Aplikasi Immunoassay

DARA ANDINI PUTRI

1706096733
IMMUNOASSAY
MI’RAJUNNISA
DARA ANDINI PUTRI
Metode bionalitik dimana
kuantitasi analit IMMUNOASSAY
bergantung pada reaksi
antigen dan antibodi

Berdasarkan pengikatan yang

kompetitif antara analit
berlabel dengan sampel analisis
yang tidak berlabel pada
antibodi (yang jumlahnya
terbatas)
 Diagnosis penyakit

FUNGSI IMMUNOASSAY Pemantauan obat terapeutik

Studi farmakokinetika

Bioekivalensi klinis untuk penemuan obat

 Biaya instrumen, alat,
KEUNTUNGAN
atau pereaksi relatif
POTENSIAL
rendah
 Immunoassay

Kompetitif Non-Kompetitif

Dilakukan dalam format

Diperlukan 2 antibodi: antibodi pertama
penangkapan antigen atau
akan berikatan dengan antigen, dan
penangkapan antibodi,
antibodi yang kedua akan diberi
tergantung apakah fase padat
labelantibodi-antigen-antibodi berlabel
dilapisi dengan antibodi atau
antigen (analit) dan hanya
diperlukan satu anti bodi saja
Dalam format antigen-capture (gambar A) terjadi
reaksi persaingan antara analit (dalam sampel)
dan analit yang telah dilabeli untuk berikatan
Aktivitas label pada fasa
dengan sejumlah antibodi anti-analit yang padat diukur
dilapisi pada fasa padat
Non kompetitif
Gambar 2. sampel analisis mengikat
antibodi yang tidak bergerak, setelah dicuci
fasa padat (mengandung analit dan antibodi
yang telah terbentuk) ditambahkan antibodi
ke2 yang
berlabeldiinkubasipencuciandilakuka
n pengukuran terhadap aktivitas label yang
terikat pada fasa padat
 Sinyal yang diukur berkorelasi terbalik dengan konsentrasi
analit dalam sampel=semakin rendah konsentrasisemakin
tinggi signalnya
REAGEN YANG DIPERLUKAN DALAM IMMUNOASSAY

ANTIBODY

REAGEN
LABEL PENGHASIL MATRIKS
SINYAL PEMISAHAN
 REAGEN YANG DIPERLUKAN DALAM
PENGEMBANGAN IMMUNOASSAY Antibodi yang hanya bisa mengikat satu epitop saja

Monoklonal
antibodi
poliklonal

Protein yang disekresi oleh sel

plasma limfosit b akibat stimulasi
molekul asing (antigen) pada
reseptor antigen limfosit b
 tikus disuntikkan antigen

sel2 dari limpa mencit (sel limfosit B) diambil dan dikembangbiakkan dengan sel
myeloma=hibridoma

sel hibridoma memproduksi antibodi secara terus menerus

dilakukan pemurnian (bisa dengan filtrasi, ultrasentrifugasi, dan kromatografi afinitas)

antibodi yang dihasilkan diuji, apakah ada antibodi yang diinginkan atau tidak

antibodi yang berhasil diambil

 REAGEN YANG DIPERLUKAN DALAM
IMMUNOASSAY LABEL PENGHASIL
SINYAL
Senyawa yang dikonjugasi pada antigen atau antibodi untuk dapat mem-visualisasi reaksi Ag- Ab

Sinyal yang digunakan sebagai label dalam immunoassay meliputi atom radioaktif (kebanyakan I, H,
dan C)

Kekurangan: brbahaya bagi kesehatan, perhatian khusus untuk penangan reagen, perlu pelatihan
staf, dan instrumentasi mahal untuk menghitung radioaktivitas

Karena berbahaya bagi tubuh digunakan label non-radioaktif:

Enzim, probe fluresen, zat chemiluminescent, logam, dan logam khelat

Paling sering digunakan: Enzim

Kenapa? Karena dalam immunoassay enzim bisa menguatkan sinyal, berpotensi untuk
meningkatkan sensitivitas (untuk dianalisis) immunoassay.
Syarat label:
Memiliki aktivitas spesifik
Mudah dideteksi
Tidak berbahaya
Senyawa yang digunakan sebagai label,
Enzim: Horse radish peroxidase (HRP), Alkaline
phosphatase
Senyawa berflouresensi; fluoresein, umbeliferon,
tetrametil rodhamin
Senyawa luminesence; luciferin
Partikel: Tanned erythrocyte, colloidal, microsphere, gold,
silver
vesikel: liposom
 REAGEN YANG DIPERLUKAN DALAM
PENGEMBANGAN IMMUNOASSAY
Digunakan untuk memudahkan proses pemisahan dalam percobaan yang
MATRIKS heterogen

Arang. Polietilena glikol, antibodi kedua, mikrobaadikel, dan lempeng

mikrosel (yang paling sering digunakan)

Pada immunoassay setiap sumur pada plate berfungsi sebagai tabung reaksi yang terpisah.
Permukaan dasar sumur pada plat dilapisi oleh salah satu komponen reaksi (analit atau antibodi)terbentuk
kompleks imun pada permukaan sumur.
Penggunaan plat memudahkan langkah pencucian, dan untuk mereaksikan (menggunakan pipet) .
METODE
IMMUNOASSAY
YANG Radioimmunoassay

DIGUNAKAN
PADA ANALISIS Enzim immunoassay

FARMASI
Fluoroimmunoassay
RADIO IMMUNOASSAY

Radioimmunoassay (RIA) adalah suatu teknik analisis berdasarkan reaksi kompetisi antara
antigen bertanda(berlabel) radioaktif yang biasa disebut radioligan, dengan antigen tidak
berlabel untuk memperebutkan antibodi yang jumlahnya terbatas.

Prinsip dasar metode Radioimmunoassay (RIA): Didasarkan pada reaksi antara antibody
(dalam konsentrasi terbatas) dengan antigen. Digunakan untuk menemukan antigen tunggal/
antibodi dalam cairan biologis tunggal dan tehnik pemeriksaan untuk menentukan antibodi
atau antigen denagn reagen yang bertanda zat radioaktif.
 Penggunaan teknik Radioimmunoassay memiliki beberapa keuntungan seperti:
1. spesifik, Teknik RIA sangat spesifik karena didasarkan pada sifat imunologis, dimana terjadinya
ikatan antibodi-antigen hanya untuk antigen tertentu saja.
2. peka, karena menggunakan label yang dapat dideteksi dengan peralatan yang mempunyai
kepekaan yang tinggi, sehingga teknik ini sangat baik untuk menganalisis zat atau senyawa-
senyawa yang kadarnya sangat rendah dan berada dalam cairan biologis seperti serum darah.
3. mempunyai ketelitian yang cukup tinggi dan pengerjaannya sederhana.
 Table 2. Radlolmmunoassay Protocol for Drugs of
Abuse (Cleeland et al, 1976)
Into 10 X 75 or 12 X 75 mm glass tubes:

• Masukkan larutan standar obat dan obat yang telah diberi

1 label

• Masukkan antibody
2

• Inkubasi pada suhu ruang

3
 • Pencucian
4

• Lakukan pengukuran radioaktivitas yang terkait dengan obat

5 yang telah diberi label dengan a gamma scintillation counter
 ENZIM IMMUNOASSAY
Penggunaan enzim immunoassay berdasarkan penggunaan enzim sebagai label immunoassay

Syarat Enzim:
Memiliki aktivitas yang tinggi Enzim yang digunakan:
Stabil pada kondisi reaksi Alkalinephosphat (ALP), B-
Mudah dikonjugasi ke molekul lain galaktosidase, Horseradish Peroxidase
untuk reaksi lanjutan atau (HRP), Glucose Oxidase(GOD)
penyimpanan
Tersedia dalam keadaan murni
Harga terjangkau
Tidak terdapat didalam campuran
sampel biologi yang akan diuji
 TAHAPAN EIA (ENZIM IMMUNOASSAY)
Antibodi yang spesifik dilekatkan pada suatu permukaan fase
padat/matriks

Masukkan serum yang mengandung antigen

Inkubasi pada suhu ruang

Cuci (pencucian pertama) dan masukkan antibodi yang spesifik

terhadap antigen tertentu yang berlabel enzim (konjugat)

Cuci (pencucian ke2)masukkan substratbaca hasilnya

menggunakan spektrofotometri uv-vis
Enzim Immunoassay memiliki beberapa kelemahan, seperti:
1. Sensitivitas EIA, walaupun EIA cukup sensitif untuk pengukuran beberapa zat secara klinis, namun tidak sebanding
dengan sensitivitas RIA.
2. Diperlukan keahlian dalam melakukan prosedur pelabelan
3. EIA lebih rentan terhadap gangguan dari faktor non spesifik dibandingkan metode immunoassay lainnya.
 FLUOROIMMUNOASSAY
Fluoroimmunoassay hampir sama dengan RIA
namun yang membedakan adalah penggunaan
fluophore sebagai label (bukan radioisotop), FIA
dapat dikategorikan menjadi tes heterogen dan
homogen, tergantung pada apakah diperlukan tahap
pemisahan atau tidak, salah satu uji heterogen atau Sama dengan semua immunoassay lainnya,
homogen dapat dilakukan dalam format kompetitif immunoassay fluoresensi melibatkan antigen (Ag)
atau tidak kompetitif. dan antibodi (Ab). Label yang dilekatkan pada salah
satu ini memungkinkan reaksi terdeteksi:
Ag + Ab  Ag/Ab
Analisis yang dapat diukur dapat berupa antigen
atau antibodi, dan label fluoresen dapat dilekatkan
pada salah satu atau kedua reaktan.
 Metode FIA menawarkan kesensitivitasan untuk
konsentrasi yang berkisar antara 0,01 ng/mL hingga 2
ng/mL.
Metode FIA kompetitif heterogen saat ini digunakan
untuk analisis berbagai senyawa farmasi dalam
cairan biologis seperti aminoglikosida, morfin 3-
glukuronida, metabolit heroin, benzoglycogonine
dalam urin, dan bahan perusak endokrin(estrone,
estradiol, dan etinilestradiol) dalam matriks berair
sintetis yang komplek.

Syarat senyawa fluoresen sebagai label:

Memiliki intensitas fluoresensi yang tinggi
Mudah direaksikan dengan dengan molekul
lain
Harga terjangkau
fluoresein, umbeliferon, tetrametil
rodhamin
 Sampel antigen bereaksi dengan antibody yang
telah dilabeli fluophore, dan kemudian sinar laser
ditembakkan ke plate, cahaya hanya mengeksitasi Pada FIA digunakan Fluorimeter, instrumen ini hanya
antibodi -fluoresen, dan cahaya tidak mengukur fraksi antigen berlabel fluoresen yang
berhubungan dengan fluoresen bebas dalam terikat pada antibody.
larutan (tidak berikatan dengan antibodi). Cahaya
yang dipancarkan dideteksi oleh fotolistrik.
 senyawa farmasi yang sudah dianalisis
menggunakan flurescent immunoassay (FIA)
Daftar referensi
Cleeland L, et al. 1976. Detection of Drugs of Abuse by Radioimmunoassay: A Summary of
Published Data and Some New Information. Clinical Chemistry Journal. Vol 22. No.6.
Darwish I A. 2006. Immunoassay Methodes and Their Application in Pharmaceutical Analysis:
Basic Methodology and Recent Advances.
Measurement of Serum
Digitoxin in Patients by RIA
Using Specific Antiserum
IKEDA, Y., FUJII, M., YAMAZAKI, M., FUJII., Y. (2001). CLINICA
CHIMICA ACTA, 314, 245 -247.
DOI: HTTPS://DOI.ORG/10.1016/S0009 -8981(01)00635 -0
Latar Belakang
Digitoksin → pengobatan gagal jantung
kongestif & fibrillasi atrium
Kadar digitoksin dalam cairan biologis bisa
diukur dengan immunoassay
Digunakan antiserum anti-digitoksin
komersial (antiserum B)
Mau membandingkan hasil pengukuran
digitoksin serum menggunakan antiserum A
yg diperoleh dari proses immunisasi,
dibandingkan dengan antiserum B
Pemerolehan Antiserum A
Persiapan Digitoksin
Konjugasi di posisi
konjugasi hapten- mengalami reaksi
C3’ dan C3”
protein pembawa oksidasi periodate

Antiserum A Immunisasi ke Digitoksin 3’-

diperoleh kelinci hemisuksinat-BSA
Preparasi Antiserum A dan B

Diencerkan dengan Antiserum A (1600 x)

Masing-masing
buffer fosfat pH 7.4
antiserum A & B saline Antiserum B (5600 x)
 0-235 ng digitoksin
non label dlm 0.1
ml buffer assay+
antiserum A/B
Kurva Kalibrasi
0.4 ml
100 µl serum vorteks, + 0.3 ml Vorteks,
human + 0.1 ml inkubasi suspensi inkubasi (10
[3H]digitoksin charcoal salut min di dalam ice
(24.4 Ci/mmol) (4℃,2 h) dekstran bath)

Hasil
Ukur radioaktivitas Ambil 0.5 ml
radioaktivitas vs. log supernatan, + 6
Sentrifugasi
dengan Aloka LSC-
digitoksin non label 3000, bandingkan 1700 X g (10
ml larutan
dengan konsentrasi dengan blanko min, 4℃)
scintillation
1-200 ng/ml (A & B)
→ linear
Presisi Antiserum A dan B
• Serum disiapkan dengan cara yang sama
• Serum mengandung 5-100 ng/ml digitoksin → diuji intra-interday
• Hasil: variabilitas uji inter & intraday < 10%

Spesifitas
Human serum + digitoksin + metabolit (digitoksigenin, dihidrodigitoksin, dll)
Menghitung cross-reactivity dengan berbagai metabolit
Hasil: antiserum A lebih spesifik terikat dengan digitoksin dibandingkan
dengan antiserum B
Akurasi
+ (5, 10, 20, 50, 100 ng/ml) digitoksin ke dalam serum → uji intra- & interday
Hasil: Koefisien variasi <10% (n=8) dan % recovery 96.8-105%

Uji Kadar
• Sampel serum disimpan pada suhu -18℃ sampai pengujian dilakukan
• Hasil: Konsentrasi digitoksin pada sampel dengan antiserum A (rata-rata
10.0 ng/ml dengan rentang 1.9-18.9 ng/ml) < sampel antiserum B (12.4
ng/ml (rentang 2.6-24.8 ng/ml)

Kesimpulan: RIA menggunakan antiserum A dapat mengukur digitoksin yang

tidak dimetabolisme dan mungkin bisa diaplikasikan untuk studi
farmakokinetik
Determination of a
Homogeneous Immunoassay for
The Detection of Zolpidem in
Urine
HYNH, ET AL. (2009). JOURNAL OF ANALYTICAL TOXICOLOGY,
33, 486-490.
DOI: 10.1093/JAT/33.8.486
Latar Belakang
Zolpidem → obat sedatif-hipnotik non-
benzodiazepin digunakan jangka pendek untuk
insomnia
Dosis umum 10 mg; pada geriatri 5 mg
Dapat menyebabkan ketergantungan psikologi &
fisik
Banyak penyalahgunaan → butuh uji yang cepat dan
sangat sensitif
Pengembangan EIA untuk deteksi zolpidem dalam
urin
Dibandingkan dengan LC-MS-MS
Preparasi Antibodi
Siapkan 0.05 M NAD
Larutkan AB
dan 0.5% NaCl dalam
poliklonal ke
20 mM buffer Tris-
dalamnya
HCl (pH 6.0)

Preparasi Konjugat Enzim

Siapkan 0.2% BSA
dan 0.5 M G6P dlm Larutkan Zolpidem
buffer Tris-HCl (pH G6PD ke dalamnya
7.8)
Protokol HEIA
Menggunakan alat Olympus AU400 automated chemical analyzer
Sample size: 10 µl
AB: 100 µl
Reagent zolpidem G6PD: 70 µl
Protokol
◦ Sampel + AB, dicampur dan diinkubasi 5 min → + reagent zolpidem
G6PD
◦ Ukur absorbansi aktivitas enzim pada panjang gelombang 340 nm
Sensitivitas & Presisi
Konsentrasi 5, 10, 25 ng/ml
Menggunakan Olympus AU400 → uji inter (4 hari; n=60) & intraday (n=15)
Hasil
◦ LOD Zolpidem: 5 ng/ml & konsentrasi cut off 10 ng/ml
◦ CV intra & interday < 20%

Akurasi
• Membandingkan kurva kalibrasi (5, 10 , 15,20, & 25 ng/ml) dalam urin
sintetik dengan urin autentik bebas zolpidem
• Hasil: Kalkulasi recovery: 80%
Spesifitas Related & Non-Related
+ 10000 ng/ml zaleplon & zopiclone (related)
Hasil: Tidak ada cross-reactivity terhadap AB

Stabilitas Konjugat Enzim

Tidak
Gunakan
50 ml Zolpidem dipaparkan Uji hari ke 1, 3,
zolpidem G6PD
G6PD(25℃) cahaya selama 6, 18, & 35
(5℃) sbg kontrol
35 hari

• Hasil: tidak ada penurunan significant dari performa assay

Spesimen Urin
Kelompok naïve patient & kelompok frequent user (prescripted)
Sebelumnya perlakuan, urin native patient diambil untuk data kurva
kalibrasi & disiapkan untuk @ setiap batch. IS zolpidem-d6 100
ng/ml.
@ diberikan 10 mg zolpidem
Urin diambil di titik 1, 4, 8, dan 16 jam
Ekstraksi Urin (Metode SPE)
Kolom dikondisikan
0,1 ml urin + 0.1 M Spesimen dimasukkan
MeOH 2ml & 0.1 M
CH3COOH (pH 4.0) ke dalam kolom
CH3COOH (pH4; 2ml)

Fase solid dibilas

Ekstrak dievaporasi &
Obat dielusi dengan 2 dengan air deionisasi
direkonsitutsi dg
ml etilasetat-NH4OH (2 ml), 0.1 M HCl (2
MeOH (50 µl) →
(98:2) ml), MeOH (1 ml), &
injeksi
Etil asetat
Perbandingan HEIA & LC-MS-MS

Cut-off Cont:

• HEIA: 10
ng/ml

• LC-MS-MS: 1
ng/ml
Kesimpulan