UJI PROTEIN METODE LOWRY

PROTEIN TEST BY LOWRY METHOD

Rr. Bhintarti Suryohastari1), Maulana Malik Assayyidin2), Puri Dwi2),
Aditya Rizky Maulana, Alfathan Lutfi, Eka Novia Mahesti, Marita Yuni Fitriadi.
Rahma Qurrotu A’yun 3).
1)
Dosen Praktikum Biologi Molekular UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2)
Asisten Dosen Praktikum Biologi Molekular UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3)
Mahasiswa Program Studi Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Abstrak

Protein merupakan suatu polipeptida dengan Berat Molekul (BM) yang sangat bervariasi dari 5000 KD sampai
lebih dari satu juta KD yang tersusun atas asam amino. Praktikum ini bertujuan agar mahasiswa mampu
melakukan isolasi protein dan mampu menentukan kadar protein pada sampel tertentu. Uji protein ini
menggunakan Metode Lowry yang mengkombinasikan pereaksi biuret dengan pereaksi lain (Folin-
Ciocalteauphenol) yang bereaksi dengan residu tyrosine dan tryptophan dalam protein. Alat dan bahan yang
digunakan antara lain mikrotube, mikropipet, tabung reaksi, pipet, kuvet, spektrofotometer, BSA, pereaksi A
dan B, folin, aquades dan larutan kalibrasi. Sampel diambil 1ml yang ditambahkan dengan larutan A dan B
kemudian divortex. Setelah itu larutan ditambahkan 0.5 ml reagen folin dan kembali di vortex. Lalu diukur
kadar protein dengan alat Spektrofotometri UV. Hasil menunjukkan bahwa panjang gelombang maksimal yang
dihasilkan sebesar 774.05 nm denan nilai absorbansi tertinggi sebesar 2970 dengan konsentrasi 160 ppm. Pita
protein yang terlihat paa hasil SDS-PAGE terdapat 4 pita protein dengan berat molekul 0,0666666567 kDa,
0,0666666567 kDa, 0,1111111111 kDa dan 0,1777777778 kDa. Hal ini dapat disimpulkan bahwa semakin
tinggi konsentrasi larutan maka akan semakin tinggi nilai nilai absorbansinya.
Kata kunci : Protein, Metode Lowry, Spektrofotometri UV

Abstract

Protein is a polypeptide with a molecular weight (Mw) that varies greatly from KD 5,000 to more than one
million KD composed of amino acids. Practicum is intended that the students were able to isolate the protein
and were able to determine the protein content on a particular sample. This protein assay using Lowry method
that combines the biuret reagent with another reagent (Folin-Ciocalteauphenol) which reacts with tyrosine and
tryptophan residues in proteins. Tools and materials used, among others mikrotube, micropipette, test tubes,
pipettes, cuvette, spectrophotometers, BSA, reagents A and B, Folin, distilled and calibration solutions. Samples
were taken 1ml is added to the solution A and B later in the vortex. After the solution was added 0.5 ml of
reagent Folin and vortex it. Then the protein content is measured by means of UV spectrophotometry. The
results showed that the wavelength of maximum generated at 774.05 nm absorbance value primarily to a high
of 2970 at a concentration of 160 ppm. Protein bands are visible on the results of the SDS-PAGE there are 4
Ribbon protein with molecular weight 0.0666666567 kDa, 0.0666666567 kDa, 0.1111111111 kDa and
0.1777777778 kDa. It can be concluded that the higher the concentration, the higher the value of an
absorbance values.
Keywords: Protein, Lowry method, UV spectrophotometry

PENDAHULUAN aktivitas biologisnya. Banyak agensia yang

Protein merupakan suatu
polipeptida dengan Berat Molekul (BM)
yang sangat bervariasi dari 5000 KD
sampai lebih dari satu juta KD karena
molekul protein yang besar, protein sangat
mudah mengalami perubahan fisis dan
menyebabkan perubahan sifat alamiah dari
protein seperti panas, asam, basa, solven
organik, garam, logam berat, radiasi sinar
radioaktif (Sudarmadji, 1996).
Protein tersusun atas asam amino.
Asam amino merupakan unit pembangun

1
protein yang dihubungkan melalui ikatan
peptida pada setiap ujungnya. Dari struktur
umumnya, asam amino mempunyai dua
gugus pada tiap molekulnya, yaitu gugus
amino dan gugus karboksil, yang
digambarkan sebagai struktur ion dipolar.
Gugus amino dan gugus karboksil pada
asam amino menunjukkan sifat-sifat
spesifiknya. Karena asam amino
mengandung kedua gugus tersebut,
senyawa ini akan memberikan reaksi kimia
yang yang mencirikan gugus-gugusnya.
( Hawab. 2004).
Ada beberapa metode yang biasa
digunakan dalam rangka penentuan
konsentrasi preotein, yaitu metode Biuret,
Lowry, dan lain sebagainya. Masing-
masing metode mempunyai kekurangan
dan kelebihan. Pemilihan metode yang
terbaik dan tepat untuk suatu pengukuran
bergantung pada beberapa faktor seperti
misalnya, banyaknya material atau sampel
yang tersedia, waktu yang tersedia untuk
melakukan pengukuran, alat
spektrofotometri yang tersedia (VIS atau
UV).
Reagen pendeteksi gugus-gugus
fenolik seperti reagen folin dan ciocalteu
telah digunakan dalam penentuan
konsentrasi protein oleh Lowry (1951)
yang kemudian dikenal dengan metode
Lowry. Dalam bentuk yang paling
sederhana reagen folin ciocalteu apat
mendeteksi residu tirosin (dalam protein)
karena kandungan fenolik dalam residu
tersebut mampu mereduksi fosfotungsat
dan fosfomolibdat, yang merupakan
konstituen utama reagen folin ciocalteu,
menjadi tungsten dan molibdenum yang
berwarna biru. Hasil reduksi ini
menunjukkan puncak absorbsi yang lebar
pada daerah merah. Sensitifitas dari
metode folin ciocalteu ini mengalami
perbaikan yang cukup signifikan apabila
digabung dengan ion-ion Cu.
Metode Lowry mengkombinasikan
pereaksi biuret dengan pereaksi lain
(Folin-Ciocalteauphenol) yang bereaksi
dengan residu tyrosine dan tryptophan
dalam protein. Reaksi ini menghasilkan
warna kebiruan yang bisa dibaca di antara
500 – 750 nm, tergantung sensitivitas yang
dibutuhkan. Akan muncul puncak kecil di
sekitar 500 nm yang dapat digunakan
untuk menentukan protein dengan
konsentrasi tinggi dan sebuah puncak
besar disekitar 750 nm yang dapat
digunakan untuk menentukan kadar
protein dengan konsentrasi rendah. Metode
ini lebih sensitif untuk protein konsentrasi
rendah dibanding metode biuret.
(Soeharsono, 2006). Menurut Hawab
(2004) dalam metode ini terlibat 2 reaksi,
yaitu awalnya, kompleks Cu(II)-protein
akan terbentuk sebagaimana metode
biuret, yang dalam suasana alkalis Cu(II)
akan tereduksi menjadi Cu(I). Ion Cu+
kemudian akan mereduksi reagen Folin-
Ciocalteu, kompleks phosphomolibdat
phosphotungstat (phosphomolyb
dotungstate), menghasilkan heteropoly
molybdenum blue akibat reaksi oksidasi
gugus aromatik (rantai samping asam
amino) terkatalis Cu, yang memberikan
warna biru intensif yang dapat dideteksi
secara kolorimetri.
Salah satu alat yang dapat
mengukur absorban dari larutan yang
berwarna adalah Spektrofotometer Uv-Vis.
Spektrofotometri UV-Vis merupakan
gabungan antara spektrofotometri UV dan
Visible. Alat ini menggunakan dua buah
sumber cahaya yang berbeda, yaitu sumber
cahaya UV dan sumber cahaya Visible.
Larutan yang dianalisis diukur serapan
sinar ultra violet atau sinar tampaknya.
Konsentrasi larutan yang dianalisis akan
sebanding dengan jumlah sinar yang
diserap oleh zat yang terapat dalam larutan
tersebut.
Spektrofotometri UV-Vis adalah
anggota teknik analisis spektroskopik yang
memakai sumber REM (radiasi
elektromagnetik) ultraviolet dekat (190-
380 nm) dan sinar tampak (380-780 nm)
dengan memakai instrumen
spektrofotometer. Spektrofotometri UV-
2
Vis melibatkan energi elektronik yang
cukup besar pada molekul yang dianalisis,
sehingga spektrofotometri UV-Vis lebih
banyak dipakai untuk analisis kuantitatif
dibandingkan kualitatif. Praktikum ini
Teknik Spektrofotometri seperti yang tertera pada gambar.
(Sumber : dualbeamspectromete.com)
Protein-protein dapat dipisahkan
berdasarkan berat molekul. SDS-Page
(Sodium Dodocyl Sulfate –Polyakrilamid
Gel Electrophoresis) adalah teknik
elektroforesis yang sering digunakan
dalam analisis protein di laboratorium.
Sampel protein didenaturasi dan dicampur
dengan SDS (yang merupakan deterjen
anionic) dengan akibat kompleks protein
deterjen bermuatan negative dan protein
yang lebih besar mempunyai muatan
negative yang lebih besar. Komplek
protein-deterjen itu akan dibawa oleh
medan listrik kea rah kutub positif (anoda).
Gel akrilamide berfungsi sebagai dasar
atau alas dari gerakan sampel protein.
Konsentrasi akrilamide menentukan
ukuran pori-pori gel dan ukuran pori pori
gel menentukan
MATERIAL DAN METODE
Bahan-bahan yang digunakan
dalam praktikum ini antara lain akuades,
Pereaksi A yang terbuat CuSO4 1% dalam
1% NaK-Tartat, Pereaksi B yang terbuat
dari Na2CO3 2% dalam 0,1 N NaOH , 0,1
bertujuan agar mahasiswa mampu
melakukan isolasi protein dan mampu
menentukan kadar protein pada sampel
tertentu.
jarak yang ditempuh oleh kompleks
protein SDS. Jadi beberapa faktor yang
ditentukan untuk memaksimalkan
pemisahan protein-protein melalui teknik
SDS-Page, antara lain kadar SDS,
Konsentrasi gel akrilamide dan ukuran gel
nya. Kemurnian sampel protein dan jumlah
sampel yang diletakkan pada el, voltage
yang digunakan pada alat elektroforesis
dan selama medan listrik dihidupkan.
Gel disusun oleh akrilamida dan
N’, N’ metilen akrilamida yang
berpolimerisasi melalui radikal bebas
dengan bantuan katalisator N,N’. Prinsip
analisis SDS-PAGE yaitu pemisahan
protein berdasarkan ukuran molekul.
(Dun,1989)
N Reagen Folin, larutan BSA dan larutan
sampel standar.
Alat-alat yang digunakan dalam
praktikum ini antara lain 6 buah tabung
reaksi, Adjustable mikropipet, Tip, Kuvet,
Vortex, dan Spektrofotometri UV.
Uji Kualitatif Protein
3
 Larutan sampel dan BSA dengan
masing-masing konsentrasi 0, 10, 20 40,
80, 100 dan 160 ppm dimasukkan ke
dalam tabung reaksi dan ditambahkan
dengan akuades hingga 1 mL. Masing-
masing tabung kemudian ditetesi dengan
Pereaksi A dan B dengan total volume
campuran adalah 5 mL. Tabung divortex
selama beberapa saat. Kemudian, masing-
masing tabung ditetesi Reagen Folin
sebanyak 0,5 mL. Setelah itu, divortex
kembali selama beberapa saat dan seluruh
larutan diinkubasi selama 30 menit dalam
suhu ruang. Bahan yang positif
mengandung protein akan berwarna biru
kehijauan.
Uji Kadar Protein dengan
Spektrofotometri UV
Spektrofotometri dipersiapkan
terlebih dahulu. Disiapkan kuvet untuk
menampung larutan yang akan dianalisa.
Larutan sampel dimasukkan ke dalam
kuvet hingga sedikit penuh. Kuvet
dimasukkan ke dalam Spektrofotometri
dengan bagian kaca yang bening
menghadap ke arah kanan dan kiri. Alat
dijalankan dengan panjang gelombang
sekitar . Akan terlihat kurva standar dari
seluruh larutan sampel yang telah
dimasukkan. Titik tertinggi dari kurva
dijadikan batas acuan serapan gelombang
yang akan diterapkan pada larutan yang
akan diujikan. Terakhir, data dianalisa
untuk melihat kadar protein yang
terkandung di dalam larutan berdasarkan
panjang gelombang yang terserap.
Uji Kadar Protein dengan SDS-PAGE
Keberadaan protein pada sampel
dianalisis melalui teknik pemisahan
protein berdasar berat molekul, dengan
menggunakan elektroforesis SDS-PAGE
pada gel poliakrilamid 17%. Pencetakan
gel poliakri-lamid dengan memposisikan
bahan pembentuk gel di antara dua
lempeng kaca. Larutan
resolving/separating gel dimasukkan ke
dalam ruang di antara dua lempeng kaca
dengan menggunakan mikropipet sampai
batas tertentu atau kurang lebih tiga
perempat dari tinggi lempeng kaca.
Selanjutnya ditambahkan akuades hingga
penuh agar permukaan gel menjadi rata.
Larutan stacking gel disiapkan pada saat
resolving/separating gel telah mulai
memadat. Akuades yang berada di atas
resolving/separating gel dibuang,
kemudian larutan stacking gel dimasukkan
di antara dua lempeng kaca. Bagian
permukaan stacking gel dipasang sisir
pembentuk sumuran. Lempeng kaca yang
berisi gel yang telah memadat dipindahkan
ke dalam tanki elektroforesis. Larutan
running buffer dimasukkan hingga
memenuhi permukaan lempeng kaca dan
sisi bagian luar lempeng kaca terendam
hingga kurang lebih setinggi 4 cm atau
sampai meren-dam bagian bawah gel
poliakrilamid. Sampel dengan volume 10
μl dimasukkan ke dalam sumuran yang
telah dicetak oleh sisir pada gel
poliakrilamid. Elektroforesis dijalankan
pada tegangan 150 volt selama kurang
lebih 1 jam. Visualisasi hasil elektroforesis
SDS-PAGE dilakukan dengan
menggunakan pewarna CBB. Pewarnaan
dilakukan setelah gel poli-akrilamid
dilepaskan dari kedua lempeng kaca.
Perendaman gel poliakrilamid hasil
elektro-foresis dalam larutan CBB
dilakukan selama kurang lebih 24 jam di
atas shaker. Selanjutnya gel poliakrilamid
dimasukkan ke dalam wadah yang larutan
destaining selama 15 menit di atas shaker.
Pada gel poliakrilamid yang telah
memperlihatkan adanya pita-pita profil
protein, dilakukan pembilasan dengan
akuades selama 15 menit di atas shaker.
Selanjutnya dilakukan analisis terhadap
profil protein yang telah terlihat dalam gel
poliakrilamid tersebut.
Analisis terhadap profil protein
yang muncul pada gel poliakrilamid hasil
elektroforesis SDS-PAGE dilakukan
dengan mengidentifikasi BM pada pita-
pita protein yang terbentuk pada masing-
masing sampel. Penentuan nilai-nilai BM
4
pada pita-pita protein dalam sampel
dilakukan dengan menggunakan grafik
kalibrasi berat molekul. Hal tersebut
dilakukan dengan menentukan jarak
migrasi sampel atau nilai Retardation
Factor (Rf). Nilai Rf dari masing-masing
pita yang muncul pada gel hasil
elektroforesis SDS-PAGE, dihitung
dengan rumus: Rf sama dengan jarak
pergerakan protein dari tempat awal/ jarak
pergerakan warna dari tempat awal
(Rantam, 2003 dalam Bhintarti,2016).
Nilai Rf yang telah diperoleh kemudian
dimasukkan dalam persamaan regresi
linier y = ax + b, dengan y adalah nilai
berat molekul dan x adalah nilai Rf
sampel. Jika persamaan regresi linier
menghasilkan R2 yang nilainya semakin
mendekati 1, maka persamaan regresi
linier yang diperoleh semakin bagus.
Semakin mendekati 1 menunjukkan bahwa
persamaan tersebut mendekati kepastian
nilai berat molekul dari protein yang
dianalisis.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Serum adalah plasma darah tanpa
fibrinogen. Serum terdiri dari semua
protein (yang tidak digunakan untuk
pembekuan darah) termasuk cairan
elektrolit, antibodi, antigen, hormon, dan
semua substansi exogenous. Serum protein
merupakan salah satu dari tiga jenis
protein di dalam tubuh yang terbentuk dari
asam amino berupa larutan koloidal di
dalam plasma darah (Frandson, 1996).
Preparasi diperlukan sebelum
menggunakan Spektrofotometer, dimana
alat ini merupakan salah satu alat advance
yang memiliki penanganan khusus dalam
penggunaannya.
Pengambilan serum darah diawali
dengan serum darah diambil dari
probandus melalui vena mediana cubital
yang terdapat di lengan atas bagian bawah.
Pengambilan sampel darah dari probandus
dilakukan secara hati-hati dan dilakukan
oleh seseorang yang berkompeten dalam
hal ini sehingga meminimalisir terjadinya
human error terhadap sampel darah.
Lengan bagian atas sebelumnya diberikan
alkohol yang berperan untuk sterilisasi
area tersebut sehingga sampel darah tidak
terkontaminasi. Kemudian sampel darah
diambil sebanyak 3 ml dan dimasukkan
kedalam botol sampel. Waktu pembekuan
ideal yaitu 60 menit, tetapi dapat
disentrifuge dibawah 60 menit asalkan
sampel sudah mengental. Sampel
disentrifuge dengan kecepatan 1300-2000
rpm selama 10 menit, hal ini dilakukan
untuk memisahkan serum dengan bahan-
bahan darah yang lain.
K3-EDTA yang mempunyai
stabilitas yang lebih baik daripada garam
EDTA yang lain karena mempunyai pH
mendekati pH darah. EDTA mencegah
koagulasi dengan cara mengikat Kalsium
(Ca), sehingga EDTA memiliki
keunggulan dibandingkan dengan
antikoagulan lain, yaitu tidak
mempengaruhi sel – sel darah sehingga
ideal untuk pengujian hematologi, seperti
pemeriksaan hemoglobin, hematokrit dan
lainnya. Hal yang harus diperhatikan yaitu
konsentrasi darah yang harus sesuai
dengan jumlah EDTA yang digunakan.
Jumlah EDTA yang kurang, akan dapat
menyebabkan darah mengalami koagulasi,
sebaliknya bila EDTA berlebihan, eritrosit
mengalami krenasi dan trombosit
membesar (Aulia, 2013). Setelah itu
disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm
selama 30 menit untuk mendapatkan
serum darah, sehingga terbentuk 2 lapisan
yaitu cair dan padatan. Supernatan atau
bagian atas merupakan plasma darah yang
mengandung serum darah, sedangkan pelet
atau bagian bawah yang mengendap
merupakan bahan-bahan darah lain seperti
leukosit, trombosit dan eritrosit. Hal ini
dikarenakan berat molekul antara sel-sel
darah mengendap dibawah dna plasma
berada diatas (Marshall dan Halnan,1946).
Serum yang diambil yaitu bagian
atas yang berupa cairan bening agak
kekuningan. Frandson (1981) berpendapat
5
apabila darah menggumpal di dalam suatu spektrofotometri, cahaya dari sumber
tabung reaksi terbentuklah suatu massa cahaya diuraikan dengan menggunaka
padat yang berwarna merah akan tetapi prisma sehingga diperoleh cahaya
bila dibiarkan agak lama gumpalan itu monokromatis yang diserap oleh zat yang
akan berkontraksi dan menghasilkan akan diperiksa. Cahaya monokromatis
cairan kuning supernatan yang dinamakan merupakan cahaya satu warna dengan satu
serum. Pada intinya serum adalah plasma panjang gelombang, sehingga cahaya yang
darah tanpa fibrinogen dan faktor-faktor diserap oleh larutan berwarna dapat
penggumpalan darah. Selain itu Hames diukur. Hubungan antara konsentrasi
(1998), berpendapat bahwa serum adalah dengan cahaya yang diserap dinyatakan
salah satu bagian dari plasma darah yaitu dalam hukum Beer-Lambert. Hukum Beer-
pada protein. protein memiliki molekul Lambert menyatakan pengurangan
yang cukup besar. Jika darah diputar intensitas cahaya monokromatis yang
dalam sentrifuge, maka protein tersebut melalui suatu larutan berwarna
akan mengendap, sisanya berupa cairan berlangsung secara eksponensial dan
bening dan jernih yang disebut serum. bergantung pada panjang larutan yang
Pada praktikum kali ini, serum tersebut dilalui cahaya dan kadar zat dalam larutan.
diukur kandunan kadar proteinnya dengan
alat spektrofotometri. Pada analisa kadar protein metode
lowry ini dilakukan pembuatan kurva
Teknik spektrofotometri telah lama standard (Gambar 2) dan dilanjutkan
digunakan sebagai suatu teknik yang menghitung konsentrasi protein pada
handal untuk deteksi, identifikasi, dan sampel. Sedangkan panjang gelombang
pengukuran kadar senyawa kimia dalam maksimal yang dihasilkan oleh
suatu larutan. Spektrum cahaya yang dapat spektofotometri setelah dilakukan
terlihat oleh mata terentang antara 400 nm pengukuran BSA standar 80 ppm sebesar
sampai 800 nm.Pada teknik 774.05 nm (Gambar 1.).

0.20
774.05nm, 0.18A
0.19
0.18
0.17
0.16
0.15
0.14
A

0.13
0.12
0.11
0.10
0.09
0.08
0.07
450 500 600 700 800 900
nm
Name Description
standar protein_10102016.Sample BSA 80 ppm

Gambar 1. Kurva panjang gelombang yang dihasilkan pada alat spektrofotometri

nm pada sampel BSA standar 80 ppm yang
ditunjukkan dengan puncak gelombang
Pada gambar kurva diatas, dapat
pada kurva. Hal ini menjadikan panjang
dilihat bahwa panjang gelombang
maksimal yang dihasilkan sebesar 774.05

6
 analisis suatu kadar sampel pada
spektrofotometri memiliki panjang
gelombang maksimal yang digunakan pada
gelombang yang berbeda-beda disesuaikan
analisis kadar protein pada praktikum kali
dengan kadar yang dapat dibaca oleh
ini sebesar 774.05 nm. Karena setiap
spektrofotometri.

Tabel 1. Hasil Analisis Spektrofotometer BSA Standar

No Konsentrasi Nilai Absorbansi

. BSA Standar (λ = 774.05 nm)
1. 0 ppm 0
2. 10 ppm 0.016
3. 20 ppm 0.053
4. 40 ppm 0.088
5. 80 ppm 0.192
6. 160 ppm 0.297

Gambar 2. Kurva kalibrasi standar hasil analisis spektrofotometer BSA standar

Absorbance vs concentration - Protein BSA (mgl-1)

0.36 tinggi nilai nilai absorbansinya. Hal ini
0.30 terjadi karena pada prinsip awal 160

0.25
penyerapan cahaya. Semakin tinggi
Absorbance (A)

0.20 80
konsentrasi, semakin pekat warna larutan
0.15
tersebut, dan ini menyebabkan tingginya
0.10 40

0.05 20 bilangan absorbansi. Selain itu juga

0.00 0
10
mengindikasikan protein yang terlarut
0 50 100 150 192
dalam
Specified larutan semakin banyak. Nilai
concentration

Pada metode lowry ini, Cu2+ pada suasana absorbansi tertinggi terdapat pada
basa akan tereduksi menjadi Cu+.
konsentrasi 160 ppm yaitu sebesar 0.297.
Cu+ kemudian akan mereduksi reagen
Folin-Ciocalteu, kompleks Gambar 2. merupakan kurva
phosphomolibdat – phosphotungstat, kalibrasi standar. Fungsi dari pembuatan
menghasilkan heteropoly - molybdenum kurva ini yaitu untuk membuat persamaan
blue akibat reaksi oksidasi gugus aromatik kurva baku y= bx+a. Berdasarkan kurva
(rantai samping asam amino) terkatalis Cu, tersebut serapan maksimal terbaca pada
yang menghasilkan warna biru. Warna biru gelombang 774,05nm. Hal ini menunjukan
yang di hasilkan bergantung pada
bahwa kadar protein yang terkandung
kandungan residu tryptophan dan tyrosine-
dalam sampel tergolong tinggi. Nilai
nya (Soeharsono,2006).
absorbansi dan konsentrasi protein dari
Berdasarkan hasil yang didapat standar BSA diplotkan pada grafik dengan
pada tabel 1 analisis spektofotometer BSA konsentrasi protein sebagai absis (sumbu
standar dapat dilihat bahwa semakin tinggi x) dan absorbansi sebagai ordinat (sumbu
konsentrasi larutan maka akan semakin y), kemudian ditentukan persamaan garis

7
regresinya. Kurva yang terbentuk dijadikan sebagai kurva standar untuk
menentukan konsentrasi protein.

Tabel 2. Hasil Analisi Spektrofotometer Sampel

No Sampel Konsentrasi Nilai Absorbansi Y = ax+b (x) mg/ml x Faktor Kadar

. Sampel (λ = 774.05 nm) (x) pengenceran protein %
1. A1 0 ppm 0.174 86.73 2.08 x 106 8.673
2. A2 10 ppm 0.165 81.98 1.96 x 106 8.198
3. A3 20 ppm 0.170 84.62 84.62 x 104 8.462
4. A4 40 ppm 0.015 2.78 2.78 x 104 0.278
5. U1 80 ppm -0.006 -8.29 -8.29 x 104 -0.829
6. A6 160 ppm 0.019 4.90 4.90 x 104 0.490

Pada tabel di atas dapat dilihat bahwa nilai absorbansi tertinggi sampel pada konsetrasi 0 ppm
sebesar 0.174, kemudian sampel dengan konsentrasi 20 ppm sebesar 0.170 dan konsentrasi
10 ppm memiliki nilai absorbansi 0.165. Hasil ini bertolak belakang dengan hasil pada tabel 1
yang mengatakan bahwa semakin tinggi konsentrasi larutan maka akan semakin tinggi nilai
panjang gelombangnya. Hal ini disebabkan oleh, pada konsentrasi 0,10,20 ppm sampel masih
berwarna sangat biru walaupun sudah dilakukan pengenceran 10000 kali. Sehinga hal ini
sangat berdampak pada hasil absorbansi yang dibaca oleh spektrofotometri. Pada persamaan
y = ax+b, nilai a sebesar 0.001894 dan nilai b sebesar 0.009717. dari persamaan diatas dapat
dilihat bahwa semakin besar nilai absorbansi maka semakin besar pula nilai x yang
didapatkan, hal ini mempenaruhi hasil akhir x yang dikalikan dengan faktor pengenceran.
Faktor pengenceran kelompok 1 dan 2 sebanyak 24000 kali. Sedangkan kelompok 3-6
sebanyak 10000 kali. Hasil yang didapatkan kelompok 1 dan 2 mendapatkan hasil terbesar
yaitu 2.08 x 106 dan 1.96 x 106.

Analisis Profil Defensin

Hasil elektroforesis SDS-PAGE pada gel
poliakrilamid 12% memperlihatkan adanya
pita-pita protein yang terdapat pada
masing-masing sumuran. Pada sumuran 6
dan 7 tampak pita-pita protein yang
kemudian dilakukan pengukuran terhadap
jarak antar pita protein yang menghasilkan
nilai Rf. Pada sumuran 6 terdapat 2 pita
protein yang terlihat dan pada sumuran 7
terdapat 2 pita protein yang terlihat.
Sampel diletakan dalam 7 sumuran yang
diberikan urutan D2, D1, D3, S2, A1, A4
dan A4.

8
9
 A4 A4 A1 S2 D3 D1 D2
A2

0,1777777778 kDa

0,0666666567 kDa

0,0666666567 kDa

0,1111111111 kDa

Gambar. 1 Profil SDS-Page pada urutan D2, D1, D3, S2, A1, A4 dan A4.

Tabel 1. Nilai Rf terhadap Log BM

Pita Protein Jarak Pita Jarak Tracking Rf Log BM

Sampel 4 Protein dari Dye (cm)
Batas atas Gel
Pemisah (cm)
1 0,3 4,5 0,0666666567 2,30103
2 0,3 4,5 0,0666666567 2,06069784
3 0,5 4,5 0,1111111111 1,97081161
4 0,8 4,5 0,1777777778 1,81954394
elektroforesis SDS-PAGE dala gel
poliakrilamid 12% memperlihtkan
Pada gel poliakrilamid 12% hasil
intensitas warna yang cukup jelas namun
SDS PAGE terdapat pita-pita protein yang
hanya seperti bayang-bayang berwarna
dapat dihitung berat molekulnya.
biru. Selain itu, Ns-A4 dan Ns-A4 yang
Penentuan berat molekul terhadap sampel
memiliki berat molekul 0,0666666567
darah yang telah diambil pada tiap sampel
pita-pita protein tersebut tampak pada
difokuskan pada pita-pita dengan berat
urutan pertama dari atas. Pita-pita protein
molekulnya dibawah 0,444444444 kDa.
dengan berat molekul 0,1111111111 dan
Pita protein dengan berat molekul
0,1777777778 berada pada urutan kedua
0,444444444 kDa pada hasil
dari atas. Berdasarkan data tersebut, maka

10
didapatkan 4 buah pita protein yang
tampak pada hasil analisis dengan
menggunakan elektroforesis yang
digunakan untuk menentukan berat
molekul yang terdapat pada tiap sampel.
Berat molekul pada tiap sampel ditentukan
melalui nilai Rf dari masing-masing pita
protein yang terlihat yaitu A4 dan A4.
Pada praktikum ini tidak menggunakan
marker Page-ruler Low Range Unstained
Protein Ladder sebagai standar yang
dapat dihitung.
Perhitungan berat molekul terhadap
pita-pita protein yang muncul pada sampel
A4 dan A4 yang muncul pada gel
poliakrilamid 12% hasil SDS-PAGE
menghasilkan nilai Rf dan Log BM pada
masing-masing sampel (Tabel). Hasil
analisis terhadap pita-pita protein yang
muncul pada hasil SDS-PAGE
menunjukan bahwa pada sampe darah
terdapat 4 pita protein yang terlihat yaitu
pada A4 dan A4. Pada bagian lain tidak
tampak pita protein, hal ini disebabkan
karena ketebalan pita protein yang terdapat
pada sampel tersebut. Hal lain juga tampak
pada bagian paling atas yang tampak
samar-samar sehingga pita protein tidak
tampak dan tidak dapat diukur. Hal ini
disebabkan karena pita protein hasil SDS-
PAGE terlalu tipis. Tebal atau tipisnya pita
protein dapat disebabkan oleh kesalahan
dalam pengukuran perbandingan larutan
yang digunakan sehingga menghasilkan
pita protein yang terlalu tebal atau bahkan
terlalu tipis.
Pada tabel di atas dapat dilihat
bahwa nilai absorbansi tertinggi sampel
pada konsetrasi 0 ppm sebesar 0.174,
kemudian sampel dengan konsentrasi 20
ppm sebesar 0.170 dan konsentrasi 10 ppm
memiliki nilai absorbansi 0.165. Hasil ini
bertolak belakang dengan hasil pada tabel
1 yang mengatakan bahwa semakin tinggi
konsentrasi larutan maka akan semakin
tinggi nilai panjang gelombangnya. Hal ini
disebabkan oleh, pada konsentrasi 0,10,20
ppm sampel masih berwarna sangat biru
walaupun sudah dilakukan pengenceran
10000 kali. Sehinga hal ini sangat
berdampak pada hasil absorbansi yang
dibaca oleh spektrofotometri. Pada
persamaan y = ax+b, nilai a sebesar
0.001894 dan nilai b sebesar 0.009717.
dari persamaan diatas dapat dilihat bahwa
semakin besar nilai absorbansi maka
semakin besar pula nilai x yang
didapatkan, hal ini mempenaruhi hasil
akhir x yang dikalikan dengan faktor
pengenceran. Faktor pengenceran
kelompok 1 dan 2 sebanyak 24000 kali.
Sedangkan kelompok 3-6 sebanyak 10000
kali. Hasil yang didapatkan kelompok 1
dan 2 mendapatkan hasil terbesar yaitu
2.08 x 106 dan 1.96 x 106.
KESIMPULAN
Pada uji protein ini didapatkan
hasil absorbansi tertinggi pada BSA
standar konsentrasi 160 ppm sebesar
0.297. Sedangkan pada sampel pada
konsentrasi 0 ppm sebesar 0.174 dengan
panjang gelombang maksimal sebesar
774.05 nm. Pita protein yang terlihat paa
hasil SDS-PAGE terdapat 4 pita protein
dengan berat molekul 0,0666666567 kDa,
0,0666666567 kDa, 0,1111111111 kDa
dan 0,1777777778 kDa.
DAFTAR PUSTAKA
11
Alberida, H. 2003. Struktur Protein
Membran. Jurnal Eksakta, Vol. 1,
No. 1, Februari 2003, Hal. 65-75.
Aulia, Rienda. 2013. Antikoagulasi:
EDTA.
Kesmas press. Jakarta
Bhintarti,RR. 2016. Analisis Protein
Defensin Dari Biji Jinten Hitam
Pada Mencit Yang Diberi Jinten
Hitam Melalui Teknik SDS-PAGE.
Jurnal Alkauniyah 9(1), UIN
Jakarta.
Frandson, R. D. 1996. Anatomi dan
Fisiologi Ternak, edisi keempat.
Gadjah Mada University Press.
Yogyakarta
Guyton, Arthur C. & John E. Hall.
1997.Buku Ajar Fisiologi
Kedokteran, edisi 9. Editor: Irawati
Setiawan. EGC. Jakarta
Hames, B.D., 1998. Gel Electrophoresis of
protein. Oxford University Press.
New York
Jusuf.2001. Genetika I: Struktur dan
Ekspresi gen. Sagung Seto. Jakarta
Girindra, A. (1986). Biokimia I. Gramedia,
Jakarta.
Hawab, HM. 2004. Pengantar Biokimia.
Jakarta : Bayu Media Publishing.
Marshall, F. H. and E. T. Halnan. 1948.
Physiology of Farm Animal.
Cambridge at The University
Press, New York
Siti Sulastri dan Susila K. (2006).
Pembentukan Asosiasi Ion Untuk
Analisis Ion Raksa dalam Larutan
Secara Spektrofotometri. Laporan
Penelitian. Yogyakarta: FMIPA
UNY
Soeharsono. 2006. Biokimia 1.
Yogyakarta:
UGM Press
Sudarmaji, Slamet, dkk. (2007). Analisis
bahan Makanan dan Pangan.
Penerbit Liberty.
12