PREPARASI BAHAN ELISA

LAPORAN PRAKTIKUM IMUNOLOGI

Oleh:
Meita Ayu Puspitasari
181810401009

JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS JEMBER
2021
 LAPORAN PRAKTIKUM MK IMUNOLOGI 2021
ACARA IX. PREPARASI BAHAN ELISA

Nama : Meita Ayu Puspitasari

NIM : 181810401009
Acara Praktikum : Preparasi Bahan ELISA
Tanggal Praktikum : 28 April 2021
Asisten praktikum : Izza Afakarina
:

1. TUJUAN PRAKTIKUM
Tujuan dari praktikum Preparasi Bahan ELISA adalah sebagai berikut:
 Mengukur kadar IgG pada sampel serum darah manusia terhadap
paparan protein kelenjar saliva nyamuk Aedes albopictus

2. METODE PRAKTIKUM
2.1 Alat
Alat yang digunakan dalam acara praktikum Preparasi Bahan ELISA
adalah sebagai berikut:
- Stirer
- Mikropipet
- Mikrotip
- Beaker glass
- pH meter
- Gelas ukur

2.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam acara praktikum Preparasi Bahan ELISA
adalah sebagai berikut:
- Akuades steril
- Na2CO3
- NaN3
- NaCl
- Na2HPO4
- KH2PO4
- KCl
- Tween 0,5 %
- BSA
- H2SO4

2.3 Cara kerja

- Pembuatan buffer bikarbonat 50 mL
Ditimbang 0,078 gr Na2CO3, 0,01 gr NaN3, dan 0,00146 gr NaHCO3
I
Dimasukkan ketiga bahan tersebut ke dalam gelas beaker
I
Ditambahkan 25 ml DelH2O
I
Distirer hingga homogen
I
Diajust pH hingga 9,6
I
Ditambahkan DelH2O hingga volume total 50 ml
I
Disimpan larutan dalam botol schott
I
Hasil

- Pembuatan PBST 50 ml
Ditimbang 0,4 gr NaCl; 0,072 gr NaH2PO4; 0,012 gr KH2PO4, dan
0,01 gr KCl
I
 Dimasukkan semua bahan yang telah ditimbang ke dalam gelas
beaker
I
Ditambahkan 25 ml H2O steril
I
Distrirer hingga homogen
I
Diajust pH hingga 7,4
I
Ditambahkan H2O steril hingga volume total 50 ml
I
Ditambahkan 25 Tween
I
Distrirer hingga homogen
I
Dimasukkan larutan ke dalam botol schott
I
Hasil

- Pembuatan buffer blocking 10 ml

Ditimbang 0,1 gr BSA
I
Dimasukkan 0,1 gr BSA ke dalam gelas beaker
I
Diambil 10 ml PBST dan dimasukkan ke dalam gelas beaker
I
Distirer hingga homogen
I
Hasil
 - Pembuatan stop solution (H2SO4 1 M) 10 ml
Diambil 561 H2SO4 dan dimasukkan ke dalam gelas beaker
I
Ditambahkan akuades steril hingga 10 ml
I
Dimasukkan larutan ke dalam botol schott
I

Hasil

3. HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Hasil
Volume
Bahan Massa
Nama bahan Konsentrasi total
penyusun (gr)/volume
larutan
Buffer Na2CO3 0,078
bikarbonat NaN3 0,01
50 ml
NaHCO3 0,00146
DelH2O 25-50 ml
PBST NaCl 0,4
NaH2PO4 0,072
KH2PO4 0,012
50 ml
KCl 0,01
Akuades 25-50 ml
Tween 25
Blocking BSA 0,1
buffer Larutan 10 ml 10 ml
PBST
Stop buffer H2SO4 1M 561
Akuades 10 ml 10 ml
steril
 3.2 Pembahasan
Teknik ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) merupakan
salah satu teknik yang digunakan untuk mendeteksi adanya antibodi atau
antigen dalam suatu sampel. Teknik ELISA dapat digunakan untuk
pengujian semua jenis antigen, hapten atau antibodi. Prinsip kerja dari
ELISA, yaitu bekerja berdasarkan terjadinya reaksi spesifik antara antibodi
dengan antigen yang menggunakan enzim sebagai marker yang menjadi
sebuah penanda. Enzim akan memberikan tanda jika terdapat suatu
antigen pada suatu sampel, jika antigen tersebut telah bereaksi dengan
antibodi. Reaksi yang terjadi memerlukan sebuah antibodi spesifik yang
dapat berikatan dengan antigen (Rohima, 2018).
Teknik ELISA yang didasarkan pada reaksi spesifik yang tejadi
pada ikatan antigen dan antibodi memiliki sensitivitas dan spesifisitas yang
tinggi menggunakan indikator enzim. Hasil positif akan ditunjukkan
dengan adanya perubahan warna pada sampel karena adanya
penambahan substrat tertentu dan enzim peroksida. Teknik ELISA yang
umum digunakan dalam suatu penelitian ada tiga, yaitu Direct ELISA,
Indirect ELISA dan Sandwich ELISA. Direct ELISA merupakan metode
sederhana yang digunakan untuk mengukur konsentrasi antigen pada
sampel dengan mengikat antigen dengan antibodi yang telah dilabeli
langsung oleh enzim (Powers et al., 2012). Indirect ELISA merupakan
metode untuk mengukur konsentrasi antibodi dengan mengikat enzim
pada antibodi sekunder yang berikatan dengan antibodi primer (Sumbria
et al., 2016). Sandwich ELISA merupakan teknik ELISA yang
menggunakan antibodi primer spesifik agar berikatan dengan antigen
yang diinginkan, serta antibodi sekunder akan ditautkan dengan enzim
yang digunakan untuk mendeteksi antigen (Zhou et al., 2012).
Teknik ELISA memiliki beberapa kelebihan, yaitu dapat digunakan
untuk sampel dalam jumlah yang besar, waktu yang relatif cepat,
peralatan yang cukup canggih, namun dengan harga terjangkau. Stabilitas
teknik ELISA terhadap antigenik epitop juga cukup baik. Teknik ELISA
untuk indentifikasi spesies di laboratorium memerlukan konfirmasi dengan
analisis DNA mutlak untuk menghindari hasil negatif atau positif palsu
(Cahyaningsari et al., 2019).
Teknik ELISA banyak digunakan dalam bidang imunologi untuk
mendeteksi keberasaaan antibodi atau antigen dalam sampel. ELISA
banyak digunakan untuk alat diagnostik dalam kedokteran, patologi
tanaman, kontrol kualitas di industri seperti pada industri makanan.
Jumlah antigen atau antibodi dalam sampel dapat diketahui jumlahnya
menggunakan ELISA dengan mengikatkan antigen dengan antibodi
spesifik atau sebaliknya yang ditempelkan di permukaan dinding ELISA
plate. Antibodi atau antigen yang telah terikat pada enzim akan berubah
warna, sehingga dari perubahan warna tersebut dapat diketahui berapa
jumlah antigen yang terkandung dalam sampel. ELISA dapat digunakan
untuk pengujian kualitatif maupun kuantitatif dengan spesifisitas yang
tinggi (Suryadi et al., 2009).
Analisis ELISA memerlukan beberapa tahapan dalam
pelaksanaannya. Tahap preparasi bahan merupakan salah satu tahapan
penting yang perlu diperhatikan saat menggunakan metode analisis
ELISA. Bahan yang perlu dipreparasi sebelum melakukan analisis, yaitu
pembuatan buffer bikarbonat, pembuatan larutan PBST, pembuatan buffer
blocking dan pembuatan stop solution. Pembuatan buffer bikarbonat
bertujuan untuk mempertahankan pH sampel agar tidak terpengaruh
terhadap penambahan berbagai reagen-reagen. Buffer bikarbonat dibuat
dengan komposisi bahan Na2CO3, NaN3, NaHCO3 yang dilarutkan dalam
DelH2O (Nurmahdi et al., 2013). Pembuatan larutan PBST bertindak
sebagai washing buffer. Fungsi penambahan PBST adalah untuk
membilas sampel agar antigen atau antibodi yang tidak berinteraksi agar
tidak menempel pada dinding mikrotiter. Komposisi bahan penyusun
larutan PBST yaitu NaCl, NaH2PO4, KH2PO4, dan KCl. Bahan tersebut
dilarutkan dalam H2O steril yang kemudian ditambahakan larutan Tween
kedalamnya (Bijanti et al., 2011).
Pembuatan buffer blocking berfungsi untuk meningkatkan
sensitivitas assay dengan memblocking semua sinyal pengganggu dan
meningkatkan rasio signal-to-noise. Prinsip buffer blocking yaitu
mencegah penempelan protein non spesifik. Buffer blocking yang ideal
mampu mengikat semua lokasi potensial untuk interaksi nonspesifik
(Sianturi et al., 2017). Pembuatan larutan penghenti (stop solution)
digunakan untuk menghentikan reaksi enzim substrat dalam teknik ELISA.
Stop solution ini terbuat dari larutan asam sulfat pekat yaitu H2SO4 dengan
konsentrasi 1 M. Reaksi enzim substrat dihentikan ketika sampel
menunjukkan intensitas warna yang diinginkan. Hal tersebut menunjukkan
bahwa indikasi dari tingkat analit suatu sampel pada teknik ELISA adalah
perubahan intensitas warna pada sampel uji (Cahyaningsari et al., 2019).
Analisis menggunakan teknik ELISA divisualisasikan menggunakan
spektrofotometer. Spektrofotometer yang digunakan dirancang dapat
melalui pelat mikrotiter, baik secara tunggal maupun baris. Analisis
menggunakan spektrofotometer didasarkan pada densitas optik beberapa
tabulasi data dan dapat diterapkan dalam analisis statistik. Data yang
diperoleh didapatkan dari pengukuran absorbansi warna yang dihasilkan
oleh reaksi enzim-antibodi atau enzin-antigen terkonjugasi pada substrat
masing-masing yang bekerja dengan sebuah sinar jenis tertentu dari
cahaya masing-masing sampeldalam pelat. Pengukuran menggunakan
spektrofotometer untuk analisis menggunakan teknik ELISA membutuhkan
panjang gelombang tertentu, umumnya pengukuran dilakukan pada
panjang gelombang 450 nm (Wulandari et al., 2019).
4. KESIMPULAN
Teknik ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) merupakan
salah satu teknik yang digunakan untuk mendeteksi adanya antibodi atau
antigen dalam suatu sampel. Analisis menggunakan ELISA memerlukan
beberapa tahap, salah satunya adalah preparasi bahan. Preparasi bahan
bertujuan untuk meminimalkan penggunaan bahan kimia dan
memudahkan peneliti pada saat melakukan suatu uji analisis. Bahan yang
perlu dipreparasi dalam analisis menggunakan teknik ELISA, yaitu
pembuatan buffer bikarbonat, pembuatan PBST, pembuatan blocking
buffer dan pembuatan stop solution.
 DAFTAR PUSTAKA

Bijanti, R., M.G.A. Yuliani, dan W. Tyasningsih. 2011. Antigenesity Protein

of Aeromonas hydrophila Caused Ulcer Disease on Goldfish
(Cyprinus carpio Linn) Using Indirect ELISA Technique. Kongres
Nasional Pertama. Asosiasi Farmakolodi dan Farmasi Veteriner
Indonesia. Hal: 1-6.
Cahyaningsari, D., H. Latif, dan E. Sudarnika. 2019. Identifikasi
Penambahan Daging Babi pada Pangan Berbahan Dasar
Daging Sapi Menggunakan ELISA dan qPCR. Acta Veterinaria
Indonesiana. 7(2): 17-25.
Nurmahdi, H., Aulanni’am, dan C. Mahdi. 2013. Labelling Antibodi Anti-
TPO Menggunakan Alkaline Phosphatase (AP) Untuk Deteksi
Autoantibodi TPO Pada Serum Pasien Autoimmune Thyroiditis
Disease (AITD) Menggunakan Dot-Blot. Kimia Student Journal. 2(2):
583-593.
Powers, J.L., K.D. Rippe, K. Imarhie, A. Swift, M. Scholten, and N. Islam.
2012. A Direct, Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
(ELISA) as a Quantitative Technique for Small Molecules. Journal of
Chemical Education. 89(12).
Rohima, I.E. 2018. Identifikasi Protein Hewani Pada Produk Bumbu Instan
Dengan Metode ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay).
Paundan Food Technology Journal. 5(3): 167-169.
Sianturi, I.S.P.R.U., I.A.P. Apsari, dan I.B.N. Swacita. 2017. Penggunaan
Crude Antigen Cysticercus cellulosae Isolat Bali Untuk Optimalisasi
Uji ELISA. Indonesia Medicus Veterinus. 6(1): 1-9.
Sumbria, D., L.D. Singla, S. Kumar, A. Sharma, R.K. Dahiya, and R. Setia.
2016. Spatial distribution, risk factors and haemato-biochemical
alterations associated with Theileria equi infected equids of Punjab
(India) diagnosed by indirect ELISA and nested PCR. Acta Tropica.
155: 104-112.
Suryadi, Y., I. Manzila, dan M. Machmud. 2009. Tinjauan Potensi
Pemanfaatan Perangkat Diagnostik ELISA serta Variannya untuk
Deteksi Patogen Tanaman. Jurnal AgroBiogen. 5(1): 39-48.
Wulandari K.E.Y.T., R. Susanti, dan S.H. Bintari. 2019. Analisis
Perkembangan Titer Antibodi Hasil Vaksinasi Infectious Bronchitis
pada Ayam Petelur Strain Hisex Brown. Life Science. 8(1): 25-33.
Zhou, F., A. Wang, L. Yuan, Z. Cheng, Z. Wu, and H. Chen. 2012.
Sensitive Sandwich ELISA Based on a Gold Nanoparticle Layer for
Cancer Detection. Analyst. Issue 8.