TEHNIK PEMISAHAN DAN PEMURNIAN

I. Tujuan Percobaan
Memisahkan fraksi dari senyawa lain dan pengotor agar menghasilkan isolat
murni.
II. Alat dan Bahan
Alat :
- Chamber
- Erlenmeyer
- Lampu UV 254 nm dan 366 nm
- Pipa Kapiler
- Plat KLT Preparatif
- Spatel logam
Bahan :
- Fraksi hasil KCV
- Kloroform
- Metanol

III. Prosedur

KLT Preparatif
Pertama-tama pelat KLT tebal khusus untuk KLT Preparatif disiapkan.
Kemudian fraksi hasil KCV ditotolkan membentuk pita bergaris tepat 1 cm dari ujung
bawah pelat. Eluen yang sama dengan yang digunakan untuk pemantauan KLT pada
fraksi disiapkan. Selanjurnya chamber dijenuhkan dengan cara memasukkan kertas
saring kedalam chamber yang telah berisi eluen, kemudian didiamkan hingga kertas
saring terbasahi sempurna. Pelat KLT yang telah berisi totolan isolat dimasukkan
kedalam chamber dan didiamkan hingga pada pelat diperoleh bercak yang telah
memisah sempurna. Kemudian bercak diamati dengan menggunakan sinar UV 254
nm dan 366 nm. Bercak pita yang diduga senyawa target dikerok, lalu dimasukkan
kedalam erlenmeyer. Ditambahkan pelarut metanol kedalam erlenmeyer, lalu saring
larutan hingga silika gel terpisah. Filtrat kemudian diuapkan.

IV. Data Pengamatan dan Perhitungan

 Jumlah Pita =1
16,1
 Rf pita = 17,9 = 0,89

Gambar 4.1 Hasil KLT Preparatif

V. Pembahasan
Percobaan selanjutnya dilakukan pemisahan dan pemurnian hasil fraksi yang
diperoleh dari kromatografi cair vakum (KCV). Tujuan dari pemisahan dan
pemurnian adalah untuk memisahkan suatu senyawa dari senyawa lain sehingga
menghasilkan suatu isolat murni. Terdapat beberapa tehnik pemisahan dan pemurnian
diantaranya ialah Filtrasi (Penyaringan), Sentrifugasi, Penguapan (Evaporasi),
Kristalisasi, Pelarutan dan Kromatografi Preparatif. Pada pemisahan dan pemurnian
ini dilakukan teknik Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Preparatif.
Kromatografi merupakan metode pemisahan yang didasarkan pada perbedaan
jarak retensi antara senyawa satu dengan senyawa lain terhadap fase diam dimana
senyawa tersebut sebelumnya terlarut dalam fase gerak. Kromatografi lapis tipis
preparatif (KLTP) adalah salah satu metode yang memerlukan pembiayaan paling
murah dan memakai peralatan paling dasar. Walaupun KLTP dapat memisahkan
bahan dalam jumlah gram, sebagian besar pemakainya hanya dalam jumlah miligram.
KLTP bersama-sama dengan kromatografi kolom terbuka, masih dijumpai dalam
sebagian besar publikasi mengenai isolasi bahan alam (Hostettmann, 2006).
Ketebalan penjerap (adsorben) yang paling sering dipakai pada KLTP adalah sekitar
0,5-2 mm. Ukuran pelat kromatografi biasanya 20 x 20 cm atau 20 x 40 cm.
Pembatasan ketebalan lapisan dan ukuran pelat sudah tentu mengurangi jumlah
bahan yang dapat dipisahkan dengan KLTP. Penjerap yang paling umum digunakan
ialah silika gel dan dipakai untuk pemisahan campuran senyawa lipofil maupun
campuran senyawa hdrofil (Hostettmann, 2006).
Sebelum dilakukan penotolan pada plat KLT Preparatif, terlebih dahulu
chamber yang akan digunakan untuk mengelusi dijenuhkan menggunakan eluen.
Eluen yang digunakan adalah Kloroform : Metanol dengan perbandingan 9,5 : 0,5.
Pemilihan eluen tersebut dikarenakan pada saat dilakukan pemantauan subfraksinasi,
elusi dengan eluen tersebut menunjukkan nilai Rf yang baik dan merupakan eluen
yang paling cocok untuk pemisahan senyawa yang akan diisolasi sehingga eluen
tersebut dapat digunakan pada KLT Preparatif. Setelah itu fraksi terpilih (fraksi pada
vial 4 dan 5) ditotolkan pada pelat KLTP menggunakan pipa kapiler. Berbeda dengan
KLT analitik, pada KLT Preparatif penotolan membentuk pita bergaris tepat 1 cm
dari ujung bawah pelat. Selanjutnya pelat KLTP dielusi dalam chamber yang berisi
eluen Kloroform : Metanol (9,5 : 0,5) dalam 30 mL yang telah jenuh.
Proses isolasi kromatografi lapis tipis preparatif terjadi berdasarkan perbedaan
daya serap dan daya partisi serta kelarutan dari komponen-komponen kimia yang
akan bergerak mengikuti kepolaran eluen, oleh karena daya serap adsorben terhadap
komponen kimia tidak sama, maka komponen bergerak dengan kecepatan yang
berbeda sehingga hal inilah yang menyebabkan pemisahan (Munson, 2010).
Kelebihan dari penggunaan KLT Preparatif adalah biaya yang digunakan
murah dan memakai peralatan paling dasar. Sementara kekurangannya antara lain :
adanya kemungkinan senyawa yang diambil dari plat adalah senyawa beracun, waktu
yang diperlukan dalam proses pemisahan cukup panjang ,adanya pencemar setelah
proses ekstraksi senyawa dari adsorben dan biasanya rendemen yang diperoleh
berkurang dari 40%-50% dari bahan awal (Kristanti, 2008).
Setelah dilakukan KLT Preparatif didapat bercak berupa 1 pita pada pelat
yang menandakan senyawa telah terpisah. Kemudian diamati di sinar UV 254 nm dan
366 nm untuk melihat bercak/pita agar lebih jelas dan diberi tanda. Pita tersebut
berwarna hijau pudar jika dilihat dengan kasat mata dan berwarna ungu ketika dilihat
pada sinar UV 254 nm dan 366 nm. Rf pita yang didapat adalah 0,89. Selanjutnya
bercak pita yang diduga senyawa target dikerok menggunakan spatel, lalu
dimasukkan kedalam erlenmeyer. Kemudian hasil kerokan tersebut ditambahkan
pelarut metanol dan disaring untuk memisahkan filtrat senyawa target dengan silika
gel. Filtrat senyawa target selanjutnya dilakukan uji kemurnian.

DAFTAR PUSTAKA

K. Hostettmann,M Hostettman, MD, Marston A. (2006). Cara kromatografi

preparatif Penggunan pada Isolasi Senyawa Alam. ITB: Bandung.
Munson, J.W. (2010). Analisis Farmasi, diterjemahkan oleh Harjana. Univeresitas
Air Langga: Surabaya.