LAPORAN RESMI

PRAKTIKUM : FITOKIMIA
PERTEMUAN KE :4
JUDUL PERCOBAAN : ISOLASI SENYAWA DENGAN
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
PREPARATIF

DISUSUN OLEH
NAMA : MUHAMMAD RAFFI IKHSAN
NPM : 1848201110069
KELAS :C
KELOMPOK :2
TANGGAL : SELASA, 21 APRIL 2020
DOSEN PENGAMPU :

LABORATORIUM FARMASI
PROGRAM STUDI S1 FARMASI
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH BANJARMASIN
TAHUN AJARAN 2020/2021
 PERCOBAAN IV

ISOLASI SENYAWA DENGAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

PREPARATIF

I. TUJUAN
Mahasiswa mampu melakukan isolasi senyawa dengan menggunakan
metode kromatografi lapis tipis preparatif.

II. ALAT DAN BAHAN

a. Alat : Pipa kapiler, chamber, pinset, lampu UV
b. Bahan : Plat KLT silica gel F254, pelarut organic, reagen
penyemprot, sampel (fraksi hasil kromatografi kolom)

III. CARA KERJA

1. Lakukan optimasi eluen yang akan digunakan untuk KLT
preparatif. Optimasi dilakukan sampai spot-spot hasil eluen yang
dihasilkan tidak behimpit satu sama lain, akan lebih baik jika
terdapat jarak antar spot, sehingga memudahkan untuk pemisahan.
2. Chamber dijenuhkan dengan eluen yang telah dipilih. Waktu
penjenuhan disesuaikan dengan volume chamber. Pengecekan
penjenuhan bias dilakukan menggunakan kertas saring, dimana
pangkal potongan kecil memanjang kertas saring dimasukkan
kedalam eluen dan ujungnya dibiarkan menjuntai keluar, kemudian
chamber ditutup. Bila kertas saring yang menjuntai keluar sudah
dibasahi eluen, maka chamber sudah jenuh.
3. Fraksi yang telah mongering, dilarutkan dengan pelarut yang
terpilih, ditotolkan menggunakan pipa kapiler hingga (hampir)
 membentik pita. Fraksi ditotolkan pada jarak sekitar 1,5 cm dari
dasar lempeng.
4. Pastikan sampel yang ditotolkan telah mongering, kemudian
dielusikan kedalam chamber yang telah jenuh.
5. Elusi dilakukan sampai jarak 0,5-1,5 cm dari batas plat KLT,
setelah itu plat diangkat.
6. Setelah plat mongering, diamati bercak pada lampu UV, baik pada
panjang gelombang 254 nm maupun –ada 366 nm. Praktikan
diperbolehkan memilih senyawa yang diinginkan untuk diisolasi.
7. Hasil kerokan dimasukkan kedalam botol, kemudian dilarutkan
dengan pelarutnya. Kelarutan dapat dioptimasi dengan
menggunakan sonikator.
8. Selanjutnya diasring dengan kapas berlapis, dapat dilakukan
beberapa kali sampai diperoleh hasil yang jenuh.
9. Larutan senyawa diuapkan hingga larutan tingal sekitar 1/5-1/4
dari volume larutan awal. Larutan senyawa inilah yang akan di cek
kemurniannya.
10. Dari larutan senyawa yang didapat dari no.9 diatas, dilakukan KLT
untuk melihat kemurniannya.
11. Apabila hasil KLT memperlihatkan adanya lebih fari 1 spot, berarti
senyawa tersebut belum murni.
12. Apabila hanya terlihat 1 spot, selanjutnya dilakukan uji kemurnian
lebih lanjut dengan 3 eluen yang berbeda, bila hasil KLT ada yang
memperlihatkan adanya lebih dari 1 spot, berarti senyawa tersebut
belum murni.
 IV. HASIL PERCOBAAN

Hasil Praktikum KLT Preparatif

Sampel yang akan di KLT preparative adalah FRAKSI 3

FRAKSI 3 Berasal dari Botol ke 15 sampai 25

Dimana Botol 15 sampai 25 keluar dari eluen n-heksan : etil asetat (4:6) sampai n-
heksan : etil asetat (1:9)

FRAKSI 3 di KLT Preparatif dengan pola kromatogram sbb :

Setelah optimasi eluen, Pola kromatogram diatas diperoleh dari eluen n-heksan :
etil asetat (2:8), kemudian setelah masing2 pita dikerok, dimasukkan ke masing2
botol dan dilarutkan dengan pelarut.
 1 3
2
4 5

Diatas, merupakan 5 pita yg dipilih, berdasarkan ketebalan

Adapun msg2 pelarut adalah :

Pita 1 n-heksan : etil asetat (4:6)

Pita 2 n-heksan : etil asetat (4:6)

Pita 3 n-heksan : etil asetat (3:7)

Pita 4 n-heksan : etil asetat (2:8)

Pita 5 n-heksan : etil asetat (2:8)

Kemudian masing2 pita di KLT, hasilnya, sebagai berikut :

Pola kromatogram masing2 pita

1 2 3 4 5
Diatas merupakan pola kromatogram dari masing2 pita senyawa, yang dielusi
dengan

eluen n-heksan : etil asetat (1:9)

V. PEMBAHASAN
Kromatografi lapis tipis preparative (KLT preparative) merupakan
metode yang digunakan untuk pemisahan dan isolasisuatu senyawa.
Tujuan dari KLT preparative adalah untuk mengisolasi senyawa murni
untuk dilakukan analisis lebih lanjut menggunakan kromatografi gas,
kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT), spektrometri visibel,
spektrometri fluoresensi, spektrometri massa dan investigasi fisik,
kimia, farmakologi, atau biologis (Nyiredy, 1995).
Pada KLT preparative, setelah proses elusi selesai dan fase gerak
menguap sempurna, pita (band) senyawa yang diinginkan dipindahkan
dari pita. Apabila senyawa yang terpisah menunjukkan warna, maka
dapat diamati dibawah sinar UV, untuk kemudian ditandai untuk
dipisahkan. Jika senyawa itu sendiri tidak terlihat atau tidak ada
fluoresensi, deteksi senyawa dapat dilakukan dengan menggunakan
uap yodium atau dengan menggunakan reagen destruktif (Nyiredy,
1995).
Setelah pita senyawa yang diinginkan ditandai, dapat dilakukan
langkah-langkah berikut :
1. Penghilangan zona adsorben senyawa yang ditandai secara
mekanis missal dikerok
2. Ekstraksi senyawa dari fase stasioner dengan pelarut yang
sesuai
3. Pemisahan dari adsorben sisa
 4. Penguapan dari pelarutnya sampai kepekatan yang diinginkan.
Semua jenis KLT preparative dapat digunakan untuk pemurnian
dan isolasi. Sebagai aturan praktis, jika sampel mengandung lebih dari
lima senyawa, sebanyak 10 mg sampel dapat dipisahkan dengan
metode micropreparative dan sebanyak 50 mg dengan metode
preparative. Metode pemisahan dan isolasi senyawa menggunakan
KLT preparative merupakan metode yang sederhana dan efektif,
sehingga banyak digunakan (Nyiredy, 1995).
Pada kromatografi lapis tipis preparative, cuplikan yang akan
dipisahkan ditotolkan berupa garis pada salah satu sisi pelat lapisan
besar dan dikembangkan secara tegak lurus pada garis cuplikkan
sehingga campuran akan terpisah menjadi beberapa pita. Pita
ditampakkan dengan cara yang tidak merusak jika senyawa itu
tanwarna, dan penyerap yang mengandung senyawa pita dkerok dari
pelat kaca. Kemudian cuplikkan diesulasi dari penyerap dengan pelarut
polar. Cara ini berguna untuk memisahkan campuran reaksi sehingga
diperoleh senyawa murni untuk telaah pendahuluan, untuk menyiapkan
cuplikan analisis, untuk meneliti bahan alam yang lazimnya berjumlah
kecil dan campurannya rumit dan untuk memperoleh cuplikkan yang
murni untuk mengkalibrasi kromatografi lapis tipis kuantitatif.
Sampel yang digunakan dalam praktikum ini adalah ekstrak daun
pepaya.
Tujuan dilakukannya praktikum ini yaitu mahasiswa dapat
melakukan isolasi senyawa dengan menggunakan metode kromatografi
lapis tipis preparative.
Dalam praktikum ini prosedur yang digunakan yaitu kromatografi
lapis tipis preparative. Sebelum melakukan pemisahan dengan KLT
preparative terlebih dahulu dilakukan pemilihan eluen yang cocok
yaitu untuk memastikan eluen memiliki daya serap untuk fraksi yang
digunakan, kemudian dilakukan pemilihan fraksi untuk melihat fraksi
yang lebih banyak senyawa yang tertarik. Setelah dilakukan pemilihan
eluen dan pemilihan fraksi barulah dilakukan pengerjaan kromatografi
lapis tipis preparative.
Fraksi aktif dari hasil lalu ditotolkan berbentuk pita pada garis
yang telah dibuat sebelumnya. Lempeng yang digunakan itu berukuran
20x20 cm. Sampel yang digunakan yaitu hasil dari Fraksi 3 yaitu
berasal dari botol ke 15 sampai 25. Setelah ditotolkan, kemudian
dielusi dengan eluen n-heksan : etil asetat (4:6) sampai (1:9). Setelah
dielusi lempeng diamati dibawa lampu UV 254 nm dan UV 366 nm.
Pita yang tebentuk dideteksi dengan menyemprotkan DPPH untuk
melihat senyawa yang aktif dan diberi tanda kemudian dikeruk untuk
disentrifuge sehingga terpisah supernatan dengan isolate murni.
Setelah itu masing-masing fraksi yang telah dipilih ditotolkan pada
lempeng KLTP menggunakan pipa kapiler. Selanjutnya duelusi dalam
chamber yang berisi eluen n-heksan : etil asetat (2:8) dalam 100 ml
yang telah jenuh. Lalu dibiarkan terelusi. Selanjutnya diamati
penampakan bercak noda pada lampu UV 254 nm dan 366 nm. Setelah
itu dilakukan uji antioksidan dengan cara menyemprot lempeng
menggunakan DPPH. Setelah disemprot, maka akan tampak fraksi
aktif sebagai antioksidan dengan perubahan warna noda menjadi
kuning. Setelah itu fraksi aktif dikeruk, dan hasil pengerukkan tersebut
disimpan dalam vial, kemudian dilarutkan dalam methanol.
Alasan kenapa menggunakan n-heksan : etil asetat yaitu karena n-
heksan : etil asetat ialah salah satu fase gerak biner yang sering dipakai
pada pemisahan. Adapun kegunaan dari DPPH yaitu untuk menguji
aktivitas antioksidan pada sampel fraksi yang digunakan. DPPH juga
digunakan sebagai pewarna (indikator) yang dapat menunjukkan
perubahan warna . yang menandakan bahwa senyawa tersebut dapat
menangkal radikal bebas. Sedangkan bahaya dari penggunaan DPPH
yaitu karena sifatnya yang radikal bebas maka sangat reaktif sehingga
kerusakan fungsi sel sehingga harus digunakan secara hati-hati.
 Pada praktikum ini didapatkan hasil yaitu 5 pita yang dipilih
berdasarkan ketebalannya. Adapun masing-masing pelarut adalah :
a. Pita 1 = n-heksan : etil asetat (4:6)
b. Pita 2 = n-heksan : etil asetat (4:6)
c. Pita 3 = n-heksan : etil asetat (3:7)
d. Pita 4 = n-heksan : etil asetat (2:8)
e. Pita 5 = n-heksan : etil asetat (2:8)
Kemudian masing-masing pita di KLT, dan didapatkan berbagai
pola dari pita tersebut. Pola kromatogram dari masing-masing pita
senyawa tersebut yang dielusi dengan eluen n-heksan : etil asetat (1:9).
VI. DAFTAR PUSTAKA
Anonim .2020. Buku petunjuk Praktikum Fitokimia . Universitas
Muhammadiyah Banjarmasin.
Nyiredy,S.1995.Preparative Layer Chromatography. In: Sherma J and
Fried B (eds) Handbook Of Thim-Layer Chromatography. New
York: Dekker, pp. 307-340.