Dasar Teori

Kromatografi kolom merupakan suatu metode pemisahan fisik, dimana komponen-

komponennya dipisahkan dan didistribusikan diantara 2 fase, salah satu fase tersebut adalah
suatu lapisan stationer dengan permukaan yang luas, yang lainnya sebagai fluida yang mengalir
lembut disepanjang landasan stationer. Fase stationer bisa berupa padat maupun cairan,
sedangkan fase gerak bisa berupa cairan atau gas (Day dan Underwood, 1986). Kromatografi
kolom adsorbsi merupakan salah satu contoh dari kromatografi cair-padat yang termasuk
teknik tertua yang dioperasikan berdasarkan retensi terlarut pada permukaan adsorben. Pada
kromatografi adsorbsi, fase stationernya terdiri atas zar padat dan fase geraknya terdiri dari zar
gas atau cair. Yang temasuk dalam kromatografi cair-padat adalah kromatografi kolom
adsorbsi, kromatografi gas, dan kromatografi lapis tipis (Gandjar dan Rohman, 2007).
Pada kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan pada bagian atas
kolom penjerat yang berada dalam tabung kaca, tabung logam, atau tabung plastik. Kolom
kromatografi tabung untuk pengaliran karena gaya tarik bumi (gravitasi) atau sistem
bertekanan rendah biasanya terbuat dari kaca ynag dilengkapi dengan keran jenis tertentu oada
bagian bawahnya untuk mengatur aliran pelarut (Gritter, 1991).
1. Klasifikasi kromatografi kolom berdasarkan interaksi komponen dengan adsorben
adalah:
2. Kromatografi adsorbsia: komponen yang dipisahkan secara selektif teradsorbsi pada
permukaan adsorben yang dipakai untuk isian kolom.
3. Kromatografi partisi: komponen mengalami partisi antara kapisan cairan tipis ada
penyangga padat dan eluen.
4. Kromatografi pertukaran ion: komponen yang dipisahkan berbentuk ion.
5. Kromatografi filtrasi gel: pemisahan berdasarkan ukuran komponen yang dipisahkan.
Pengemasan kolom dapat dilakukan dengan cara basah atau cara kering. Cara basah
lebih mudah untuk memperoleh packing yang memberikan pemisahan yang baik. Sedangkan
cara kering umumnya dilakukan untuk alumina. Dalam cara basah, fase diam dicampur terlebih
dahulu dengan pelarut sebelum dimasukkan ke tabung kolom. Sedangkan cara kering fase diam
dimasukkan terlebih dahulu kedalam kolom, baru dialiri fase gerak (Basset, 1994).
Kromatografi kolom memiliki peranan yang sangat luas dalam berbagai bidang,
misalnya dalam penentuan kualitatif atau kuantitatif suatu senyawa. Metode ini juga
diaplikasikan dalam pemisahan molekul-molekul penting seperti asam nukleat, karbohidrat,
lemak, vitamin, dan molekul penting lainnya. Selain itu juga bisa digunakan untuk infestigasi
suatu senyawa berbahaya dalam pasien atau korban. Kromatografi kolom memiliki kelebihan
dan kekurangan. Kelebihannya adalah dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparatif,
menentukan jumlah komponen campuran, dan untuk memisahkan dan purifikasi. Selain itu
metode ini hanya membutuhkan alat dan bahan yang mudah didapat dan murah, hanya
membutuhkan waktu yang singkat, dan udah pelaksanaannya. Kekurangnnya adalah
membutuhkan kemampuan dalam teknik dan manual untuk menyiapkan kolom yang sasuai
dengan sampel, dan juga kurang akurat dalam penetapan kuantitaitf komponen dalam senyawa
(Gritter, 1991).

Hasil
Nomor Vial Faktor Retensi (RF)
1-11 Bercak tidak terlihat jelas
13 0,8
14-21 0,7
23 0,6
25-31 0,4
35-39 0,3
41-51 Bercak tidak terlihat jelas
51-61 0,3
63 0,47
65-67 0,3
a. Penyiapan Kolom Kromatografi

Kolom kromatografi Ditimbang silica gel 30x
disiapkan dan beri berat ekstrak, masukkan
kapas pada ujung ke dalam beker dan
kolom ditambahkan pelarut
non polar
Bubur silica yang telah
tersuspensi dimasukkan
ke kolom kromatografi
sambal diketuk-ketuk

Pelarut yang turun

Serbuk ekstrak ditampung dan
dimasukkan melalui dimasukkan kekolom
bagian atas kolom kembali, hingga silica gel
padat

b. Membuat Sistem Pelarut

Pelarut dibuat dengan Pelarut yang digunakan:

perbandingan antara pelarut
non polar, semi polar, dan polar
sehingga terjadi peningkatan
polaritas (sistem gradient)
n-heksan 100% = 200 ml
n-heksan : etil asetat (9:1) = 200 ml
n-heksan : etil asetat (8:2) = 200 ml
n-heksan : etil asetat (7:3) = 200 ml
n-heksan: etil asetat (6:4) = 200 ml

c. Proses Isolasi

Buka kran hingga pelarut Setelah n-heksan 100%

Dimasukkan pelarut
turun dan tamping hasil habis, tambahkan pelarut
n-heksan 100% ke
yang keluar dengan vial yang dengan kepolaran lain 9:1,
dalam kolom
diberi nomor beruntun 8:2, 7:3, dan 6:4 bertuurut-
turut

Hasil eluent yang telah

Ditampung hasil
ditampung dianalisis
yang keluar seperti
dengan plat KLT untuk
cara awal
melihat spot-spot
dibawah UV
 Pada praktikum kali ini dilakukan isolasi senyawa ekstrak tumbuhan dengan
menggunakan metode kromatografi kolom. Kromatografi kolom memiliki prinsip yang sama
dengan kromatografi lapis tipis, yakni komponen akan dipisahkan antara dua fase yaitu fase
diam dan fase gerak Kolom kromatografi biasanya berbentuk seperti buret untuk titrasi,
ukurannya beragam. Pemilihan fase gerak sangat menentukan berhasil tidaknya pemisahan.
Untuk menentukan fase gerak yang akan digunakan, dilakukan pendekatan: (eLisa UGM,
2015)
1. Penelusuran literature/pustaka.
2. Mencoba dengan KLT.
Langkah pertama yang perlu dilakukan dalam melakukan isolasi senyawa murni
dengan metode kromatografi kolom adalah penyiapan kolom kromatografi. Pengemasan kolom
dapat dilakukan dengan cara basah atau cara kering. Cara basah lebih mudah untuk
memperoleh packing yang memberikan pemisahan yang baik, sedangkan cara kering umumnya
dilakukan untuk alumina. Dalam cara basah, fase diam dicampur terlebih dahulu dengan
pelarut sebelum dimasukkan ke tabung kolom., sedangkan cara kering fase diam dimasukkan
terlebih dahulu ke dalam kolom, baru dialiri fase gerak (Basset, 1994). Pada praktikum kali ini
dipilih metode basah. Selain itu, fase diam yang digunakan dalam praktikum ini adalah silica
gel. Alasan pemilihan silica gel karena memilki tekstur dan struktur yang lebih kompak dan
teratur. Saat memadat, silica gel akan berbentuk tetrahedral raksasa sehingga ikatannya kuat
dan rapat sehingga proses pemisahan menjadi optimal. Silica gel dapat membentuk ikatan
hydrogen di permukaannya karena terikat gugus hidroksil. Oleh karenanya silica bersifat polar.
Jika fase gerak non polar, komponen-komponen yang bersifat polar akan terikat dan tertaha
dalam fase diam. Komponen yang tidak polar akan keluar bersama faser gerak lebih cepat.
Mula-mula, kolom kromatografi diberi kapas pada ujung kolom. Fungsi kapas pada
praktikum ini adalah menyumbat kolom bagian bawah supaya silica tidak mengalir keluar
kolom. Kemudian ditimbang silica gel sebesar 25 gram dan dilarutkan dengan 100 ml n-heksan
pada beaker glass supaya bisa menghasilkan silica dengan konsistensi seperti bubur. Diaduk
hingga terbentuk suspensi. Setelah itu, bubur silica yang telah tersuspensi dimasukkan perlahan
ke dalam kolom melewati dinding kolom. Alasan melewati dinding kolom agar gelembung
udara tidak terjebak di tengah-tengah silica, jika ada gelembung udara akan mengurangi
kesuksesan proses pemisahan. Setelah itu dinding kolom disirami n-heksan hingga tidak tersisa
silica di dinding kolom. Untuk meratakan susunan silica, kolom ditepuk-tepuk perlahan dan
pelarut yang turun ditampung kemudian dimasukkan aakembali ke kolom secara berulang-
ulang hinggga teksturnya menjadi rapat dan padat. Jika n-heksan berlebih, keran dibuka dan n-
heksana dialrikan keluar hingga 1 ml di atas permukaan silica, Ini bertujuan agar fase diam
tidak mengering dan pecah. Setelah siap, kolom ditutup dengan alumunium foil untuk
mengurangi penguapan dari n heksan.
Pada kelompok kami (1c) sempat mengalami cracking karena penambahan eluen yang
terlalu lambat sehingga kolom mengering. Untuk mengatasi cracking kolom yang sudah
bercampur dengan sampel, dilakukan pembalutan tabung oleh kapas yang diberi aseton
disekitar daerah cracking. Aseton yang menguap dengan menyerap energi panas dari tabung
menyebabkan kolom akan kehilangan energi dan mengalami penurunan suhu sehingga
gelembung udara akan naik ke permukaan dan cracking dapat teratasi. Hal-hal yang dapat
dilakukan agar tidak terjadi pemecahan kolom adalah dengan menambahkan eluen secara
kontinu agar udara tidak masuk kedalam kolom.
Pada optimasi pemilihan pelarut yang baik untuk pemisahan daun salam dengan
menggunakan KLT (Kromatografi Lapis Tipis), didapat pemisahan yang baik adalah pelarut
dengan perbandingan heksana:etil asetat 3:2. Fase gerak dimasukkan kedalam kolom dengan
cara dituangkan sedikit demi sedikit atau dialirkan dari bejana yang diletakkan diatas kolom
sehingga fase gerak mengalir dengan sendirinya. Dipilih juga metode elusi gradient untuk
pemisahan komponen pada daun salam. Elusi gradien (bertahap) yaitu selama proses elusi
menggunakan fase gerak berubah-ubah polaritasnya. Untuk membuat polaritas berubah-ubah
maka komposisi fase gerak berubah. Pada umumnya dimulai fase gerak non polar kemudian
berubah ke pelarut yang polar. Perubahan ini dapat diprogramkan sesuai dengan pemisahan
yang diinginkan. (eLisa UGM, 2015) Pemisahan komponen daun salam fraksi hexane dimulai
dengan eluen heksana 100%, hal ini bertujuan menarik senyawa paling non polar di dalam
fraksi heksana daun salam. Warna eluen yang dihasilkan menarik senyawa yang berwarna hijau
pada vial ke-3 dan ke-4, namun kembali bening pada vial ke-7. Hal ini menunjukkan bahwa
tidak ada senyawa yang dapat ditarik lagi dengan heksana karena polaritas senyawa mayor
yang dikandung fraksi heksana daun salam kurang mendekati polaritas heksana. Kemudian
diganti pelarut dengan dinaikkan polaritasnya atau dengan sistem gradient yakni heksan:etil
asetat 9:1, 8:2, 7:3 dan 6:4 masing-masing 200 mL. Pemisahan pada kelompok vial terakhir
(50-78) sangat baik pada pelarut dengan perbandingan 6:4 (3:2) hal ini sesuai dengan
percobaan optimasi pelarut pada KLT yakni pemisahan komponen daun salam yang cukup baik
yakni 3:2 heksana:etil asetat. Elusi dihentikan jika sudah tidak ada lagi sampel yang dapat
dibawa keluar lagi oleh fase gerak, bila digunakan elusi gradien sudah sampai pada fase gerak
yang paling polar. (eLisa UGM, 2015).
 Hasil eluent yang telah ditampung dalam vial yang telah diberi nomor secara berurutan
pengelompokkan vial berdasarkan pola kromatogramnya adalah asumsi bahwasanya vial-vial
tersebut memiliki senyawa yang sama. Dari proses elusi dalam 100 botol vial tersebut diamati
warna yang dihasilkan dan dipisahkan sesuai perbandingan eluen yang digunakan, kemudian
dilakukan uji KLT untuk mendeteksi komponen yang dipisahkan kromatografi kolom. Hasil
dari vial-vial tersebut akan di totolkan pada plat Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dengan jarak
0.5 cm. Pada plat KLT dilakukan penotolan fraksi-fraksi pada plat KLT dengan ukuran sekecil
mungkin agar noda yang tercipta lebih teRFokus dan tajam. Sebelum plat dimasukkan chamber,
chamber harus dijenuhkan lebih dulu dengan cara fase gerak yang akan digunakan dimasukkan
camber kemudian dimasukkan kertas saring sebagai parameter tingkat kejenuhan Chamber
terhadap uap eluen. Tujuan penjenuhan adalah agar elusi dapat berjalan stabil dan cepat.
Kemudian plat yang telah diberi batas atas dan batas bawah dimasukkan ke dalam chamber.
Batas bawah harus ditentukan supaya totolan sampel tidak langsung terendam fase gerak, yang
dapat mempengaruhi proses elusinya. Sedangkan batas atas digunakan sebagai batas
berhentinya perendaman plat KLT dalam fase gerak.
Analisis plat KLT dilakukan untuk melihat spot yang akan terlihat dibawah lampu uv yang
menandakan adanya komponen kimia yang telah terisolasi. Sinar UV yang digunakan adalah
sinar UV dengan panjang gelombang 254 nm karena berdasarkan literatur, bahwa banyak
senyawa organik yang dapat beRFlouresensi jika disinari UV 254 nm. Sedangkan pada lampu
UV 366 nm warna noda yang tampak adalah terang atau tampak jelas karena lempengnya tidak
beRFlouresensi tetapi sampelnya.
Jarak antara jalannya pelarut bersifat relatif. Oleh karena itu, diperlukan suatu perhitungan
tertentu untuk memastikan spot yang terbentuk memiliki jarak yang sama walaupun ukuran
jarak plat nya berbeda. Nilai perhitungan tersebut adalah nilai RF, nilai RF ini menyatakan
derajat retensi suatu komponen dalam fase diam sehingga nilai RF sering juga disebut faktor
retensi.Nilai RF dapat dihitung dengan rumus berikut :
RF = Jarak yang ditempuh substansi/Jarak yang ditempuh oleh pelarut

Nilai RF sangat karakterisitik untuk senyawa tertentu pada eluen tertentu. Hal tersebut dapat
digunakan untuk mengidentifikasi adanya perbedaan senyawa dalam sampel. Senyawa yang
mempunyai RF lebih besar berarti mempunyai kepolaran yang rendah, begitu juga sebaliknya.
Hal tersebut dikarenakan fasa diam bersifat polar. Senyawa yang lebih polar akan tertahan kuat
pada fasa diam, sehingga menghasilkan nilai RF yang rendah. RF KLT yang bagus berkisar
antara 0,2 - 0,8. Jika RF terlalu tinggi, yang harus dilakukan adalah mengurangi kepolaran
eluen, dan sebaliknya (Gandjar,2007).
Pada praktikum, diperoleh beberapa nilai RF yang sama dengan mengambil vial ganjil
saja yaitu vial 13 dengan nilai RF 0,8; vial 15-21 dengan nilai RF 0,7; vial 21-23 dengan nilai
RF 0,6 , vial 25-31 dengan nilai RF 0,4; vial 35-39 dengan nilai RF 0,3 dan vial 41-51 tidak
terlihat bercak lagi. Hasil kromatografi lapis tipis pada pelarut heksan : etil asetat dengan
perbandingan 3:2 , nilai RF pada vial nomor 51-61 adalah 0,3 lalu pada vial nomor 63 nilai RF
nya adalah 0,475 dan pada vial nomor 65,67 didapatkan nilai RF 0,3. Berdasarkan hasil RF
dan hasil dari penyinaran uv pada panjang gelombang 366, vial 13 dengan nilai RF 0,8
merupakan senyawa saponin karena terdeteksi sebagai noda berwarna merah jambu sampai
ungu. Vial 21-23 mengandung sinamaldehid dengan nilai RF 0,67 . Menurut literatur nilai RF
standar kumarin adalah 0,31 menggunakan eluen heksan: etil asetat (sukmayati, 2010) dan nilai
RF standar flavonoid pengujian KLT diperoleh nilai RF 0,47 dari fraksi etil asetat (Friska,
2005). Jadi dapat disimpulkan pada vial nomor 63 adalah fraksi flavonoid dan vial 51, 53,
55,57,59,61,65,67 adalah fraksi kumarin.
Semakin besar nilai RF yang dihasilkan maka semakin besar pula jarak bergeraknya
senyawa tersebut pada plat silika kromatografi , nilai RF tersebut akan besar bila senyawa
kurang polar yang berinteraksi dengan absorbent polar dari plat silika. Nilai RF yang bagus
adalah antara 0,2 sampai 0,8 dalam praktikum ini, kelompok kami sudah memenuhi kriteria ,
tidak ada nilai RF yang melebihi atau kurang dari rentang kriteria nilai RF .
 Kesimpulan:
Berdasarkan praktikum dari hasil nilai RF yang diperoleh dan membandingkan dengan
literatur, dapat disimpulkan bahwa vial 13 dengan nilai RF 0,8 merupakan senyawa saponin
karena terdeteksi sebagai noda berwarna merah jambu sampai ungu. Vial 21-23 mengandung
sinamaldehid dengan nilai RF 0,67, pada vial nomor 63 dengan RF 0,47 adalah fraksi flavonoid
dan vial 51-67 dengan nilai RF 0,3 adalah fraksi kumarin. Serta nilai RF sudah memenuhi
kriteria rentang nilai RF yang bagus yaitu 0,2-0,8 karena tidak ada yang melebihi atau kurang
dari rentang tersebut.