GINOGENESIS

I. PENDAHULUAN

Ginogenesis adalah suatu proses penurunan sifat maternal secara total melalui
perkembangan telur tanpa kontribusi sperma secara genetik untuk menjadi embrio.
Ginogenesis merupakan salah satu bentuk rekayasa genetik yang dapat dimanfaatkan untuk
mendapatkan keturunan yang bersifat homozigot dalam waktu singkat (cloning). Ginogenesis
buatan memungkinkan untuk dilakukan pada semua spesies ikan yang telah dapat dilakukan
pembuahan buatan. Ginogenesis pada dasarnya merupakan suatu perlakuan untuk mengatasi
dua masalah dalam proses pembentukan zigot. Pertama adalah menonaktifkan material
genetik sperma dan kedua yaitu merangsang diploidisasi untuk terbentuknya zigot.
Ginogenesis buatan dilakukan dengan cara merangsang perkembangan embrio dari
nukleus telur dengan menggunakan sperma yang sudah tidak berfungsi secara genetis namun
masih dapat berfungsi secara fisiologis. Rangsangan ini dapat dihasilkan melalui beberapa
perlakuan pada saat pembuahan pada awal perkembangan telur yaitu meradiasi sperma
dengan menggunakan bahan mutagen serta diploidisasi kromosom betina dengan kejutan
panas. Dalam praktek untuk konfirmasi atau memastikan tidak adanya kontribusi sperma
secara genetik, dapat pula digunakan sperma dan spesies yang berbeda. Lebih baik lagi
apabila sperma tersebut tidak mampu membentuk hibrida. Syaratnya adalah ukuran sperma
harus minimal sama dengan spesies ikan betina.
Bahan-bahan mutagen yang dapat digunakan untuk menonaktifkan sperma adalah
sinar gamma, sinar X dan sinar ultraviolet. Dari ketiga jenis sinar tersebut, sinar ultraviolet
relatif lebih mudah digunakan, lebih murah dan lebih aman. Salah satu upaya untuk
meningkatkan diploiditas benih ginogenetik yaitu dengan memberikan kejutan suhu yang
dilakukan pada saat meiosis pertama, meiosis kedua atau mitosis pertama. Ketepatan waktu
awal kejutan, lama kejutan dan suhu kejutan dapat mempengaruhi peningkatan jumlah
kromosom dan keberhasilan ginogenesis.
II. BAHAN DAN ALAT

Bahan

1. Sperma ikan mas/ koi/ koki 4. Larutan fisiologis 0.9 %

2. Telur ikan mas/ koi/ koki 5. Methylen blue
3. Larutan NaCl 1.3 %

Alat

1. Bulu ayam 7. Water bath

2. Lempengan kaca 8. Mangkuk putih

3. Akuarium 9. Stop watch

4. Termometer 10. Box Ultraviolet

5. Sendok plastik/ spatula 11. Kertas tissue

6. Spidol Marker 12. Kakaban, set pemijahan

III. PROSEDUR KERJA

1. Sperma diencerkan sekitar 10 kali dengan larutan Ringer atau larutan fisiologis sebelum
diradiasi.
2. Lapisan sperma dengan kedalaman  0.1 mm diradiasi dengan intensitas radiasi  4.500
– 4.800 ergs/mm2 selama 1.5 – 2 menit dengan jarak penyinaran 15 cm.
3. Sperma dan telur dicampur merata.
4. 3 menit dari waktu pembuahan, telur tersebut diberi kejutan panas dengan suhu 40 0C
selama 1.5 – 2 menit.
5. Telur diinkubasi dalam akuarium kaca dengan suhu air 28 0C.
POLIPLOIDISASI
I. PENDAHULUAN

Rekayasa genetik dengan melakukan manipulasi set kromosom merupakan salah satu
kegiatan penting dalam pembenihan ikan. Androgenesis, ginogenesis dan poliploidi adalah
tiga macam perlakuan yang telah dilakukan dalam memanipulasi set kromosom. Ketiga
perlakuan ini potensial dalam mengatur jenis kelamin dan manipulasi genom. Dalam
perlakuan poliploidisasi, proses awal pembelahan sel pada telur yang telah dibuahi dihambat
dengan menggunakan perlakuan fisik atau kimia untuk menghasilkan individu triploid atau
tetraploid.
Salah satu tujuan utama dalam poliploidisasi adalah untuk menghasilkan individu
triploid yang diduga steril karena jumlah set kromosom yang ganjil akan menghambat
pembelahan meisosis sehingga perkembangan gonad akan terhambat pula. Dengan demikian
masalah overpopulasi dapat dihindari dan individu ini berpeluang untuk tumbuh dan bertahan
hidup dibandingkan dengan dengan ikan normal.
Keberhasilan pembentukan individu triploid ditentukan oleh tiga hal pokok, yaitu
umur zigot waktu kejutan dimulai, suhu kejutan dan lama pelaksanaan kejutan. Pemilihan
waktu awal, lama waktu dan suhu kejutan yang tepat adalah spesifik atau khas untuk masing-
masing spesies.
Identifikasi tingkat ploidi ikan dapat dilakukan dengan dua cara : 1). Metoda langsung
yaitu melalui penghitungan jumlah kromosom, dan 2). Metoda tidak langsung antara lain
melalui pemeriksaan morfologi, elektroforesis protein, pengukuran volume nukleolus atau sel
dan menghitung jumlah nukleolus.
II. BAHAN DAN ALAT

Bahan

1. Induk ikan Nila 4. Larutan fisiologis 0.9 %

2. Air panas 5. Methylen blue

3. Larutan NaCl 1.3 %

Alat

1. Bulu ayam 6. Water bath

2. Sendok/ spatula 7. Stop watch

3. Mangkuk putih 8. Termometer

4. Kertas tissue 9. Akuarium

5. Saringan tahu

III. PROSEDUR KERJA

1. Telur dan sperma dari induk ikan Nila dicampur dan diletakkan ke dalam wadah
pembuahan (mangkuk)
2. Tunggu selama 4 menit dari awal pembuahan, lalu telur dipindahkan ke dalam saringan.
3. Saringan dimasukkan ke dalam water bath bersuhu ± 41 0C dan dibiarkan selama 4
menit.
4. Pindahkan ke akuarium pemeliharaan yang telah diberi methylen blue dan aerasi.
5. Pelihara telur ikan perlakuan hingga menjadi larva atau benih dan siap diamati tingkat
keberhasilannya.
PREPARASI KROMOSOM TEKNIK JARINGAN PADAT
I. PENDAHULUAN

Kromosom adalah materi genetik yang merupakan kumpulan gen. Sedangkan gen
adalah satuan/unit terkecil informasi genetik yang merupakan sekuen DNA tertentu (500 –
1500 bp) yang bertanggungjawab dalam mengontrol karakter tertentu. Kromosom terletak
dalam inti sel dan hanya dapat dilihat pada saat sel sedang membelah. Setiap spesies
memiliki kromosom yang khas dan berbeda dengan spesies lain. Kekhasan ini meliputi
ukuran, bentuk dan jumlah dari kromosom yang dimiliki.
Untuk mengetahui bentuk, ukuran serta jumlah kromosom dapat dilakukan dengan
pembuatan preparat kromosom. Pembuatan preparat kromosom dapat dilakukan dengan dua
metode yaitu dengan teknik jaringan padat dan teknik kultur darah. Morfologi kromosom
akan dapat diamati dengan baik bila pembelahan selnya berada pada tahap metafase, karena
pada saat itu kromosom berada dalam keadaan padat maksimum dan mudah menyerap
pewarna sehingga mudah diamati.
Tahapan-tahapan untuk mendapatkan kromosom melalui teknik jaringan padat
meliputi perlakuan kolkisin, perlakuan hipotonik, fiksasi, pembuatan preparat, pewarnaan dan
pengamatan. Perlakuan kolkisin bertujuan untuk menghentikan pembelahan sampai tahap
metafase, karena pada tahap ini kromosom berkontraksi maksimum dan nampak paling jelas.
Selain kolkisin, bahan yang sering digunakan pada perlakuan ini adalah Colcemid.
Agar sel-sel membesar dan letak kromosom menyebar, maka diberikan perlakuan
hipotonik dengan larutan Kalium Klorida (KCl). Proses selanjutnya adalah fiksasi dengan
larutan Carnoy yang bertujuan untuk mempertahankan bentuk dan keutuhan kromosom.
Pewarnaan dilakukan agar kromosom mudah diamati di bawah mikroskop.
Analisa kromosom dapat digunakan untuk menentukan tingkat ploidi (diploid,
triploid, dsb) dan karakteristik suatu spesies yang dikenal dengan teknik karyotip.
II. BAHAN DAN ALAT

Bahan

1 Kolkisin (C22H25NO6) 5. Asam asetat glacial (CH3COOH)

.
2
Metanol atau etanol (C2H5OH) 6. Giemsa
.

3
Kalium klorida (KCl) 7. Akuabides
.
4
Ikan uji
.

Alat

1. Timbangan 5. Gelas obyek

2. Mikroskop binokuler 6. Alat bedah (pinset dan pisau bedah)

3. Hot plate/ setrika 7. Pipet tetes

4. Kertas tissue 8. Gelas obyek cekung

III. PEMBUATAN REAGEN

Langkah-langkah dalam pembuatan reagen

1. Larutan kolkisin 0.07% w/v : dibuat dengan melarutkan 70 mg kolkisin dalam 1 liter
air.
2. Larutan hipotonik 0.075 M (1 liter) : dibuat dengan melarutkan 5.6 gr KCl dalam 1 liter
akuades.
3. Larutan Carnoy : dibuat dengan mencampurkan Asam asetat glacial dan etanol atau
metanol dengan perbandingan volume 1 : 3.
4. Larutan alkohol 70% : dibuat dengan mencampurkan etanol absolut dan akuades dengan
perbandingan 7 : 3 (1 liter larutan alkohol 70% = 700 ml etanol Absolut + 300 ml
akuades).
5. Larutan Giemsa 10% : dibuat dengan mencampurkan Giemsa dan akuades dengan
perbandingan 1 : 9 (100 ml larutan Giemsa 10% = 10 ml giemsa + 90 ml akuades).
6. Asam asetat 50% : dibuat dengan mencampurkan asam asetat glacial dan akuades dengan
perbandingan volume 1 : 1.

IV. PROSEDUR KERJA

Perendaman dengan kolkisin dan pengawetan jaringan

1. Ikan direndam dalam larutan kolkisin 0.07% w/v selama 6 – 9 jam. Selama perendaman,
ikan dibiarkan berenang dalam wadah dengan aerasi yang baik. Setelah itu ikan
dibunuh.
2. Sirip ekor dan insang ikan dipotong kecil-kecil (Gambar 1). Potongan jaringan tersebut
direndam dalam larutan hipotonik (KCl 0.075 M) selama 60 menit pada suhu ruang.
Larutan hipotonik diganti setiap 30 menit selama waktu perendaman dengan volume 20
kali volume jaringan.
3. Jaringan difiksasi dengan larutan Carnoy selama 60 menit. Larutan Carnoy diganti
dengan yang baru setiap 30 menit.
4. Kemudian dilanjutkan dengan pembuatan preparat (bila diperlukan jaringan yang telah
difiksasi dapat disimpan dalam refrigrator selama 1 - 2 minggu).

Pembuatan Preparat

1. Jaringan yang telah difiksasi diambil dengan menggunakan pinset dan disentuhkan pada
kertas tissue untuk menghilangkan larutan fiksatif.
2. Kemudian jaringan tersebut diletakkan di atas gelas objek cekung dan ditambahkan 3 – 4
tetes asam asetat 50%. Setelah itu jaringan di aduk perlahan dengan menggunakan pisau
bedah secara hati-hati hingga terbentuk suspensi sel (larutan menjadi keruh).
3. Gelas obyek yang akan digunakan sebagai preparat sebelumnya direndam di dalam
Alkohol 70% minimal selama 2 jam.
4. Suspensi sel yang terbentuk diambil dengan menggunakan pipet tetes lalu diteteskan di
atas gelas obyek yang ditempatkan di atas hot plate dengan suhu 45 – 500 C, dan dihisap
kembali dengan cepat setelah terbentuk lingkaran (ring) dengan diameter 1 – 1.5 cm.
Pada setiap gelas obyek idealnya dapat dibuat menjadi 3 lingkaran.
Pewarnaan Preparat
1. Preparat yang telah berisi lingkaran (ring) diwarnai dengan larutan Giemsa 10% dengan
cara memberikan larutan sebanyak 3 – 5 tetes lalu disebarkan hingga menutupi ring
dengan menggunakan tusuk gigi, atau melalui teknik perendaman. Pewarnaan dilakukan
selama 20 – 30 menit pada suhu kamar.
2. Preparat dibilas dengan menggunakan akuades lalu dibiarkan kering udara.
3. Preparat diamati di bawah mikroskop.

Contoh Preparat

Gambar 1. Contoh hasil preparasi kromosom, A. ikan kerapu macan (Epinephelus

fuscoguttatus); B. ikan nila triploid (Oreochromis niloticus)

Tabel 1. Jumlah kromosom ikan pada berbagai tingkat ploidi.

Jumlah Kromosom
Spesies
Haploid Diploid Triploid

1. Mas (Cyprinus carpio) 50 100 150

2. Nila (Oreochromis
22 44 66
niloticus)

3. Tawes (Puntius
25 50 75
javanicus)
PREPARASI NUKLEOLUS
I. PENDAHULUAN
Nukleolus merupakan anak inti yang terdapat di dalam inti sel, organel ini akan
nampak pada tahap interfase dan berfungsi sebagai pengatur dalam pembelahan sel dan
mensintesa ribosom bersama asam nukleatnya. Perhitungan nukleolus merupakan suatu
metode tidak langsung dalam mengidentifikasi poliploidi. Metode ini merupakan metode
yang mudah, cepat dan relatif murah serta berpeluang besar untuk diterapkan pada berbagai
spesies ikan.
Metode penghitungan nukleolus dapat menggunakan perwarnaan yang dipakai oleh
Howell dan Black (1980) yaitu dengan metode pewarnaan perak (silver staining). Pewarna
yang digunakan dalam metode ini adalah perak nitrat yang berfungsi untuk mewarnai
komponen-komponen protein pada nukleolus. Dengan pewarnaan perak nitrat ini, pada saat
interfase, sel inti akan terlihat berwarna kuning sedangkan nukleolus berwarna hitam.
Sedangkan pada saat metafase, kromosom berwarna kuning dan NOR berwarna hitam.
Jumlah nukleolus ini bervariasi atau tetap tergantung pada spesies dan jumlah kromosom
yang memiliki NOR.

II. BAHAN DAN ALAT

Bahan
1. Ikan uji 6. Gelatin

2. Asam formiat 7. Asam asetat glacial

3. Perak nitrat (AgNO3) 8. Asam asetat 50%

4. Etanol absolute 9. Akuades

5. Gliserin 10. Kalium klorida (KCl)

Alat
 1. Gelas obyek cekung 5. Box staining
2. Mikroskop 6. Tusuk gigi

3. Gelas preparat dan cover glass 7. Alat bedah

4. Hot plate/ Setrika 8. Kertas Tissue

III. PEMBUATAN REAGEN

1. Larutan Carnoy : dibuat dengan mencampurkan asam asetat glacial dan etanol atau
metanol dengan perbandingan 1 : 3.
2. Larutan hipotonik 0.075 M (1 liter) : dibuat dengan melarutkan 5.6 gr KCl dalam 1 liter
akuades.
3. Larutan A : 10 gr AgNO3 dilarutkan dalam 20 ml akuades.
4. Larutan B : 2 gr gelatin dilarutkan dalam 50 ml air kemudian ditambahkan dengan 50 ml
gliserin sambil diaduk hingga jernih. Larutan campuran (gelatin + air + gliserin) di bagi
menjadi 10 tempat (masing-masing 10 ml larutan), kemudian tiap-tiap larutan 10 ml
tersebut ditambahkan 2 tetes asam formiat. Larutan disimpan dalam freezer. Sebelum
digunakan, larutan ini dicairkan dalam air hangat.

IV. PROSEDUR KERJA

Pembuatan Preparat

1. Sirip ekor dan insang ikan dipotong kecil-kecil. Potongan jaringan tersebut direndam
dalam larutan hipotonik (KCl 0.075 M) selama 60 menit pada suhu ruang. Larutan
hipotonik diganti setiap 30 menit selama waktu perendaman dengan volume 20 kali
volume jaringan.
2. Kemudian difiksasi dalam larutan Carnoy selama 60 menit dengan penggantian larutan
Carnoy setiap 30 menit.
3. Selanjutnya proses dapat dilanjutkan atau dapat dihentikan dengan menyimpan jaringan
yang telah direndam dalam larutan Carnoy tersebut dalam refrigrator dengan suhu 40C.
Jaringan tersebut dapat digunakan sampai 2 - 3 minggu.
4. Jaringan diambil dan dikeringkan dengan menyentuhkan kertas tissue agar larutan
fiksatif hilang.
5. Jaringan ditempatkan dalam gelas obyek cekung dan ditambahkan dengan 3 – 4 tetes
 asam asetat 50%.
6. Jaringan digerak-gerakkan secara hati-hati dengan menggunakan pisau bedah hingga
terbentuk suspensi sel (warna larutan menjadi keruh).
7. Suspensi sel tersebut dihisap dengan pipet tetes lalu teteskan diatas gelas preparat yang
telah direndam dalam alkohol absolut dan ditempatkan di atas hot plate dengan suhu 45 –
500C kemudian hisap kembali dengan cepat hingga terbentuk ring.
Pewarnaan Preparat

1. Sebanyak 2 tetes larutan A dan 1 tetes larutan B (2 : 1) diteteskan di atas preparat lalu
dicampur dan disebarkan ke seluruh permukaan gelas preparat dengan menggunakan
tusuk gigi.
2. Preparat ditempatkan dalam box staining dengan suhu 40 – 450C dibiarkan selama 20
menit atau sampai warnanya berubah menjadi kuning kecoklatan.
3. Preparat diangkat dan dibilas dengan akuades. Biarkan kering udara.
4. Preparat diamati dibawah mikroskop.
Contoh Preparat

A B

Gambar 2. Contoh hasil preparasi nukleolus pada ikan patin jambal (A) dan
patin nasutus (B).
Tabel 2. Jumlah nukleolus ikan pada berbagai tingkat ploidi.
Jumlah Nukleolus
Spesies Haploid Diploid Triploid

1. Mas (Cyprinus carpio) 1 2 3

2. Nila (Oreochromis niloticus) 2 4 6

3. Mas koki (Carassius

2 4 6
auratus)
PEMERIKSAAN GONAD METODE ASETOKARMIN
I. PENDAHULUAN
Identifikasi jenis kelamin ikan perlu dilakukan sedini mungkin. Dalam kegiatan
budidaya, pembedaan jenis kelamin ini sangat penting karena terkait langsung dengan proses
– proses selanjutnya, selain itu juga faktor efisiensi (waktu, biaya dan tenaga).
Teknik pembedaan jenis kelamin antara lain dilakukan dengan pemeriksaan ciri-ciri
kelamin dan identifikasi gonad. Identifikasi gonad untuk ikan dewasa dapat dilakukan dengan
mudah karena ukuran gonad yang relatif besar, namun untuk gonad yang berukuran kecil
(ikan muda) biasanya harus melalui metoda khusus.
Salah satu teknik dalam pemeriksaan gonad ikan-ikan kecil yaitu dengan pewarnaan
gonad menggunakan larutan asetokarmin. Asetokarmin adalah larutan pewarna yang
digunakan untuk mewarnai jaringan gonad untuk pemeriksaan dengan mikroskop. Metoda ini
memiliki beberapa kelebihan antara lain praktis, mudah dan cepat pengerjaannya, tidak perlu
peralatan yang khusus, dan relatif murah.
Salah satu tujuan dalam membedakan jenis kelamin ikan antara lain untuk menguji
hasil ginogenesis, androgenesis, dan sebagainya.

II. BAHAN DAN ALAT

Bahan

1. Ikan uji 2. Karmin (Carmine)

2. Asam asetat 45% 3. Akuades

Alat

1. Timbangan 5. Hot plate

2. Pipet tetes 6. Gelas objek

3. Mikroskop 7. Gelas penutup

4. Alat bedah 8. Kertas saring

III. PROSEDUR KERJA :

1. Larutkan 0.6 gr bubuk karmin dalam 100 ml asam asetat 45% (45 ml asam asetat + 55
ml akuades).
2. Larutan tersebut didihkan selama 2 - 4 menit, kemudian didinginkan dan disaring dengan
menggunakan kertas saring untuk memisahkan partikel kasarnya.
3. Pewarnaan dilakukan dengan cara memberikan beberapa tetes larutan asetokarmin pada
gonad ikan yang telah dicacah dan diletakkan diatas gelas objek.
4. Setelah didiamkan beberapa menit, ditutup dengan gelas penutup dan diamati di bawah
mikroskop.

Contoh Preparat

(A) (B)
Gambar 4. Contoh hasil pemeriksaan gonad ikan betina (A) dan jantan (B)
pada ikan Nila.