Alasan penggunaan HPLC-MS untuk analisa Clopidogrel

Dalam jurnal ini, metode yang

sudah divalidasi dan dikembangkan untuk menentukan jumlah
Clopidogrel dalam plasma manusia adalah HPLC yang digabung
dengan MS-MS, dimana menghasilkan
metode yang sederhana, cepat, selektif,
akurat, dan presisi. HPLC mampu mengukur
kadar sampel yang sangat rendah sehinga dapat
digunakan untuk menganalisa kadar atau
konsentrasi obat dalam plasma pada level
mikrogram, nanogram ataupun pikogram
(Johnson & Stevenson,1991).
Kegunaan umum HPLC adalah
untuk
pemisahan sejumlah senyawa organik,
anorganik,
maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian (impurities) dan analisis senyawasenyawa yang tidak mudah menguap (nonvolatil). HPLC paling sering digunakan untuk
menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat
dan protein-protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat
dan lain-lain. HPLC dapat mengatasi kelemahan -kelemahan dari kromatografi cairan pada
umumnya, misalnya viskositas cairan yang relatif lebih besar dibanding dengan viskositas
gas, sehingga HPLC mampu memberikan waktu analisis (5 - 30 menit) yang kurang lebih
sama dengan waktu analisisnya GC.
Metode analisis yang valid telah digunakan untuk kuantifikasi Clopidogrel dan
metabolit utamanya. Metode analisis yang valid ini menyediakan akurasi yang tepat, sensitif,
dan selektif dengan jumlah sampel yang tinggi dan ekonomis secara prosedur, cocok untuk
kebutuhan studi farmakokinetik. Dalam penelitian ini, beberapa parameter farmakokinetik
diuji menggunakan metode HPLC-MS yang sudah divalidasi. Bahkan, semua parameter
validasi dilakukan sesuai dengan pedoman internasional dan dalam batas-batas yang diterima.

Kelebihan High Performance Liquid Chromatografi :

Isolasi zat yang tidak mudah menguap (non volatile)
Isolasi zat yang secara termal tidak stabil
Dapat diopersikan pada suhu kamar
Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran
Sudah digital sehingga penggunaannya cepat, mudah dan lebih praktis
Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis
Resolusi yang baik
Dapat digunakan bermacam-macam detektor
Kolom dapat digunakan kembali
Mudah melakukan "sample recovery"

Kekurangan High Performance Liquid Chromatografi :

Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dulu
Hanya bisa digunakan untuk asam organic
Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradien elusi
Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas

HPLC yang dihubungkan dengan MS mengatasi keterbatasan dari HPLC untuk

mengidentifikasi senyawa, terutama senyawa yang sangat kompleks sehingga resolusi yang
baik sulit diperoleh.
Spektrofotometer UV-VIS

dan

Spektrofotometer UV-VIS menjadi suatu metode analisis farmasetika yang

cepat, simpel dan sensitif, sangat popular untuk pengukuran secara kuantitatif obat
metabolit dalam sampel biologi. Salah satu alasan penting atas
kepopulerannya karena sensitivitas dari metode ini 1-10 g/ml.
Identifikasi kualitatif dari obat atau metabolit menggunakan
spektrofotometri UV-VIS berdasarkan pada panjang
gelombang maksimum yang diabsorpsi (Smith,1981).
Dalam jurnal ini, digunakan untuk uji invitro pada panjang
gelombang 240 nm (Thermo Scientific, Helios, Germany).

Kelebihan :
Panjang gelombang dari sinar UV dapat lebih terseleksi
Caranya sederhana, dapat menganalisa larutan dengan konsentrasi yang sangat kecil
Kekurangan :
Absorpsi nya dipengaruhi oleh pH, larutan, suhu, dan adanya zat pengganggu dan
kebersihan dari kuvet.
Hanya dapat digunakan pada daerah UV yang panjang gelombangnya lebih dari 185
nm.
Pemakaian hanya pada gugus fungsional yang mengandung elektron valensi dengan
energi eksitasi yang rendah
Sinar yang dipakai harus monokromatis.
Alasan Penggunaan Spektrofotometer UV VIS sebagai Detektor
Detektor yang paling banyak digunakan adalah detector ultra violet (UV)/Visible,
fluorometer (terutama untuk zat yang memiliki panjang gelombang eksitasi dan emisi) dan
detektor indeks bias. Detektor HPLC yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm.
Variabel panjang gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan
range yang lebih luas. Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas, terutama pada
kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif jika dibandingkan dengan detektor
UV.
Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar
respons linier yang luas, dan memberi respons untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan

yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu
dapat diperoleh.
MENGHINDARI PENGGUMPALAN SAMPEL
Sampel segera dikumpulkan ke tabung natrium-heparinized dan disentrifugasi pada
5.000 rpm selama 5 menit, dikumpulkan pada suhu 4 C dalam waktu 30 menit. Plasma yang
dihasilkan langsung disimpan pada -70 C sampai analisis. Kondisi bebas methanol
digunakan dalam prosedur ekstraksi untuk menghindari konversi balik metabolit asam
karboksilat Clopidogrel dengan obat induk. Tujuan dari perlakuan ini untuk memperoleh
plasma darah bebas protein menggunakan sodium-heparines ebagai antikoagulan.
Paramater Farmakokinetik
Parameter Farmakokinetik menggunakan metode non kompartemen standar, diantaranya :
- Konsentrasi puncak plasma (Cmax) dan waktu pada konsentrasi puncak plasma (Tmax)
diambil langsung dari data.
- Kadar eliminasi konstan (ke) dihitung dari kemiringan plot semilogaritma dari fase
eliminasi terminal plasma konsentrasi-waktu kurva dihitung dengan regresi linier.
- Waktu paruh eliminasi (t1/2) dihitung dengan menggunakan rumus t1/2 = Ln2 / Ke.
- Daerah di bawah konsentrasi plasma-waktu kurva obat dari AUC0-last dan daerah tak
terhingga (AUC0-) dihitung dengan menggunakan metode trapesium linear.
- Ekstrapolasi tak terhingga dilakukan dengan membagi konsentrasi plasma last dengan
kadar Ke konstan terminal (AUClast inf = Clast / ke).
- AUC0 nilai inf adalah jumlah perkiraan dan ekstrapolasi bagian (AUC 0 inf =
AUC0 last + AUClast inf).