AMPLIFIKASI cDNA

LAPORAN PRAKTIKUM
disusun untuk memenuhi salah satu tugas mata kuliah Biologi Molekuler dengan
dosen pengampu :
Dr. Hj. Any Fitriani, M.Si
Dr. Diah Kusumawaty, M.Si
Dr. Topik Hidayat, M.Si

oleh:
Kelompok 1
Decyana Wahyudin (1401721)
Eka Cahya (14)
Fajar Sukma (1404946)
Kezia Reinaria (1407073)
Rai Irtifaul (1403870)

PROGRAM STUDI BIOLOGI

DEPARTEMEN PENDIDIKAN BIOLOGI
FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA
2017
A. Judul
Amplifikasi cDNA

B. Tujuan
1. Mengetahui perbedaan ekspresi dari primer Myd 88 pada amplifikasi
hasil cDNA dari dua perlakuan pada Osphronemus goramy

C. Waktu Pelaksanaan
Hari, Tanggal : Kamis, 25 Maret 2017
Waktu Pelaksanaan : 07.00 – 16.00
Tempat : Laboratorium Riset FPIMA B UPI

D. Latar Belakang
Asam ribonukleat atau RNA adalah asam nukleat beruntai tunggal
yang tersusun atas monomer-monomer nukleotida atau polinukleotida
dengan gula ribosa. Setiap nukleotida disusun oleh tiga bagian yaitu basa
nitrogen, gula pentosa dan gugus fosfat. Urutan dari basa-basa nitrogen
dapat mengkode suatu informasi genetik. Molekul RNA pada sel eukariot
sangat berperan penting dalam sintesis protein, diantaranya adalah mRNA,
tRNA, rRNA, dan snRNA. (Campbell dkk, 2010: 93).
Isolasi merupakan suatu prosedur yang digunakan untuk
memisahkan suatu bagian dari bagian lain dengan tujuan tertentu. Isolasi
RNA digunakan untuk memisahkan RNA dari zat lain sehingga dihasilkan
RNA murni. Menurut Dale&Schantz (2002), secara umum terdapat tiga
dasar persyaratan isolasi RNA, yang pertama adalah melisiskan membran
sel untuk mengekspos RNA, yang kedua adalah pemisahan RNA dari
molekul lainnya seperti DNA, lipid, protein, dan karbohidrat, yang terakhir
adalah pemulihan RNA dalam bentuk murni.
Prosedur Isolasi RNA harus dilakukan dalam kondisi RNase-Free
artinya sample yang akan diisolasi RNAnya harus bebas dari kontaminasi
dengan Ribonucleases (RNase). Peralatan yang dipergunakan pun harus
 terlebih dahulu diautoclaf atau ditreatment untuk mencegah kontaminasi
RNase. Selama melakukan isolasi RNA, Peneliti harus menggunakan
sarung tangan baru untuk melindungi peneliti dan melindungi RNA hasil
isolasi dari nucleases yang terdapat pada kulit terutama telapak tangan.
Setiap pekerjaan dengan RNA haruslah menjaga kesterilan karena struktur
RNA yang mudah terdegradasi.
Oleh karena kestabilan dari RNA sangat rentan sehingga mudah
sekali terdegradasi oleh RNase. Maka dari itu untuk berkerja dengan RNA
secara langsung menjadi kurang efisien karena membutuhkan tingkat
kehati-hatian yang cukup tinggi. Sehingga menggunakan cDNA dalam
beberapa kegiatan molekuler cenderung lebih aman dibandingkan RNA
(mRNA) secara langsung. Oleh karena itu, cara yang dianggap paling
efektif dan efisien ketika ingin berkerja dengan RNA, yaitu dengan
menggunakan sekuens komplemen dari mRNA tersebut yang selanjutnya
dalam prosesnya menghasilkan cDNA. (Brown, 2009).

E. Alat dan Bahan

Tabel 1. Alat yang digunakan dalam praktikum

No. Nama Jumlah

1. Microtube 2 Ml 1 Buah
2. Microtube 1,5 Ml 1 Buah
3. Micropestle 1 Buah
4. Wadah Es 1 Buah
5. Vortex 1 Buah
6. Centrifuge 2 Buah
7. Tisu Steril Secukupnya
8. Mikropipet Steril 1 Set
9. Tips Steril 1 Set
10. Kuvet 1 Buah
11. Spektrofotometer 1 Buah
12. Elektroforesisi Unit 1 Set
13. Transiluminator UV 1 Set
14. Gunting Steril 1 Buah
15. Pinset Steril 1 Buah
16. Botol Semprot Alkohol 1 Set

Tabel 2. Bahan yang digunakan dalam praktikum

No. Nama Jumlah

1. Trizol 500 µl
2. Jaringan Ikan (Ginjal) 25 Mg Jaringan
3. Kloroform 0,1 ml
4. Isopropanol 400 µl
5. Air Mineral Ddh2o (Amidis) 3 Botol
6. Etoh 70% 1 ml
7. DEPC ± 30 µl
8. Ddh2o 396 µl
9. Agarose 1% 0,5 Gram
10. TAE 50 ml
11. Loading Dye 1 µl
12. Peqgreen 5 µl
13. Formalmide 1 µl
14. Deion 900 ml
15. Alkohol Secukupnya
 F. Cara Kerja

G. Hasil Pengamatan

Tabel . Hasil Elektroforesis sampel cDNA

No Gambar Keterangan
1. Sampel C1 : Kontrol
Sampel C2 : Diberi
Lad
Perlakuan
derSampel C1
123 4 567
Urutan primer
berdasarkan sumur
Dibawah
1. Myd 88
250 bp 2. IL1β
Dibawah
750 bp
3. RT TNFα
4. RT TLRα
5. RT GadpH
6. GadpH
Gambar 1. Hasil elektroforesis sampel cDNA 7. -
(Dokumentas Kelas Biologi C, 2017)
Pita yang muncul pada
agarose C2
1. sumur 3 : pita
berukuran dibawah
250bp
2. sumur 5 : pita
berukuran dibawah
250bp
3. sumur 6 : pita
berukuran 750bp
Pita yang muncul pada
agarose C1
1. sumur 6 : pita
berukuran dibawah
750bp
2. sumur 7 : pita
berukuran dibawah
 250bp

H. Pembahasan
Amplifikasi hasil cDNA ini bertujuan untuk membedakan ekspresi
gen pada sempel hasilcDNA dari RNA spesimen yang diberi perlakuan
dan kontrol. Spesimen yang perlakuan diinjeksi bakteri yang dapat
membuat spesimen stress, dalam hal ini spesimen yang digunakan adalah
Osphronemus gouramy.
Pada amplifikasi ini, kelompok 1 menggunakan primer Myd 88. Gen
Myd 88 memberikan instruksi untuk membuat protein yang terlibat dalam
pemberian sinyal di dalam sel kekebalan tubuh. Protein MyD88 bertindak
sebagai adaptor, menghubungkan protein yang menerima sinyal dari luar
sel ke protein yang mentransmisikan sinyal di dalam sel. Secara khusus,
MyD88 mentransfer sinyal dari protein tertentu yang disebut reseptor
seperti Toll dan reseptor interleukin-1 (IL-1), yang penting untuk respon
kekebalan dini terhadap penyerbu asing seperti bakteri. Sebagai tanggapan
terhadap sinyal dari reseptor ini, protein adaptor MyD88 merangsang
molekul pensinyalan yang menghidupkan sekelompok protein yang
berinteraksi yang dikenal sebagai faktor nuklir-kappa-B. Faktor nuklir-
kappa-B mengatur aktivitas beberapa gen, termasuk gen yang
mengendalikan respons kekebalan tubuh dan reaksi inflamasi tubuh. Ini
juga melindungi sel dari sinyal tertentu yang sebaliknya menyebabkannya
merusak diri sendiri (menjalani apoptosis) (US National Library Of
Medicine). Pada amplifikasi ini, kita bisa melihat apakah ada perbedaan
dari kedua sampel akan kehadiran Myd 88 ini.
Pada gambar hasil pengamatan, sampel yang diberi primer Myd 88
adalah sumur ke 2 (setelah marker) baik pada C1 maupun C2. Hasil yang
ditunjukan oleh gambar C1 adalah amplifikasi dari cDNA sampel kontrol
dan C2 perlakuan. Hasilya tidak teramati perbedaannya. Pada kedua
gambar Myd 88 ini tidak terekspresi, atau masalah dalam teknis terjadi
 sehingga menyebabkan Myd 88 tidak dapat teramati. Jika keduanya
memberikan perbedaan, maka hal ini berkaitan dengan variasi dari
ekspresi dan kondisi lingkungan yang berbeda dari kedua sampel.

I. Kesimpulan
1. Isolat RNA yang paling baik terdapat pada organ hati.
2. Tedapat tiga prinsip kerja pada isolasi RNA, yaitu, penghancuran (lisis),
pemisahan dan pemurnian (Dale&Schantz, 2002).
3. Hasil isolat RNA yang didapatkan dapat dipergunakan dalam sintesis
cDNA

DAFTAR PUSTAKA

Anonym. 2017. MYD88 gene . [Online], Tersedia;

https://ghr.nlm.nih.gov/gene/MYD88