METODE SEQUENCING

HUMAN GENOME
Ratih Dara Syadillah
1113102000003

Teknologi Sequencing DNA Kapasitas Tinggi

Sekuensing DNA atau pengurutan basa DNA merupakan teknik
kunci dalam perkembangan ilmu pengetahuan, di antaranya
genetika, bioteknologi, biologi molekuler, dan genomika (Franca et al.
2002). Sekuensing DNA bertujuan untuk menentukan urutan basa
nitrogen (adenin, guanin, sitosin, dan timin) suatu sampel DNA. Salah
satu contoh aplikasi ambisius teknologi sekuensing DNA yaitu
pengurutan genom manusia melalui proyek yang dikenal Human
Genome Project.
Dalam ilmu pengobatan, sekuensing DNA digunakan untuk
mengidentifikasi, mendiagnosis, dan mengembangkan pengobatan
penyakit genetik. Tahun 1970 merupakan awal pengembangan
sekuensing DNA dengan metode kromatografi. Selanjutnya
diperkenalkan metode sekuensing DNA dengan menggunakan
metode dye-based sequencing (Olsvik et al. 1993).

Teknologi Sequencing DNA Kapasitas Tinggi

Sebelum ditemukannya alat yang mampu membaca
urutan DNA secara paralel dalam jumlah besar, perunutan
basa-basa DNA (sequencing) memakan waktu, tenaga,
dan biaya yang sangat besar. Pemerintah Amerika Serikat,
misalnya, menginvestasikan sekitar USD3,8 miliar (USD5,6
miliar jika memperhitungkan inflasi) untuk mencari urutan
basa DNA manusia yang ukurannya sekitar tiga miliar
pasang basa, yang baru dapat diselesaikan pada 2003
atau sekitar 13 tahun sejak proyek tersebut dicanangkan.

Terdapat dua metode

mengurutkan DNA yaitu :

yang

dikembangkan

untuk

Metode Degradasi Kimia

Metode Pengakhiran Rantai

Kedua teknik ini dikembangkan pada akhir tahun 1970,

yang mampu mengurutkan DNA dengan cepat dan efisien
(Gumilar dkk., 2008).

Metode Maxam Gilbert

Didasarkan pada pembelahan nukleotida oleh bahan kimia
yang spesifik. Metode ini memerlukan :
- DNA untai ganda sehingga tidak memerlukan primer
untuk mensintesis untai baru kembali
- Pemotongan DNA terjadi secara kimia
- Reagen kimia tertentu harus ditambahkan ke dalam
sistem reaksi. Reagen ini bersifat sangat toksik karena
selain memotong DNA dalam tabung juga dapat
memotong DNA dalam tubuh kita.
- Sekuensing dilakukan melalui pelabelan DNA templat
dengan gugus fosfat pada ujung 5.
- DMSO dan dipanaskan pada suhu 90C.
- Pemisahan untai berat dan ringan, dan pemotongan untai
serta autoradiografi untuk membaca urutan DNA hasil
sekuens (Gumilar dkk., 2008).

Metode Sanger
Metode Sanger lebih sering digunakan daripada metode
Maxam-Gilbert. Karena :
- Terbukti secara teknis lebih mudah
- Dapat diterapkan dan digunakan untuk DNA untai panjang.
- Tidak menggunakan reagen toksik sehingga lebih aman.
Prinsip dasar dari metode dideoksi Sanger adalah terjadinya
terminasi rantai nukleotida sebagai akibat adanya nukleotida
dideoksi (ddNTP) (Gumilar, dkk; 2007).
Metode ini memerlukan :
- DNA untai tunggal
- Primer
- dNTP
- ddNTP
- enzim polimerase.

Metode Sanger
Sintesis
DNA secara
enzimatik
terjadi
melalui
pembentukan secara berurut ikatan fosfodiester antara
gugus fosfat ujung 5 bebas dari nukleotida baru dengan
gugus OH dari ujung 3 rantai yang sedang memanjang.
Proses ini berlangsung sepanjang molekul DNA.
Dideoksinuklotida tidak mempunyai gugus OH pada ujung
3-nya, melainkan gugus H. Adanya dideoksinukleotida
menyebabkan sintesis DNA terhenti, karena ikatan difosfat
tidak terbentuk. Pemanjangan rantai akan terhenti pada
titik ini dan basa terakhir di ujung 3 rantainya adalah
sebuah terminator dideoksi.

Metode Sanger
Dalam metode pengurutan Sanger, digunakan empat
macam campuran reaksi dalam pengurutan fragmen DNA.
Tiap campuran reaksi mengandung molekul DNA cetakan
yang akan diurutkan, primer yang telah diberi label dengan
radioaktif, keempat deoksinukleotida, DNA polimerase dan
empat terminator dideoksi (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP).
Jika salah satu dari terminator ini digunakan pada untai
DNA yang baru terbentuk, maka sintesis untai baru ini akan
terhenti, hasilnya adalah semua untai dengan panjang
yang bervariasi pada campuran reaksi akan berakhir
dengan basa yang sama. Untuk melihat ukuran fragmenfragmen hasil sekuensing tersebut dilakukan elektroforesis
menggunakan gel poliakrilamid sehingga akan terjadi
perbedaan migrasi sesuai dengan ukurannya masingmasing.

 Sehingga DNA templatenya

adalah 5 GGATCGGCT 3

PERKEMBANGAN
METODE SEKUENSING
HUMAN GENOME

Generasi Pertama Metode Sanger

Teknologi sekuensing Sanger dan modifikasinya
mendominasi metode sekuensing selama 30 tahun
(Sanger et al. 1997). Panjang sekuen yang dihasilkan
berkisar antara 1.000-1.200 pasang basa (bp) dan tidak
mampu mencapai lebih dari 2.000 bp.
Untuk mendapatkan sekuen yang lebih panjang
dikembangkan metode sekuensing shotgun melalui proyek
sekuensing genom manusia. Pada metode ini, templat
DNA dipotong dengan enzim restriksi lalu fragmen DNA
diklon pada vektor sekuensing dan individu fragmen DNA
setiap klon disekuen terpisah.

Metode Shotgun
Hasil sekuen lengkap dari fragmen DNA yang panjang
dapat diperoleh dengan menjajarkan (alignment) dan
menyambung
(assembly)
sekuen
fragmen
DNA
berdasarkan bagian sekuen yang berkomplemen
(overlapping), yang memungkinkan pemetaan genom
manusia dapat diselesaikan (Gambar 1).

Generasi Kedua Next Generation Sequencing

(NGS)
Filosofi dasar pembentukan mesin NGS diadaptasi dari
metode sekuensing shotgun (Venter et al. 2003; Shendure
et al. 2004). Teknologi ini berpotensi menekan biaya
sekuensing satu genom manusia dan sudah cukup lama
tersedia di pasar. Teknologi NGS membaca templat DNA
secara acak (random) sepanjang seluruh genom dengan
membuat potongan-potongan pendek DNA genom,
kemudian menyambungkannya dengan adapter (potongan
DNA pendek yang didesain khusus untuk tujuan ini) agar
dapat dibaca oleh mesin NGS secara random selama
proses sintesis DNA. Dengan demikian, teknologi NGS
sering disebut dengan sekuensing paralel secara masif
(massively parallel sequencing).

NGS
Panjang bacaan sekuen DNA yang dihasilkan mesin
NGS jauh lebih pendek dibandingkan bila menggunakan
mesin sekuensing dengan metode Sanger. NGS
menghasilkan panjang sekuen DNA antara 50-500 bp.
Karena sekuen yang dihasilkan NGS pendek, sekuensing
setiap fragmen DNA mesti dilakukan lebih dari sekali
ukuran genom (genome sequence coverage). Penerapan
inovasi teknologi NGS berkembang sangat cepat dan
berbagai kemajuan telah dicapai. Tiga teknologi NGS
utama yang tersedia saat ini adalah Roche/ 454
pyrosequencing platform, Illumina Solexa polymerase
sequencing platform, dan ABI/SOLID ligase sequencing
technology.

SANGER VS NGS
Teknologi NGS merupakan revolusi metode sekuensing
dan menghasilkan data sekuen yang luar biasa besar
dalam waktu relatif singkat dibandingkan dengan metode
sekuensing Sanger.

Generasi Ketiga Third Generation sequencing

platforms
Mampu melakukan sekuensing molekul DNA atau RNA,
yaitu HeliScope, Ion Torent, Single Molecule Real- Time
Sequencing (SMRT), dan Oxpord Nanopore. Keunggulan alatalat tersebut adalah mampu membaca urutan molekul DNA
yang berasal dari molekul tunggal. Dengan demikian,
kebutuhan materi awal untuk sekuensing sangat sedikit (< 1
g), baik DNA maupun RNA, dan tidak diperlukan amplifikasi
PCR sehingga dapat terhindar dari kesalahan (bias) yang
disebabkan oleh amplifikasi PCR. Namun, data sekuen yang
dihasilkan (sequence throughput) dari alat sekuensing generasi
ketiga ini lebih rendah dibandingkan yang dihasilkan alat
sekuensing generasi kedua (NGS), selain itu tingkat
kesalahannya masih tinggi.

(a) Pacific Biosciences SMRT (single-molecule real-time) DNA sequencing method. The platform
uses a DNA polymerase anchored to the bottom surface of a ZMW (pictured in cross section).
Differentially labeled nucleotides enter the ZMW via diffusion and occupy the 'detection volume'
(white translucent halo area) or microseconds. During an incorporation event, the labeled nucleotide
is 'held' within the detection volume by the polymerase for tens of milliseconds. As each nucleotide is
incorporated, the label, located on the terminal phosphate, is cleaved off and diffuses out of the
ZMW. (b) Life Technologies FRET sequencing platform uses base fluorescent labeling technology, a
DNA polymerase modified with a quantum dot and DNA template molecules immobilized onto a solid
surface. During an incorporation event, energy is transferred from the quantum dot to an acceptor
fluorescent moiety on each labeled base. Light emission can only emanate from labeled nucleotides
as they are being incorporated. (c) The Oxford nanopore sequencing platform uses an exonuclease
coupled to a modified-hemolysin nanopore (purple, pictured in cross section) positioned within a
lipid bilayer. As sequentially cleaved bases are directed through the nanopore, they are transiently
bound by a cyclodextrin moiety (blue), disturbing current through the nanopore in a manner
characteristic for each base. (d) The Ion Torrent sequencing platform uses a semiconductor-based
high-density array of microwell reaction chambers positioned above an ion-sensitive layer and an ion
sensor. Single nucleotides are added sequentially, and incorporation is recorded by measuring
hydrogen ions released as a by-product of nucleotide chain elongation.

NGS VS Third Generation Sequencing

Platforms
Dengan demikian, dari aspek kuantitas data sekuen yang
dihasilkan (throughput) dan biaya sekuensing, alat
sekuensing generasi ketiga ini belum dapat menandingi
kemampuan alat sekuensing generasi kedua (NGS).

Daftar Pustaka
Gumilar, dkk. (2008). Bioteknologi. Bandung : Jurusan
Pendidikan Kimia FPMIPA UPI
Tasma, I Made. 2015. PEMANFAATAN TEKNOLOGI
SEKUENSING
GENOM UNTUK MEMPERCEPAT
PROGRAM PEMULIAAN
TANAMAN. Balai Besar
Penelitian dan Pengembangan
Bioteknologi dan
Sumberdaya Genetik Pertanian. Bogor :
Indonesia