KROMATOGRAFI

KOLOM
Capaian Pembelajaran
1. Mahasiswa mampu menjelaskan kromatografi kolom
2. Mahasiswa mampu memahami prinsip dan mekanisme pemisahan
3. Mahasiswa mampu menjelaskan jenis-jenis kromatografi kolom
Jenis Kromatografi
Fasa stasioner PADAT CAIR
Fasa gerak Cair Gas Cair Gas
Contoh-contoh Kromatografi asli Kromatografi gas- Kromatografi partisi Kromatografi gas-cair
Tswett, dengan padat (GSC) pada kolom silika gel (GLC)
larutan petroleum
eter dan kolom CaCO3
Kromatografi Kromatografi kertas
pertukaran ion
Proses Pemisahan
Kromatografi Kolom
• Metode pemisahan, fasa diam ditempatkan pada
suatu matriks penyangga khusus → kolom
• Fasa diam: zat padat yang ditempatkan dalam
suatu kolom atau cairan yang terserap sebagai
lapisan tipis permukaan butiran halus solid
support material
• Perbedaan polaritas, afinitas setiap komponen
menyebabkan terjadinya perbedaan kecepatan
migrasi komponen
 Kromatografi Kolom
• Kolom terbuat dari gelas, polimer, atau logam dengan ukuran
bervariasi
• Fasa diam: perbandingan berat (30: 1, fasa diam : sampel) atau
50:1
• Fasa diam umum utk pemisahan senyawa sederhana: silika gel,
alumina
• Teknik penting pada pengemasan kolom (cara basah dan kering)
• Teknik penting pada preparasi sampel (cair atau padat)
• Elusi : Isokratik, gradien
• Deteksi: KLT, detector, atau metode lain
Preparasi kolom
Pengemasan kolom
Preparasi sampel dan loading sampel
Proses pemisahan (elusi)
Deteksi hasil kromatografi kolom (KLT)
Faktor yang mempengaruhi efisiensi pemisahan
1. Ukuran kolom
2. Ukuran partikel pada kolom
3. Aktivitas dari adsorben
4. Temperatur kolom
5. Pengemasan kolom
6. Kualitas pelarut
7. Tekanan
Aplikasi kromatografi kolom
• Pemisahan senyawa campuran
• Proses pemurnian (menghilangkan pengotor)
• Isolasi senyawa aktif
• Estimasi untuk proses formulasi
• Pemisahan diastereoisomer
Jenis Fasa diam
Material adsorben Aplikasi Eluen
Alumina/magnesia Sterol, ester, alkaloid, senyawa anorganik Air, asam organik
Basa pH 10; Netral pH 7,5; Asam pH 4 dan zat warna

Silika gel Sterol, senyawa organic, asam amino Berbagai jenis eluen
Karbon Peptida, asam amino, karbohidrat Piridin
Magnesium silikat Sterol, ester, gliserida, alkaloid alkohol
Magnesium karbonat Porphirin Toluena
Kalsium karbonat Zat warna, karotenoid, xantofil Aseton
Calsium fosfat Protein, polinukleotida, asam nukleat benzena
Pati / amilum Enzim Karbon tetraklorida
Gula, sukrosa Klorofil, xantofil Eter
Syarat Fase diam
• Tidak larut dalam pelarut/eluen
• Inert terhadap sampel
• Dapat dilalui oleh sampel dan fasa gerak
Cara penyimpanan Fase diam
• Disimpan dalam bentuk serbuk kering/ halus
• Ditempatkan dalam suatu wadah berisi larutan buffer atau dalam
pelarut organic
• Ditempatkan dalam kolom yang sudah dijenuhkan dengan pelarut
dan ditambahkan anti mikroba (Natrium Azida)
 4 Jenis kromatografi cair berdasarkan fasa diam
• Liquid/Solid Chromatography (adsorption chromatography)
a. Normal phase LSC
b. Reverse phase LSC
• Liquid/liquid chromatography (partition chromatography)
a. Normal phase LLC
b. Reverse phase LLC
• Ion exchange chromatography
• Gel permeation chromatography (exclusion chromatography)
Kelebihan dan kekurangan KK Konvensional

Kelebihan Kekurangan
• Murah • Lambat
• Simple • Resolusi rendah
• Baik untuk analisa kualitatif / • Tidak kuantitatif
preparative
• Dapat digunakan pada skala
besar
Mekanisme (KCP)
Mekanisme (KCC)
Kromatografi Gel Filtrasi
•Disebut juga eksklusi atau gel permeation chromatography
•Pemisahan berdasarkan perbedaan sifat fisik (ukuran/bobot molekul) dari komponen
analit dalam suatu campuran
•Mampu memisahkan molekul dari ukuran 100 Da sampai 150.000 kDa
Kromatografi Gel Filtrasi
Kromatografi Gel Filtrasi
•Secara mikroskopis mirip seperti sponge
•Larutan yang terdiri dari campuran analit dengan berbagai ukuran BM dan fasa
geraknya dilewatkan ke dalam kolom yang mengandung partikel berpori
•Komponen dengan ukuran molekul yang lebih besar dari ukuran pori tidak
mampu terserap ke bagian dalam fasa diam, sehingga akan terelusi lebih cepat.
Kromatografi Gel Filtrasi
Aplikasi Kromatografi Gel Filtrasi
•Desalinasi dan pemurnian: Pemisahan garam anorganik, pelarut organic, mineral
•Penentuan BM
TERIMA KASIH