LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

SEL KOMPETEN

NAMA : LENI ALFIONITA

NIM : B41220162
GOLONGAN : A
NO. ABSEN : 04

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI REKAYASA PANGAN

JURUSAN TEKNOLOGI PERTANIAN
POLITEKNIK NEGERI JEMBER
2024
 Pendahuluan

Latar Belakang
Plasmid merupakan molekul DNA berukuran relatif kecil, melingkar, dan
beruntai ganda. Plasmid membawa gen-gen yang terpisah dari kromosom bakteri.
Plasmid digunakan sebagai vektor kloning yang bermanfaat untuk dua tujuan dasar,
yaitu membuat banyak salinan gen tertentu dan memproduksi protein dalam jumlah
besar (Reece dkk., 2011).
Salah satu tahapan yang harus dilakukan dalam kloning gen adalah transformasi
(Brown, 2010). Sel yang digunakan dalam proses transformasi umumnya harus
dibuat menjadi kompeten atau siap ditransformasi. Sel kompeten biasanya dibuat
dari inokulum awal dengan konsentrasi 2% ( v /v) pada nilai OD600 0,4. Inokulum
awal untuk sel kompeten merupakan sel yang telah ditumbuhkan selama 3 hingga
4 jam dengan agitasi 200 – 250 rpm (Sezonov dkk., 2007).
Transformasi dapat dilakukan dengan beberapa metode, yaitu kejutan panas,
elektroporasi (Casali dan Preston, 2003), dan kejutan dingin (Ng, 2009). Metode
transformasi yang paling sering digunakan adalah metode kejutan panas dengan
prinsip kejutan suhu tinggi selama beberapa detik pada sel bakteri sehingga plasmid
dapat masuk ke dalam sel. Metode kejutan panas umumnya dilakukan pada suhu
42oC selama 2 menit (Sambrook dan Russel, 2001).
Efisiensi transformasi dapat dipengaruhi oleh waktu dan suhu kejutan panas.
Kejutan panas dapat dilakukan selama 30 (Inoue dkk., 1990), 45 (Froger dan Hall,
2007), 60, 90 (Hanahan, 1983), atau 240 detik (Yoo, 2010) Selain itu, suhu kejutan
panas dapat dilakukan pada 40o , 42o , 44o (Inoue dkk., 1990), 46o , 48o , 50o ,
atau 52oC (Bergès dan Barreau, 1989). Oleh karena itu, belum terdapat waktu dan
suhu optimum untuk transformasi plasmid kejutan panas. E. coli KY1429 memiliki
waktu kejutan panas optimal 120 detik, sedangkan E. coli KY1445 memiliki waktu
kejutan panas optimal 60 detik (Yoo, 2010).

Tujuan
1. Untuk mempelajari proses transformasi genetik pada sel-sel
2. Untuk mengembangkan teknik-teknik dalam rekayasa genetika
 Metodologi

Alat & Bahan

Alat :
1. Sentrifugasi
2. Alat pemanas
3. Alat pencuci
4. Alat untuk transformasi
5. Alat untuk kultur
Bahan :
1. E-Coli
2. Reagen atau zat kimia (buffer)
3. Medium selektif
4. Larutan transformasi
5. Larutan kalsium
6. Medium pertumbuhan
Prosedur Kerja :
1. Persiapan Bakteri Awal :
- Ambil bakteri yang akan digunakan
- Inokulasi bakteri kedalam medium pertumbuhan dan biarkna tumbuh
hingga mencapai fasel log.
2. Pemisahan Bakteri :
- Sentrifugasi bakteri untuk memisahkan mereka dari medium
pertumbuhan
- Cucibakteri dengan larutan buffer utnuk menghilangkan sisa medium
3. Rendam dalam larutan kalsium :
- Rendam larutan dalam larutan kalsium yang akan membuat membran
sel menjadi lebih permeabel
4. Perlakuan panas singkat :
- Kenakan perlakuan panas singkat pada bakteri yang telah direndam
larutan kalsium.
5. Treansformasi DNA :
- Tambahnkan DNA eksternal yang ingin dimasukkan kedalam bakteri
kedalan larutan kalsium
- Kenakan perlakuan panas lagi setelah penambahan DNA
6. Pemulihan sel :
- Pemulihan bakteri dengan menumbuhkannya pada medium nutrisi
7. Seleksi :
- Identifikasi bakteri yang telah berhasil transformasi mellaui medium
selektif yang mengandung antibiotik atau gen marker
8. Aanalisis :
 - Lakukan analisis untuk memastikan bahwa transformasi berhasil,
misalnya melalui PCR atau sekuen DNA.

Pembahasan

Sel kompeten adalah sel-sel yang telah diubah agar mampu menerima,
memperbaiki, dan mereplikasi DNA asing (misalnya, plasmid atau fragmen DNA
lainnya) dengan efisiensi tinggi. Proses memnuat sel-sel menjadi kompeten disebut
sebagai transformasi, dan ini merupakan langkah penting dalam rekayasa genetika
dan biologi molekuler. Sel-sel yang kompeten memungkinkan peneliti untuk
mengintroduksi DNA asing kedalam sel dan mengamati ekspresi gen yang
dihasilkan.
Tahapan pembuatan sel kompenen melibatkan beberapa langkah penting, maksud
dari setiap tahapan tersebut antara lain sebagai berikut :
1. Pemilihan strain bakteri : Strain bakteri yang digunakan haruslah
kompatibel dengan metode yang digunakan untuk membuat sel kompeten.
2. Pertumbuhan kultur : Bakeri dibiarkan tumbuh hingga mencapai fase log
(logartithmic growth phase) yang merupakan fase dimana bakteri paling
aktif membelah diri.
3. Pemisahan Bakteri : Bakteri dipisahkan dari medium pertumbuhan mellaui
sentrifugasi dan dicui dengan larutan garam atau buffer untuk
menghilangkan sisa medium.
4. Perlakuan Kalsium : Bakteri yang telah dicuci kemudian direndam dalam
larutan kalsium yang memungkinkan membran sel semjadi lebih permeabel
terhadap DNA eksternal.
5. Perawatan Panas : Bakteri yang telah direndam dalam larutan kalsium
kemudian dikenal perlakuan panas singkat untuk memungkinkan DNA
eksternal masuk kedalam sel.
6. Transformasi DNA : DNA eksternal yang ingin dimasukkan kedalam
larutan bakteri yang telah direndam dalam larutan kalsium dan dineai
petlakuan panas.
7. Pemulihan Sel : Setelah transformsi selesai, sel kompeten dipulihkan
dengan cara ditempatkan pada medium nutrisi kaya agar dapat pulih dan
melalui proses pertumbuhan kembali.
8. Seleksi : Sel kompeten yang berhasil mengintegrasikan DNA eksternal
dapat diidentifikasi melalui proses seleksi dengan menggunakan medium
selektif yang megandung antibiotik atau gen marker yang memungkinkan
sel yang berhasil transformasi untuk tumbuh.
 Kesimpulan
Dari penjelasan tahapan pembuatan sel kompeten, dapat disimpulkan bahwa
praktikum sel kompeten merupakan suatu proses laboratorium yang melibatkan
serangkaian langkah untuk menghasilkan sel bakteri yang mampu menerima DNA
eksternal. Praktikum ini dalam bioteknologi dan rekayasa genetika karena
memungkinkan peneliti untuk mengubah sifat-sifat organisme dengan
memasukkan DNA asing kedalam genom mereka. Proses ini melibatkan pemilhan
srrain bakteri, pertumbuhan kultur, perlakuan kalsium, perlakuan panas,
transformasi DNA, pemulihan sel dan seleksi. Keseluruhan proses ini
membutuhkan ketelitian dan kehati-hatian untuk mendapatkan sel kompeen yang
bekualitas.

Daftar Pustaka
Brown, T.A. 2006. Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction. Fifth
Edition. Wiley Blackwell.
Barber, C. (1989). Aging and the Family. Lexington: Lexington Books.
Casali, N. dan Preston, A. 2003. E. coli plasmid vectors: methods and applications.

Humana Press, New Jersey.

Sezonov, G., Joseleau-Pelit, D dan D’Ari, R. 2007. Escherichia coli Physiology in
Luria-Bertani Broth. Journal of Bacteriology. (189)23: 8746-8749.
Sambrook, Joseph and David W. Russell. 2001. Molecular Clonning: A Laboratory
Manual. 3th ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Book 1&2.