Tugas

TUGAS PCR: JURNAL

dr. Anggita Patra Ali 04032782327008

dr. Nyimas Irina Silvani 04032782327009
dr. Tatia Indira 04032782327010
dr. Mutiara Qori Akbar 04032782327011

Pembimbing
dr. Ella Amalia

PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS I

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSISTAS SRIWIJAYA
PALEMBANG
2023
 Judul Jurnal:
A Real-Time RT-PCR Assay fot Genotyping of Rotavirus

1. Metode PCR
Pengumpulan dan pemrosesan sampel
Sebanyak 120 sampel tinja diperoleh dari anak-anak berusia lima
tahun ke bawah dengan diagnosis utama gastroenteritis akut tidak berdarah
yang dirujuk ke Pusat Medis Anak di Teheran, Iran, dari Mei 2013 - Mei
2014. Kriteria pengumpulan sampel pada penelitian ini adalah tidak
adanya leukosit, sel darah merah dan pus pada tinja. Kotoran disimpan
pada suhu -70°C setelah analisis primer.
Suspensi 10% (b/v) dari setiap sampel tinja disiapkan untuk
ekstraksi RNA. Secara singkat, satu gram (peasized) atau 100 μl setiap
sampel tinja dilarutkan dalam 1000 μl PBS dan kemudian disentrifugasi
pada 1500 ×g selama 20 menit. RNA Rotavirus diekstraksi dari 100 μl
supernatan yang disaring dengan metode ekstraksi fenol-kloform standar.

Reverse transcription
CDNA disintesis dengan RevertAid RT Reverse Transcription Kit
(Thermo Fisher Scientific, USA). Reverse transcription dilakukan dalam
volume akhir 20 μl yang mengandung 4 μl dari 5× reverse transcription
buffer, 1 μl dari 10 mM dNTPs, 1 μl dari 0,2 U/μl random hexamer, 1 μl
dari 40 U/μl RNase inhibitor, 1 μl dari 200 U/μl reverse transcriptase
enzyme, 8 μl dietil pirokarbonat (RNase-free water), dan 4 μl RNA yang
diekstraksi. Tabung di inkubasi pada suhu 42ºC selama 1 jam.

RT-PCR untuk deteksi rotavirus

Amplifikasi PCR dilakukan dalam volume akhir 25 μl yang
mengandung 2,5 μL dari 10× PCR buffer (CinnaGen, Iran), 1 μL dari
setiap 10 pmol/μL primer, 1 μL dari 10 mM dNTPs (Fermentas UAB,
Lituania), 1 μL 500 μ/μl Taq DNA polimerase (CinnaGen), 1,5 μL dari 50
mM MgCl2 (CinnaGen), 12 μL H2O, dan 4 μl templat cDNA. Dua primer
(forward: 5′- GAC GGV GCR ACT ACA TGG T-3′ dan reverse: 5′- GTC
CAA TTC ATN CCT GGT G -3′) digunakan untuk memperkuat fragmen
VP6. Profil suhu terdiri dari denaturasi awal pada 95°C selama 5 menit,
diikuti dengan 40 siklus termasuk denaturasi pada 94°C selama 1 menit,
annealing pada 55°C selama 1 menit, elongasi pada 72°C selama 1 menit.
menit, dan langkah ekstensi terakhir pada 72°C selama 10 menit.
Amplifikasi dilakukan menggunakan Verity™ 96-well Thermal Cycler
(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Multiplex semi-nested RT-PCR

Tipe G dan P dari sampel HRV-positif diperoleh dengan uji
Multiplex semi-nested RT-PCR menggunakan primer konsensus dan tipe
spesifik. Produk PCR dianalisis pada gel agarosa 2% dan divisualisasikan
menggunakan pewarna GelRed (GelRedΤΜ Nucleic Acid Gel Stain).

Real-time PCR untuk genotipe rotavirus

Kottaridi mengembangkan dua panel tes RT-PCR real-time untuk
mendeteksi G1-G4 dan G9, P [4], dan P [8]. Dalam penelitian ini,
berdasarkan hasil multiplex semi-nested RT-PCR, primer dan probe
spesifik genotipe diadaptasi atau dimodifikasi. Baik probe maupun primer
dievaluasi secara terpisah untuk setiap genotipe berdasarkan wilayah yang
paling dilestarikan, menggunakan alat Allele ID® (PREMIER Biosoft
International) dan ClustalW. Dalam beberapa kasus, nukleotida yang
mengalami degenerasi dirancang untuk memastikan amplifikasi semua
genotipe HRV. Primer dan probe oligonukleotida disintesis oleh Macrogen
(Macrogen, Korea Selatan). Enam pasangan primer, bersama dengan enam
probe berlabel fluorofor berbeda, digunakan untuk memperkuat dan
mendeteksi genotipe G1, G2, G9, P4, P8, dan kontrol internal (RNase P).
Rincian primer, probe dan fluorophore/quencher ditunjukkan pada Tabel 1.
Untuk memfasilitasi penggunaan PCR real-time dan untuk meningkatkan
 sensitivitas pengujian, tiga panel PCR real-time diformulasikan dalam
penelitian ini, di mana panel tersebut Panel I dirancang untuk mendeteksi
genotipe G1 dan G2, panel II untuk mendeteksi tipe G9 serta Rnase P
sebagai internal control assay, dan panel III untuk identifikasi genotipe P
[4] dan P [8].
RT-PCR genotype dilakukan dalam sistem LightCycler™96
(Roche, Basel, Swiss) Kottaridi et al. melaporkan berbagai suhu anneling
[55–65 °C] dengan kisaran konsentrasi akhir 200 hingga 600 nmol untuk
primer dan probe. Reaksi PCR real-time dilakukan dalam volume akhir 25
μl, berisi 2 μl templat cDNA, 400 nM setiap primer, dan 200 nM setiap
probe. Nilai Ct kemudian ditentukan. Amplifikasi dilakukan pada kondisi
termal berikut: denaturasi awal pada 95 ºC selama 5 menit, 40 siklus
termasuk denaturasi pada 95 ºC selama 15 detik, annealing pada 60 ºC
selama 30 detik, elongasi pada 72 ºC selama 30 detik, dan ekstensi akhir
suhu 72°C selama 5 menit. Berdasarkan nilai Ct, kondisi optimal
ditentukan, pertama untuk reaksi tunggal dan kemudian untuk satu set
beberapa panel yang menargetkan tipe G1/G2, G9/RNase P, dan P4/P8.

2. Primer
Forward: 5′- GAC GGV GCR ACT ACA TGG T-3′
Reverse: 5′- GTC CAA TTC ATN CCT GGT G -3′
3. Hasil
Dalam penelitian ini, ditemukan 28 (23,3%) pasien yang positif terinfeksi
HRV dengan metode RT-PCR berdasarkan gen rotavirus VP6. Genotipe G
dan P terdeteksi pada 28/120 pasien dengan multiplex semi-nested RT-
PCR. Secara keseluruhan, genotipe G1 (75%) merupakan genotipe paling
dominan, disusul G2 (14,3%), G9 (7,14%), dan G1/G2 campuran (3,58%).
Selain itu, dari segi genotipe p, P8 (75%) dan P4 (25%) dominan, genotipe
G4 dan G8 tidak terdeteksi.
 REFERENSI
- Mousavi-Nasab, SD. Sabahi, F. Kaghazian, H. Paryan, M. Samiee, SM.
Ghaderi, M. Zali, F. Makvandi, M. A Real-Time RT-PCR Assay for
Genotyping of Rotavirus. Iranian Biomedical Journal 24 (6): 399-404
November 2020.
LAMPIRAN