LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

REVERSE TRANSCRIPTION (RT)

Disusun oleh :
Intan Komalasari
P3.73.34.2.20.121
Dibimbing oleh dosen praktikum :
Agustiningsih, MBiomedSc.

KEMENTERIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA

POLITEKNIK KESEHATAN JAKARTA III
JURUSAN TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS
2020
I. Tujuan Praktikum
Melakukan pembuatan sintesis cDNA dari Isolat Dengue dengan
metode Reverse Transcription (RT).
II. Alat dan bahan
Alat :
a. Mikropipet
b. Tip (putih dan kuning)
c. Tabung mikro 200 ul
d. Rak dingin
e. Laminar air flow
f. Thermal cycler
g. Spin down
h. Tissue
i. Wadah limbah
Bahan :
a. Reagen SensiFastTM cDNA Synthesis Kit
Berisi :
1. 5X TransAmp Buffer
2. Reverse Trancriptase
b. Isolat dengue ( RNA template)
c. DNase/RNase free water
d. Alkohol 70%
III. Prinsip
Primer Oligo (dT) mengikat ekor poli (A) yang ditemukan pada
kebanyakan mRNA. Random hexamer mengikat urutan di seluruh RNA
target, menghasilkan transkripsi balik dari RNA poladenilasi dan non-
poladenilasi, yang kemudian di sintesis menjadi DNA dalam bentuk
complementary oleh enzim reverse transcriptase .
IV. Cara kerja
A. Tahap pembuatan mastermix (untuk 1 reaksi) di ruang clean
room di dalam laminar air flow tanpa hepa filter atau di dalam
PCR Hood.
1. Area kerja (di dalam laminar air flow) serta mikropipet dibersihkan
dengan tissue menggunakan alkohol 70%.
 2. Tabung mikro yang digunakan disiapkan dan ditulis identitas
dengan nama A1 (kelompok A1) kemudian diletakkan di atas rak
dingin.
3. Sebanyak 10 ul DNase/RNase-free water dipipet dan dimasukkan
ke dalam tabung mikro hingga dasar.
3. Sebanyak 4 ul 5X TransAmp Buffer dipipet dan dimasukkan
kedalam tabung mikro yang sudah diisi DNase/RNase-free water
hingga dasar kemudian dihomogenisasi dengan menggunakan
pipet dengan cara naik-turun.
4. Sebanyak 1 ul reverse transcriptase dipipet dan dimasukkan
kedalam tabung mikro hingga dasar yang berisi 5X TransAmp
Buffer dan DNase/RNase-free water, kemudian dihomogenisasi
menggunakan pipet dengan cara naik-turun. Kemudian larutan di
spindown selama kurang lebih 3 detik.
B. Tahap penambahan RNA template di ruangan
spesimen/ekstraksi.
Sebanyak 1 ul sampel RNA template (isolat virus dengue) di
masukkan ke dalam mastermix kemudian dihomogenkan dengan
menggunakan pipet dengan cara naik-turun.
C. Tahap proses Reverse transcription di ruang mesin
1. Sebelum menggunakan alat thermal cycler, alat di program
terlebih dahulu sesuai kondisi pemeriksaannya, berdasarkan
instruksi dari kit insert. Seperti yang tertera di bawah ini :

Suhu (oC) Waktu (Menit) Siklus keterangan

25,0 10:00 Penempelan primer
42,0 15:00 Reverse transcription
Untuk RNA yang sangat
48,0 15:00 1
terstruktur
85,0 5:00 Inaktivasi enzim
4,0 20:00 Opsi : didinginkan diatas es
Tahap pengaturan thermal cycler :
a) Thermal cycler dipastikan sudah menyala.
b) Pada tampilan ini diklik files lalu diklik new diklik program
kemudian pada tampilan edit program name diketik nama
program RNA DENGUE (optional) kemudian di klik enter.

c) Pilihan steps diklik. Kemudian akan muncul tampilan seperti

ini, dibawah ini sudah dimasukkan angka sesuai kondisi siklus
yang akan digunakan seperti yang sudah dipaparkan pada
tabel di poin 1. Setelah dimasukkan semua pengaturan
kemudian diklik save. Kemudian akan muncul tampilan
seperti di awal.
 2. Setelah dilakukan pengaturan kemudian sampel dimasukkan
kedalam well block dalam keadaan tabung mikro tertutup,
kemudian alat ditutup.

3. Selanjutnya kembali ke monitor pada tampilan awal dipilih Run

kemudian diklik start lalu dipilih nama program yang telah kita
program setelah itu diklik start now. Total waktu proses reverse
transcription pada alat thermal cycler adalah 1 jam menit.

V. Hasil
RNA berubah menjadi sintesis cDNA. kemudian sampel cDNA disimpan
di dalam refrigerator pada suhu 4oC selama satu pekan untuk dilakukan
proses selanjutnya .

VI. Kesimpulan
Telah dilakukan pembuatan sintesis cDNA dari Isolat Dengue dengan
metode Reverse Transcription (RT).

VII. Pembahasan
Berikut poin-poin pembahasan dari praktikum Reverse Transcription :
1. Reverse Transcription adalah sintesis molekul DNA yang dimediasi
oleh enzim dari RNA template. DNA yang dihasilkan, yang dikenal
 sebagai cDNA, dapat digunakan sebagai template untuk amplifikasi
PCR.
2. Kebutuhan RNA berkualitas tinggi adalah kebutuhan pertama dan
terpenting.
3. cDNA yang ada pada akhir reaksi sintesis secara langsung
mencerminkan kompleksitas RNA pada awal reaksi sintesis.
4. RNA template merupakan RNA yang dimurnikan dari berbagai jenis
sampel biologis. RNA secara inheren tidak stabil, sehingga tindakan
pencegahan yang ketat harus dilakukan untuk mencegah degradasi
selama proses ekstraksi dan langkah-langkah penanganan
selanjutnya. Kualitas dan kemurnian template RNA sangat penting
untuk keberhasilan RT-PCR
5. Reverse transcriptase (RT), juga dikenal sebagai DNA polimerase
yang bergantung pada RNA, adalah enzim polimerase DNA yang
mentranskripsi RNA untai tunggal menjadi DNA hasil transkripsi balik
dari RNA yang sesuai.
6. 5x TransAm Buffer berisi primer Oligo dT dan random hexamer.
7. Oligo (dT) merupakan primer yang secara selektif menempel pada
ekor poli (A) yang ditemukan pada sebagian besar molekul
messenger RNA (mRNA). Hanya RNA poladenilasi yang akan
ditranskripsikan terbalik dalam reaksi berlapis oligo (dT).
8. Random hexamer adalah campuran primer heksanukleotida acak
yang menempel ke sekuens di seluruh RNA target, menghasilkan
transkripsi balik dari RNA poladenilasi dan nonpolyadenilasi.
9. Empat nukleotida dNTP - dATP, dTTP, dCTP, dan dGTP - adalah
blok bangunan untai cDNA yang disintesis dengan Reverse
transcription.
10. Keuntungan utama RT-PCR dua langkah adalah bahwa primer
random hexamer atau oligo dT digunakan dalam reaksi RT dalam
tabung terpisah. Hal ini memungkinkan kemampuan untuk mengubah
semua pesan dalam sampel RNA menjadi cDNA, yang
memungkinkan pengarsipan sampel dan pengujian gen lain di masa
mendatang.
VIII. Daftar Pustaka
 Farrel, Robert E., RNA Methodologies, fourth edition, USA, 2010.
Wacker, Michael J. dan Godard, Michael P., Analysis of One-Step
and Two-Step Real-Time RT-PCR Using SuperScript III, Jurnal
penelitian PMID: 16461951, 2005.
Best, D.H dan Roberts, K.A., Pathobiology of Human Disease, USA,
2014.
SensiFAST™ cDNA Synthesis Kit, Meridian bioscience.