BAB IV

METODE PENELITIAN

4.1 Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorik dengan desain

true experimental laboratory dan metode randomized posttest only controlled group

design untuk melihat efek pemberian ekstrak Zalacca salacca terhadap ekspresi 8-

OHdG, SIRT-1 dan motilitas embio zebrafish model tinggi glukosa.

4.2 Tempat dan Waktu Penelitian

Tempat penelitian ini dilakukan di Laboratorium Farmakologi FK UB untuk

pemeliharaan , pemberian perlakuan dan pembuatan menjadi sampel, sedangkan

untuk pemeriksaan RealTime-PCR dilakukan pada Lab Biosains Universitas

Brawijaya. Waktu penelitian dilaksanakan pada bulan Juni 2019 sampai Juli 2019.

4.3 Populasi dan Sampel

4.3.1 Populasi Penelitian

Populasi penelitian ini adalah embrio sampai larva zebrafish usia 0-6 dpf

yang diperoleh dari hasil fertilisasi wild type antara induk jantan dan betina dengan

perbandingan 1:2. Zebrafish yang dipilih memiliki ciri strip horizontal berwarna biru

tua kehitaman yang dipelihara di Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran

Universitas Brawijaya Malang serta telah teruji dan tersertifikasi di Laboratorium

17
 18

Hidrologi Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Brawijaya Malang

(Khotimah et al., 2015)

4.3.2 Sampel Penelitian

Sampel dalam penelitian ini adalah embrio zebrafish pada usia 0-6 dpf.

Pengambilan sampl dilakukan secara random, dimana penentuan sampel pada

masing-masing kelompok dilakukan secara acak.

Penentuan jumlah replikasi menggunakan rumus :

(t-1) (r-1) ≥ 15

(3-1) (r-1) ≥ 15

(2) (r-1) ≥ 15

r-1 ≥ 7,5

r ≥ 8,5 = 9

dimana t = jumlah perlakuan

r = jumlah ulangan (Hanafifah, 2016)

Penentuan jumlah sampel juga berdasarkan penelitian yang mengunakan

zebrafish yaitu sebanyak 20-30 embrio per kelompok (Luccit et al.,2008).

4.4 Kriteria Inklusi dan Ekslusi

4.4.1 Kriteria Inklusi

Embrio zebrafish berusia 0-2 hpf, berwarna jenih transparan, tidak terdapat

serabut putih atau jamur saat dilihat dibawah mikroskop optilab, dan embrio yang

kosong (tidak berbuah).

 19

4.4.2 Kriteria Ekslusi

Embrio zebrafish yang hatching atau menetas sebelum 3 dpf, embrio yang

cacat.

4.5 Variabel Penelitian

4.5.1 Variabel Bebas

1. Kelompok KN: kontrol negatif (embrio normal, tidak dipapar tinggi

glukosa)

2. Kelompok KP: kontrol positif (embrio diabetes tanpa mendapatkan

ekstrak Zalacca salacca)

3. Kelompok P : embrio diabetes mendapatkan ekstrak Zalacca salacca

4.5.2 Variabel Tergantung/Terikat

Variabel terikat pada penelitian ini adalah ekspresi 8-OHdG, SIRT-1 dan

respon taktil.

4.5.3 Variabel Kontrol

Variabel kontrol dalam penelitian ini adalah temperatur akuarium, waktu

pemaparan dosis glukosa dan ekstrak Zalacca salacca, pencahayaan, embrionik

medium, kebersihan well plate dan inkubator, dan suhu 28 C ± 1 C

4.6 Definisi Operasional

Definisi operasional dalam penelitian ini adalah :

 20

1. Embrio zebrafish yang digunakan berusia 0-6 hpf merupakan hasil biakan

dari zebrafish dewasa galur murni wild-type.

2. Medium embrio yang digunakan terdiri dari 0,04% CaCl2, 1,63% MgSO4, 1%

NaCl dan 0,03% KCl yang dilarutkan dalam akuades.

3. Glukosa 3% (Merck) adalah glukosa sintetik yang digunakan untuk

menginduksi keadaan glukosa tinggi pada saat embrio dikeluarkan dari

chorion yaitu setelah 24 jam pasca fertilisasi (hpf).

4. Ekstrak Etanol Salacca zalacca yang berasal dari kebun salak disekitar

Malang dan dilakukan pengekstrakan di Batu

5. Ekspresi PEPCK

6. Ekspresi 8-OHdG merupakan marker stress oksidatif yang terjadi pada

mitokondria yang dilakukan pemeriksaan menggunakan primer Forward :5′-

CACCCAAGAACAGGGTTTGT-3′ and Reverse :5′-TTAACAACATACC

CATGGCCA-3′ pada RealTime- PRC.

7. Ekspresi SIRT-1 merupakan marker protektif dari kerusakan stress oksidatif

yang dilakukan pemeriksaan menggunakan primer Forward 5′- ACA GTT

CCA GCC ATC TCC ATG TCA -3′ and Reverse 5′- AAG ACC CGT GGC

ACT GAA TGA TCT -3′ pada RealTime-PCR.

8. Motilitas adalah salah satu respon pergerakan motorik pada zebrafish

dengan menyentuh ujung ekor embrio zebrafish usia 72 hpf. Respon taktil

yang dimaksud berupa aktifitas perpindahan tempat yang disertai pergerakan

seluruh tubuh, yakni gerakan berenang kedepan saat embrio disentuh

dengan jarum pada ekornya saat embrio berada di dalam well-plate.

 21

4.7 Alat dan Bahan

4.7.1 Alat dan Bahan Pemeliharaan Zebrafish

1. Alat : aquarium dengan kapasitas 60 L, filtrasi dan aerasi air, Ph meter, alat

pengukuran suhu, tempat penakaran telur ikan, well plate berisi 6 sumuran,

pipet plastic, mikropipet, dan tip (blue, yellow, white), inkubator suhu ± 28 C

2. Bahan : air aqua, medium embrionik, dan pakan ikan (tetramin)

4.7.2 Alat dan Bahan Pembuatan Ekstrak Zalacca salacca

1. Alat : timbangan, oven, blender, gelas Erlenmeyer, evaporator, corong gelas,

labu penampung etanol, rotary evaporator, water pump, selang water pump,

water bath, vaccum pump, botol tempat hasil ekstraksi, dan lemari pendingin

2. Bahan : kulit salak, pelarut etanol, kertas saring, dan alumunium foil.

4.7.3 Alat dan Bahan Pembuatan Medium Embrionik

1. Alat : tabung reaksi 500 mL, timbangan digital (Metter Toledo), dan alat

pengaduk

2. Bahan : CaCl 0,25 gr, KCL 0,15 gr, NaCl 5 gr, MgSO4 0,815 gr, dan

aquadest 500 mL

4.7.4 Alat dan Bahan Pengukuran ekspresi PEPCK

1. Alat : tabung reaksi 500 mL, timbangan digital (Metter Toledo), dan alat

pengaduk

2. Bahan : CaCl 0,25 gr, KCL 0,15 gr, NaCl 5 gr, MgSO4 0,815 gr, dan

aquadest 500 mL
 22

4.7.5 Alat dan Bahan Pengukuran ekspresi 8-OHdG

1. Alat : tabung reaksi 500 mL, timbangan digital (Metter Toledo), dan alat

pengaduk

2. Bahan : CaCl 0,25 gr, KCL 0,15 gr, NaCl 5 gr, MgSO4 0,815 gr, dan

aquadest 500 mL

4.7.6 Alat dan Bahan Pengukuran ekspresi SIRT-1

1. Alat : tabung reaksi 500 mL, timbangan digital (Metter Toledo), dan alat

pengaduk

2. Bahan : CaCl 0,25 gr, KCL 0,15 gr, NaCl 5 gr, MgSO4 0,815 gr, dan

aquadest 500 mL

4.7.7 Alat dan bahan Pengukuran Motilitas Taktil

1. Alat : tabung reaksi 500 mL, timbangan digital (Metter Toledo), dan alat

pengaduk

2. Bahan : CaCl 0,25 gr, KCL 0,15 gr, NaCl 5 gr, MgSO4 0,815 gr, dan

aquadest 500 mL

4.8 Prosedur Penelitian

4.8.1 Pemeliharaan Zebrafish (Danio rerio) Dewasa

Komposisi populasi zebrafish yang dipelihara adalah 20 betina dan 10 jantan

(2:1), yang dipelihara dalam aquarium yang berisi 60 liter air, dengan suhu
o
lingkungan diatur menjadi 28 ± 1 C. Pencahayaan aquarium diatur dengan
 23

perbandingan gelap : terang adalah 14 : 10, dimana periode terang dimulai pukul

08.00 WIB, serta periode gelap dimulai pukul 22.00 WIB (Kishida et al., 1999).

Zebrafish dipelihara pada ph 6,5 -8 atau ph normal (Gebauer, 2016). Setiap harinya

zebrafish diberi makan dengan artemia Nauplii yang di kultur sebanyak 2-3 kali

sehari (Westerfield, 2007).

4.8.2 Breeding dan Peneluran Zebrafish Dewasa

Komposisi populasi zebrafish yang dipelihara adalah 20 betina dan 10 jantan

(2:1), dimana breeding dimulai sesudah pemberian makan terakhir yakni jam 3 sore.

Dalam proses breeding di bagian dasar akuarium ditempatkan keranjang berjala

untuk menampung telur dan di permukaan keranjang ditempatkan tanaman artifisial

untuk mendukung proses peneluran selama periode gelap.

4.8.3 Pengambilan Telur Zebrafish

Pengambilan telur dilakukan pada saat 15-25 menit fase terang dimulai

dengan meletakan keranjang berjala pada akuarium. Pada awal fase terang tersebut

terjadi fertilisasi, setelah telur diambil maka dilakukan pencucian dengan medium

embrio supaya debris yang menempel hilang (Aurora, 2012).

4.8.4 Pemeliharaan Embrio Zebrafish

Setelah telur-telur dikumpulkan dan diletakkan dalam cawan petri yang berisi

medium embrio, telur-telur tersebut diamati terlebih dahulu dengan menggunakan

mikroskop untuk melihat apakah telur tersebut fertil atau tidak fertil (bleaching), serta
 24

untuk mengetahui usia telur-telur tersebut. Pada telur yang fertil, telur tersebut akan

terlihat jernih dan simetris, dengan embrio didalamnya yang berkembang (lebih dari

tahap 1 sel), sedangkan pada telur yang infertil, telur tersebut akan terlihat tidak

jernih, inti telur berwarna putih pucat serta sel embrio didalamnya tidak tumbuh dan

berkembang (hanya dalam tahap 1 sel saja). Bisa juga ditemukan bagian tengah

telur infertil tersebut terbentuk masa kehitaman. Telur-telur yang fertil saja yang akan

dipakai pada penelitian. Dari pengumpulan telur, proses pelepasan dari chorion

hingga pemaparan dengan genistein dan glukosa dilakukan dengan total tidak lebih

dari 2 jam, karena dapat mempengaruhi validitas penelitian. Setelah itu telur fertil

dan usia embrio kurang dari 2 hpf dipindahkan ke dalam wadah kultur 6 well, yang

berisi 30 embrio/8 ml medium embrio (Braunbeck and Lammer, 2006).

4.8.5 Pemaparan Glukosa pada Embrio Zebrafish

Pemberian glukosa kadar 3% ini dilakukan dengan cara melepaskan embrio

dari cangkang atau dechorion 24 jam post fertilisasi, kemudian glukosa 3%

dilarutkan ke medium embrio dan dipaparkan minimal dalam 24 hpf. Setelah glukosa

dilarutkan, embrio yg sudah dilepaskan dari chorion dipindahkan kedalam medium

tersebut yang nantinya akan diserap oleh embrio secara intradermal (Mustika,

2013).

4.8.6 Pengukuran Ekspresi PEPCK pada Embrio Zebrafish

 25

4.8.7 Pemaparan Ekstrak Zalacca salacca pada Embrio Zebrafish

4.8.8 Pengukuran Ekspresi 8-OHdG pada Embrio Zebrafish

4.8.9 Pengukuran Ekspresi SIRT-1 pada Embrio Zebrafish

4.8.10 Pengamatan Respon Taktil pada Embrio Zebrafish

Motilitas zebrafish dikenal juga sebagai respon taktil. Respon taktil berguna

untuk menilai kemampuan motorik larva zebrafish pada usia 72 hpf, karena respon

berenang larva terhadap rangsang taktil pada ekor optimal pada 72 jam setelah

fertilisasi (Drapeu et al., 2008). Tes respon taktil dilakukan dengan memberikan

stimulasi berupa jarum yang disentuhkan pada ekor larva yang diam. Kemudian

diamati dan dihitung jumlah larva yang berenang setelah mendapat stimulasi. Cara

mengukur respon taktil pada penelitian ini yaitu dengan menempatkan 3 ekor embrio

zebrafish kedalam well-plate berkapasitas 12 well, kemudian masing-masing embrio

disentuh ekornya dengan jarum dekorion dan dilihat apabila embrio mengalami

pergerakan berenang berpindah tempat maka hasil dikatakan positif, dan sebaliknya

bila larva tidak berenang berpindah tempat setelah dilakukan penyentuhan ekor

maka dikatakan hasil negatif. Waktu yang diperlukan adalah 10 detik/ekornya. Larva

yang memiliki kelainan morfologi berupa curved tail tidak disertakan dalam tes

pengamatan motorik. (Drapeu et al., 2002).

 26

4.9 Analisis Data

Seluruh teknis pengolahan data hasil penelitian dianalisis secara

komputerisasi dengan menggunakan software Statistical Product and Service

Solution, IBM SPSS Statistics 20 dengan tingkat signifikansi atau nilai probabilitas

0,05 (p=0,05) dan taraf kepercayaan 95% (α=0,05). Langkah-langkah uji hipotesis

komparatif adalah sebagai berikut: uji normalitas data, uji homogenitas varian, uji

One-way ANOVA, dan Post hoc test (uji Least Significant Difference).

4.10 Alur Penelitian

Pemeliharaan zebrafish
(Danio rerio) dewasa sesuai
ketentuan.

Pengambilan telur

Seleksi telur Infertil atau berusia ≥ 2

hpf

Fertil dan berusia < 2 hpf

Pemeliharaan dan pemaparan glukosa 3% dalam 2 jam pasca fertilisasi (pada 5

well, 1 well berisi medium embrio (kontrol))
 27

Kontrol (-)
medium Kontrol (+) Glukosa 3%
embrio Glukosa 3% + G* 0,5 μm

Pemeriksaan ekspresi 8-OHdG , SIRT-1

dan pengamatan respon taktil (72 hpf)

Analisa data

4.10 Jadwal Pelaksanaan

Pelaksanaan kegiatan dilakukan selama 1 bulan sedangkan waktu

pelaksanaan akan mulai bulan Juni 2019 sampai Juli 2019.

Tabel 4.2 Jadwal Pelaksanaan Penelitian

N Kegiatan Agustus 2017 September 2017 Oktober 2017 November 2017

o 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
1 Persiapan
2 Pengump
ulan Data
3 Analisis
data
4 Finalisasi
28