A Novel Synthetic Receptor-

Based Immunoassay for

Influenza Vaccine
Quantification

By

Hashem AM, Gravel C, Farnsworth A, Zou W, Lemieux M,

et al.

PLoS ONE Biochemistry, Genetics and Molecular Biology

Biochemistry, Genetics and Molecular Biology (miscellaneous)
(2013)

Dibawakan oleh :

Hastian Nugrahanto

S2019010701 – QA LAT
 Latar Belakang Pemilihan Jurnal

Pengujian potensi vaksin

substitusi

Produksi Vaksin In Vivo Method In Vitro Method

Masalah : Manfaat :

- Waktu pengujian relatif lama - Mengurangi Penggunaan hewan

- Membutuhkan fasilitas uji mahal - Menurunkan biaya

2
 Abstrak

● Vaksinasi adalah metode paling efektif untuk mencegah penyakit

influenza.

● Perhitungan antigen vaksin influenza (Hemmagglutinin) merupakan

parameter kritis sebelum vaksin tersebut digunakan.
3
● Single Radial Immunodiffusion (SRID) merupakan metode umum yang
digunakan untuk menghitung jumlah protein HA pada vaksin. Metode ini
memiliki kelemahan yaitu sensitifitas yang rendah, rentang keberhasilan
uji kecil, dan membutuhkan tambahan referensi antiserum tiap tahun.

● Dikembangkan metode pengukuran protein Hemmaglutinin (HA)

berdasarkan ikatan asam sialic dari vaksin influenza dengan reseptor.

3
● Disintesis reseptor virus influenza dari manusia (asam N-asetilneuramin-2,6-laktosa)
dan unggas (N-asetilneuramin-2,3-laktosa) dengan prekursor azidopropyl lactoside dan
enzim sialyltransferase. dua reseptor ini terkonjugasi pada albumin serum tikus.
● Reseptor sintetis a-2,6-reseptor dan a-2,3-reseptor secara selektif dapat terikat pada
vaksin dan virus influenza yang digunakan.
● Vaksin dilakukan perlakuan pada suhu tinggi dan pH rendah untuk mengidentifikasi
adanya denaturasi protein dan mengetahui konformasi pengikatan optimal antara vaksin
4
dengan reseptor berdasarkan metode reseptor-ELISA (R-ELISA).
● Pengujian berbasis reseptor-ELISA (R-ELISA) ini menunjukkan kinerja lebih baik
daripada Single Radial Immunodiffusion (SRID) dalam menganalisis beberapa vaksin
influenza dari segi spesifisitas, sensitivitas, reproducibility, presisi, waktu penyelesaian
dan tingkat keberhasilan uji yang lebih tinggi.

4
 Pendahuluan

●
Influenza merupakan penyakit pernafasan yang menular.

● Antigen virus influenza yang dapat beradaptasi pada manusia

adalah strain H1,H2,dan H3. Sedangkan pada unggas adalah strain
H5, H7, dan H9.

● Hemmaglutinin (HA) dan Neuraminidase (NA) merupakan protein

yang berperan penting dalam siklus hidup virus.
5
● Protein HA memiliki fungsi untuk penempelan ke sel inang
Struktur virus influenza sedangkan NA memiliki peran dalam pelepasan virus dari sel yang
terinfeksi.

SRID merupakan metode pengukuran vaksin (HA) berdasarkan difusi antigen

terhadap media yang telah dicampur antibodi atau strain virus yang digunakan.

5
SRID

Bucher et.al (1976)
HPLC bisa mengisolasi subunit
HA1 dan HA2 yang berisi HA0
dan terbukti dapat mengidentifikasi
komponen vaksin
sesuai ukuran protein
Tujuan Penelitian
Memodifikasi kit ELISA dan
Membuktikan bahwa metode uji
berbasis reseptor-ELISA
dapat dijadikan alternatif uji
pengukuran protein HA
dalam vaksin
Phelan MA, et.al (1983)
HPLC Fasa Terbalik
(RP-HPLC) dapat digunakan
untuk mendeteksi
telur yang diinaktivasi
menggunakan formaldehid
atau turunan selnya
serta subunit vaksin.
Legastelois et al. (2011)
Sandwich ELISA dapat
digunakan dalam
pengukuran HA
Garcia-Canas, et.al (2007)
Menggabungkan size exclusion
dan reversed-phase
chromatography
memberikan hasil yang lebih
sensitif dan selektif untuk
penghitungan Luna LG, et.al (2008)
subunit HA1. William TL, et.al (2008)
Getie Kebtie M, et.al ( 2009)
Creskey MC, et. Al (2010)
6 Mass Spectrometry digunakan
untuk mengkarakterisasi
vaksin influenza
Dibutuhkan alat
yang mahal
dan kompetensi
yang baik
6
 Metode penelitian

1. Sintesis Reseptor

2. ELISA
7

3. SRID

4. Perlakuan vaksin terhadap suhu dan pH

7
Alur Umum Sintesis Reseptor

Azidopropyl lactoside

Azidopropyl sialyllactoside

8 Aminopropyl sialyllactoside

Monoethyl squarate derivative

MSA-Receptor

8
1. Sintesis Reseptor

a. Sintesis azidopropyl sialyllactoside

- Avian Reseptor
pH 7, 37°C, 5 hour

+ 10 α-2,3-sialyltransferase
200 mg α-N-acetylneuraminic acid (NeuAc)-
Azidopropyl lactoside Campylobacter jejuni 2-3-Gal-β-1,4-Glc-β-O-propylazide
In 50 mM buffer tris (pH 7, 20 mL) Cst-I a-2,3-sialyltransferase
CMP-Neu5Ac(50 mM) and MgCl2
(20 mM)
9

- Human Reseptor
37°C, 70 min
+ 5 α-2,6-sialyltransferase
Purified with Biogel P-2
Column with water as eluent
Photobacterium sp.
170 mg α-N-acetylneuraminic acid (NeuAc)-
Azidopropyl lactoside α-2,6-sialyltransferase
In 50 mM Mes pH 6
2-6-Gal-β-1,4-Glc- β-O-propylazide
and CMP-Neu5Ac(50 mM)

9
 b. Reduksi Azida

N-acetylneuraminic acid (NeuAc)-a-2-3-Galb-1,4-Glc-b-O- N-acetylneuraminic acid (NeuAc)-a-2-3-Galb-

propylazide Stirr, H2, 20 min 1,4-Glc-b-O-propylamin

or + or

10
N-acetylneuraminic acid (NeuAc)-a-2-6-Galb-1,4-Glc-b-O- N-acetylneuraminic acid (NeuAc)-a-2-6-Galb-
propylazide 1,4-Glc-b-O-propylamin
30 mg 10 % Pd-C
azidopropyl sialyllactoside (50% water, 10 mg) Aminopropyl sialyllactoside
in methanol 5 mL

10
 c. Aktivasi reseptor

N-acetylneuraminic acid (NeuAc)-a-2-6-Galb-1,4-Glc-b-O-

propylamin
or + a-2,3-receptor
monoethylsquarate derivative
N-acetylneuraminic acid (NeuAc)-a-2-3-Galb-1,4-Glc-b-O-
propylamin

20 mg 40μL
aminopropyl sialyllactoside diethyl squarate
in phosphate buffered pH 7
saline 1,6 mL
(PBS:MeOH,5:3)
11 a-2,6-receptor
monoethylsquarate derivative
d. Konjugasi ke Mouse Serum Albumin

a-2,3-receptor
monoethylsquarate derivative
Room temperature, 30 hour
or + MSA α-2,3-sialyllactoside-MSA
Purified with
Column 0,5 Biogel-A
( PBS )
30 mg
a-2,6-receptor dilarutkan dalam 0,1 M
monoethylsquarate derivative Na2HPO4 pH 9
α-2,6-sialyllactoside-MSA
15 mg 11
2. ELISA
a. Umum

α-2,3-sialyllactoside-MSA
Overnight, 4°C
+ or
PBS-T 0,05% (v/v), Skim milk 5%
α-2,6-sialyllactoside-MSA

96-well 100 μL/well

ELISA plate coated by receptor
ELISA plate Receptor (4 μg/mL)
in 0,05 Buffer Carbonate (pH 9,6)
12 3x
PBS-T buffer

37°C, 1 hour 37°C, 1 hour

30 min
+ +
0,16 M H2SO4 6x PBS-T buffer 6x PBS-T buffer

HA Protein / Virus 100 μL

Λ = 450 nm TMB (Tetramethylbenzidine)
coloring agent Vaccine
(10 – 37 μg/mL )

12
 b. Spesifitas ikatan antara reseptor manusia dan reseptor unggas

37°C, 1 hour
37°C, 1 hour
+ +
3x PBS-T buffer
6x PBS-T buffer
6x PBS-T buffer

100 μL
HA Protein Recombinant TMB
Vaccine (10 μg/mL) (Tetramethylbenzidine)
ELISA plate coated by receptor coloring agent
1. H1 (influenza A/New Caledonia/20/1999) 1. Uni-1
2. H5 (Influenza A/Vietnam/1203/2004)
3. H7 (Influenza A/Netherlands/219/03) 13 2. Anti H5
3. Anti H1
4. HB (influenza B/Malaysia/2506/2004 )

0,16 M H2SO4 30 min

c. Spesifitas dan Presisi

37°C, 1 hour 37°C, 1

+ + hour 30 min
3x PBS-T
buffer 6x PBS-T
buffer 6x PBS-T 0,16 M H2SO4
buffer
HA Protein
ELISA plate coated by receptor 100 μL TMB
Recombinant (Tetramethylbenzidine) Λ = 450 nm
Vaccine (A) Rabbit anti-HA from Influenza coloring agent
(10 μg/mL) A/California/7/2009 (H1N1),
(B) Rabbit anti-HA from Influenza
1. A/California/7/2009 (H1N1), A/Perth/16/2009 (H3N2)

2. A/Victoria/210/2009 (H3N2)
3. B/Brisbane/60/2008(Victoria-like))
4. trivalent
13
(C) Rabbit anti-HA from Influenza
B/Brisbane/60/2008
Untuk uji presisi, konsentrasi Antigen dibuat 80%, 100%, dan 120%
 3. Single Radial
Immunodiffusion

Mixtures

+
1
To petri dish

Antibodi/ HA Protein/ Virus

1% Agarose SRID Media

24 hour
14
Detergent 1%
Room temperature ,20 min
(1:2000)
2 + detergent +
Comassie Blue
Vaccine Zwittergent
10 - 37 μg/mL 3-14
Vaccine
1%

Diameter
Measurement

14
4. Perlakuan vaksin terhadap suhu dan pH

- Suhu

4, 50, & 100 °C

2. ELISA & 3. SRID
1 hour

100 μL
Vaccine 15

- pH

4, 4.5, 5, 5.5, 6, 7.2

+ 0,1 M 2. ELISA & 3. SRID
Acetate Buffer

100 μL
Vaccine

15
 Hasil Penelitian

- Sintesis reseptor
●Reseptor dikarakterisasi menggunakan
matrix-assisted laser desorption/ionization
mass spectrometry. (MALDI-MS)

●Terdapat 18 molekul reseptor yang menempel

pada MSA untuk reseptor unggas.

●Terdapat 15 molekul reseptor yang menempel

pada MSA untuk reseptor manusia.
16 ● Reseptor berhasil disintesis.
- Spesifitas ikatan reseptor antara manusia dan unggas
● Pada reseptor manusia, protein rekombinan H1
memberikan serapan yang tinggi.

Pada reseptor unggas, protein rekombinan

●

H5 & H7 memberikan serapan yang tinggi.

● Virus influenza B dapat menempel pada kedua

reseptor sehingga muncul serapan

● Metode ini menunjukkan spesifitas yang baik

terhadap antigen.

16
- Perlakuan suhu dan pH

● Semakin tinggi suhu yang

digunakan semakin kecil nilai HA
yang didapatkan.

17

● Semakin rendah pH yang

digunakan semakin kecil nilai HA
yang didapatkan.

Metode berbasis reseptor

ini dapat mengidentifikasi
konformasi HA yang telah
terdenaturasi.

17
- Uji spesifitas dan presisi reseptor terhadap vaksin manusia

●Sinyal absorbansi muncul

ketika antigen/vaksin yang
digunakan sesuai dengan
HA virus.

18

●Besar masing-masing deviasi

pengukuran vaksin :

Vaksin A : 0.7 % - 20.8 %

Vaksin B : 1.5 % - 14,3 %
Vaksin C : 0.5% - 17.9 %

18
Perbandingan kinerja SRID dan R-ELISA

● Jumlah vaksin yang diuji

` menggunakan R-ELISA lebih mendekati
hasil konsentrasi standar.

● Koefisien variasi menunjukan

bahwa R-ELISA memiilki kinerja
lebih baik daripada SRID dalam
menentukan jumlah vaksin monovalent.

20
● Konsentrasi vaksin hasil pengujian
dengan R-ELISA lebih mendekati hasil
konsentrasi vaksin yang sebenarnya.

20
 Kesimpulan

● Reseptor berhasil disintesis dan kit ELISA berhasil dimodifikasi.

21
● Metode pengukuran vaksin influenza (HA) berbasis reseptor-
ELISA dapat menjadi metode alternatif selain SRID.

21
 22

Ada Pertanyaan ?

22
 Evaluasi KS
bit.ly/evaluasiks

23
Join quizziz
https://quizizz.com/join
● Format user name : NIS <spasi> Nama

23
24

24