Thermal cycler dipastikan sudah menyala.
2) Pada tampilan ini diklik files lalu diklik new diklik program
kemudian pada tampilan edit program name diketik nama
program jenis primer (optional) kemudian di klik enter.

3) Akan muncul tampilan seperti dibawah ini. Pada tampilan

header akan nama yang tadi sudah diinput, kemudian ada
 kolom isian suhu awal diisi 96 oC itu untuk heated lid sebagai
peningkatan suhu maksimal pada proses denaturasi. Dan
block temperature preheating diisi 25 oC sebagai penstabil
suhu diawal mulai proses.

4) Pilihan steps diklik. Kemudian akan muncul tampilan seperti

ini, dibawah ini sudah dimasukkan angka sesuai kondisi siklus
yang akan digunakan seperti yang sudah dipaparkan pada
tabel di poin a. Setelah dimasukkan semua pengaturan
kemudian diklik save. Kemudian akan muncul tampilan
seperti di awal.

Pada row ini diisi dengan

temperatur yang akan kita
gunakan.

Pada row ini diisi waktu

yang kita gunakan pada
setiap siklus.

Pada row ini adalah pilihan

kembali untuk mengatur akan
kembali ke siklus yang mana
proses setelah tahap elongation.

Kolom ini diisi untuk berapa

banyak siklus yang akan kita
gunakan untuk pemeriksaan.

b) Setelah dilakukan pengaturan kemudian sampel dimasukkan

kedalam well block dalam keadaan microtube tertutup, kemudian
alat ditutup.
c) Selanjutnya kembali ke monitor pada tampilan awal dipilih Run
kemudian diklik start lalu dipilih nama program yang telah kita
 program setelah itu diklik start now. proses amplifikasi 30 siklus
berlangsung kurang lebih 40 menit.

4. Tahap elektroforesis di ruang post amplifikasi.

a) Gel agarose 1% yang sudah dibuat diletakkan pada bejana
elektroforesis. Kemudian, TAE 1% di tuang kedalam bejana
sesuai batas.
b) Loading dye dipipet sebanyak 2 uL dan diletakkan diatas alas
parafilm.
c) Negatif kontrol setelah amplifikasi dipipet sebanyak 8 uL dan
dicampur dengan loading dye 5x diatas parafilm kemudian
dipipet naik turun.
d) Negatif kontrol dan loading dye 5x yang sudah dicampur
kemudian dimasukkan kedalam sumuran gel agarose secara
hati-hati.
e) Loading dye 5x dipipet sebanyak 2 uL dan diletakkan diatas alas
parafilm.
f) Sampel DNA amplifikasi dipipet sebanyak 8 uL dan dicampur
dengan loading dye diatas parafilm kemudian dipipet naik turun.
g) Sampel DNA amplifikasi dan loading dye yang sudah dicampur
dimasukkan kedalam sumur gel agarose berikutnya secara hati-
hati.
h) Ladder / marker GelPilot 1kb dimasukkan kedalam sumur gel
agarose berikutnya secara hati-hati.
i) Kabel katode warna hitam (bermuatan negatif) dan kabel anode
warna merah (bermuatan positif) dipasang pada alat
elektroforesis yang disambungkan pada power supply (tidak
boleh tertukar posisinya). kabel hitam dipasang pada bagian
sejajar dengan posisi sumur dan kabel merah dipasang di ujung
akhir gel.
j) Power supply dinyalakan. Kemudian proses ditunggu sampai
kurang lebih 40 menit.
 k) Pasca elektroforesis gel agarose dimasukkan ke dalam gel doc
pada alat UV transiluminator untuk dilakukan visualisasi.

VI. Hasil

1000 bp
700 bp
500 bp
400 bp

100 bp
Ladder 1 kb.

Sampel DNA
amplifikasi.

Kontrol negatif
 Pada sumur negatif kontrol tidak ada pendaran pada gel agarose
dibandingkan dengan ladder.
 Pada sumur sampel ada pendaran pada gel agarose pada ukuran 1000
bp.
 Terdapat pendaran pada negatif kontrol maupun sampel pada ukuran
dibawah 100 bp.

VII. Diskusi dan Pembahasan

 Target dari PCR adalah amplifikasi DNA hasil ektraksi bakteri
Eschericia coli Gen 16S rRNA (16S ribosomial Ribonucleic Acid).
 Berdasarkan dari primer yang di gunakan target nya adalah pada
ukuran 1000 bp.
 Gen 16S rRNA adalah gen yang bersifat lestari (conserved) dan
dijumpai pada setiap organisme. Struktur yang lestari ini
menyebabkan gen 16S rRNA dapat digunakan dalam PCR dan
analisis sekuensing.
 Marker yang digunakan adalah gelpilot ukuran 1 kb atau 1000 bp,
pada hasil visualisasi elektroforesis, ukuran 1000 bp terlihat paling
terang.
 Hasil dari amplifikasi yang dinilai pada elektroforesis menunjukkan
bahwa ukuran DNA target 1000 bp artinya sesuai dengan apa yang
kita inginkan.
 Pada negatif kontrol harus tidak ada atau tidak terjadi amplifikasi. Jika
hasilnya positif artinya pekerjaan kita kurang baik. Dan harus diulang
dari langkah awal.
 Dari hasil visualisasi elektroforesis terlihat pendaran dibawah ukuran
100 bp pada negatif kontrol dan juga sampel, hal itu dikarenakan
adanya amplifikasi primer dimer tetapi ukurannya pendek.
 Primer dimer merupakan dua primer yang hibridisasi pada ujung 3’-
nya. Kemudian ikut teramplifikasi dan terbaca saat visualisasi
elektroforesis.
  Keberhasilan suatu proses PCR sangat tergantung dari primer yang
digunakan. Di dalam proses PCR, primer berfungsi sebagai pembatas
fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan sekaligus
menyediakan gugus hidroksi(-OH) pada ujung 3’ yang diperlukan
untuk proses eksistensi DNA.

VIII. Kesimpulan
 Teknik PCR yang dilakukan mulai dari master mix, penambahan
negatif kontrol, penambahan sampel, amplifikasi dan elektroforesis
harus dilakukan dengan hati-hati dan mengikuti prosedur 1 arah agar
tidak terjadi kontaminasi yang mengganggu amplifikasi dan penilaian
hasil.
 Pada sampel sp 1 terdapat amplifikasi DNA bakteri E.colli dengan
target spesifik gen 16s rRNA (16S ribosomial Ribonucleic Acid).

IX. Daftar Pustaka

Handoyo, d dan rudiretna, a. Prinsip umum dan pelaksanaan polymerase
chain reaction (pcr), Surabaya, 2001.
Rinanda, T. Analisis sekuensing 16s rrna di bidang mikrobiologi, jurnal
penelitian.
Yuryev, A. PCR primer design. New Jersey, 2007.
MyTaq™ HS Mix insert kit.