KROMATOGRAFI KOLOM

Pertemuan ke-3
Kimia Analisis Instrumen

Definisi Umum
Kromatografi kolom merupakan salah satu cara
pemisahan dimana fase diam ditempatkan
dalam suatu matriks penyangga khusus
berbentuk silinder/ kolom.
Fase diam berupa zat padat yang ditempatkan
dalam suatu kolom atau cairan yang terserap
(teradsorpsi)
sebagai
lapisan
tipis
pada
permukaan butiran halus zat padat pendukung
(solid support material).
Perbedan bentuk/ukuran, polaritas, densitas,
afinitas dan gaya interaksi dari setiap komponen
menyebabkan terjadinya perbedaan kecepatan
migrasi

Jenis Fase diam

Dalam kolom kromatografi adsorpsi, setiap

komponen analit mengalami interaksi yang
spesifik dengan fase diam. Hal tersebut sangat
tergantung pada sifat alamiah, bentuk, ukuran,
afinitas dan polaritas dari material adsorben
tersebut.

PROSES PEMISAHAN

Mikhail Tswett (1906) separated six pigments in a pigment

extraction from leaves. He made a CaCO3 packed glass
column as the stationary phase. CaCO3 column is a solid
adsorbent. Mobile phase used was petroleum ether.

Cara penyimpanan fase

diam
disimpan dalam bentuk serbuk
kering atau butiran-butiran halus.
ditempatkan dalam suatu wadah
berisi larutan buffer atau dalam
pelarut organik.
ditempatkan dlm tabung
silinder/kolom yang sudah
dijenuhkan dengan pelarut dan
ditambahkan anti mikroba (ex.
Natrium Azida)

Faktor-faktor yang mempengaruhi

pemisahan
DIAGRAM OF SIMPLE LIQUID COLUMN CHROMATOGRAPHY

sifat alamiah, bentuk

& ukuran fase diam
afinitas dan polaritas
material adsorben
Keseragaman ukuran
fase diam
Jenis, komposisi dan
polaritas fase gerak
pH, suhu dan zat
pengotor.

Solvent(mobile or
moving phase)
A+B +C

Sample
(A+B+C)

OOOOOOOOOOO
OOOOOOOOOOO
OOOOOOOOOO
Column
OOOOOOOOOOO
OOOOOOOOOOO
OOOOOOOOOO
OOOOOOOOOOO Solid Particles
OOOOOOOOOOO(packing materialOOOOOOOOOO stationary phase)
OOOOOOOOOOO
OOOOOOOOOOO
OOOOOOOOOO
OOOOOOOOOOO
OOOOOOOOOOO
OOOOOOOOOO
OOOOOOOOOOO
OOOOOOOOOOO
OOOOOOOOOO
OOOOOOOOOOO
OOOOOOOOOOO
OOOOOOOOOO
OOOOOOOOOOO
OOOOOOOOOOO
OOOOOOOOOO
Eluant (eluate)

OOOOOOOOOOO
OOOOOOOOOOO
OOOOOOOOOOO
A OOOO
OOOOO
OOOOOOOOOOO
OOOOOOOOOO
OOOOOOOOOOO
OOOOOOOOOOO
OOOOOOOOOO
OOOOOB OOOO
OOOOOOOOOOO
OOOOOOOOOO
OOOOOOOOOOO
OOOOOOOOOOO
OOOOOOOOOO
OOOOOOOOOOO
OOOOOOOOOOO
OOOOOOOOOO
OOOOOC OOOO
OOOOOOOOOOO
OOOOOOOOOO
OOOOOOOOOOO
OOOOOOOOOOO
OOOOOOOOOO
OOOOOOOOOOO
OOOOOOOOOOO

4 jenis kromatografi cair

berdasarkan
jenis fase diam
Liquid/Solid Chromatography (adsorption
chromatography)
A. Normal Phase LSC
B. Reverse Phase LSC
Liquid/Liquid Chromatography (partition
chromatography)
A. Normal Phase LLC
B. Reverse Phase LLC
Ion Exchange Chromatography
Gel Permeation Chromatography (exclusion
chromatography)

Kelebihan dan
kekurangan

Kelebihan
MURAH
SIMPLE

Kelemahan
LAMBAT
RESOLUSI
RENDAH

BAIK UNTUK ANALISA

KUALITATIF/PREPARA
TIDAK
TIF

KUANTITATIF

DAPAT DIGUNAKAN
UNTUK SKALA BESAR

TIDAK
REPRODUCIBLE

LIQUID SOLID CHROMATOGRAPHY

(Kromatografi cair padat)
Normal phase LS
Reverse phase LS

Si - O - H

Silica Gel

Mekanisme Pemisahan KCP : perbedaan

kemampuan adsorpsi analit oleh fase diam pada
sisi aktif permukaan (contoh : silika gel)

Contoh KCP fase normal

OH

HEXANE

Si - OH

CH3

OH

CH3
C-CH3
CH3

CH3- C
CH3

CH3

WATER-SOLUBLE VITAMINS
1.

Niacinamide

2.

Pyridoxine
H 3C

HO
CONH 2
3.

H 3C
H 3C

CH2OH
CH2OH

Riboflavin
CH2OH

HOCH
HOCH
HOCH
CH2
N
N

4. Thiamin

O
NH

N
O

H 3C

N
N

NH 2
CH2

S
N

CH2CH2OH
Cl
CH3

LIQUID-LIQUID CHROMATOGRAPHY
(Kromatografi Cair-cair)
ODPN(oxydipropionylnitrile)
Normal Phase LLC
Reverse Phase LLC

NCCH3CH2OCH2CH2CN(Normal)
CH3(CH2)16CH3 (Reverse)

The stationary solid surface is coated with a 2nd

liquid (the Stationary Phase) which is immiscible
in the solvent (Mobile) phase

Kromatografi penukar
ion
Kromatografi penukar ion adalah salah satu
bentuk kromatografi adsorpsi.
didasarkan pada interaksi elektrostatik
reversible antara komponen analit dengan fase
diam yang berbeda muatan.
Kromatografi penukar ion menggunakan
mekanisme pertukaran ion untuk memisahkan
komponen analit.
dua tipe KPI berdasarkan jenis fase diamnya
yaitu resin penukar kation dan resin
penukar anion.

Mekanisme pemisahan KPI

Karakter Resin Penukar Ion

Resin penukar ion dibuat dari suatu bahan yang tidak
larut, membentuk matriks tiga dimensi dan secara kimia
mengandung suatu gugus bermuatan yang terikat pada
permuakaan matriks tersebut.
Resin yang mengandung gugus bermuatan negative
disebut resin penukar kation sedangkan resin yang
mengandung gugus bermuatan positif disebut resin
penukar
anion
Anion exchangers
Functional group
diethyl-aminoethyl (DEAE)

-OCH2CH2N+H(CH2CH3)2

-OCH2CH2N+
quaternary aminoethyl (QAE)
(C2H5)2CH2CH(OH)CH3
quaternary ammonium (Q)

-CH2N+(CH3)3

Cation exchangers

Functional group

carboxymethyl (CM)

-OCH2COO-

sulfopropyl (SP)

-CH2CH2CH2SO3-

Beberapa tipe resin penukar

ion

Faktor-faktor penentu pemisahan

KPI
Pemilihan resin (pahami sifat dan karakteristik
molekul yang akan dipisahkan).
Kapasitas pengikatan ion pada resin (afinitas)
Pengunaan range pH untuk menghindari
denaturasi dan pengendapan (isoelektrik)
Pemilihan Buffer : pH untuk larutan buffer
bergantung pada (1) stabilitas makromolekul
yang akan dipisahkan dan (2) kekuatan ionik
dari larutan buffer agar tidak terjadi kompetsisi
antar komponen analit dengan larutan
buffernya.

Penyiapan Resin Penukar

Ion
Baca instruksi dan cara preparasi matriks kolom
secara mendetail yang ada dalam catalog/manual.
Hindari kesalahan preparasi resin penukar ion
pada saat pertama kali akan digunakan
Aktifasi gugus fungsi ionik (asam/basa)
Pencucian dan penyaringan (aquades)
Pemisahan komponen ion logam/pengotor (EDTA)
Penyimpanan dalam larutan buffer.
Penmbahan zat antimikroba (bentuk cair)

Contoh aplikasi pemisahan

KPI

Pemisahan asam amino

Pemisahan protein

pH2

SO3

Na

H3N

COOH

Ion-exchange Resin

SO3

H3N
Na

+
-

COO

pH4.5

PEMISAHAN PROTEIN
DENGAN KPI

SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY

(KROMATOGRAFI GEL FILTRASI)
Kromatografi gel filtrasi (sering disebut kromatografi
eksklusi atau gel permeation chromatography) lebih
merujuk kepada perbedaan sifat fisik (ukuran/bobot
molekul) dari komponen analit.
Pemisahan yang terjadi disebabkan oleh perbedaan
bentuk dan ukuran molekul (BM) dari setiap
komponen analit yang terdapat dalam suatu
campuran.
Teknik kromatografi gel filtrasi mampu memisahkan
molekul dari ukuran 100 Da hingga 150.000 kDa.

Prinsip Pemisahan KGF

Pengamatan secara mikroskopis terhadap partikel fase

diam yang digunakan dalam gel filtrasi memiliki pola
yang mirip dengan spon pembersih.
Larutan yang terdiri dari campuran analit dengan
berbagai ukuran BM dan fase geraknya dilewatkan
kedalam kolom yang mengandung partikel berpori
tersebut.
Komponen dengan ukuran molekul
yang lebih besar dari ukuran pori
tidak mampu terserap ke bagian
dalam fase diam sehingga akan
terelusi lebih cepat, Sebaliknya,
komponen yang ukurannya lebih
kecil dari pori-pori fase diam akan
masuk dan terdifusi di dalam
matriks fase diam sehingga waktu
elusinya semakin lama.

Mekanisme pemisahan KGF

Beberapa istilah dalam kromatografi

gel filtrasi
Limit Ekslusi : ukuran dari massa molekul terkecil dari suatu komponen
analit yang tidak mampu berdifusi ke dalam pori-pori fase diam.
Misalnya, limit ekslusi dari Sephadex G-50 adalah 30.000 Da.
Fractional range : Sephadex G-50 memiliki range pemisahan antara
1500 30.000 Da. Komponen yang masuk dalam range ini akan terpisah
dengan baik dalam suatu fraksifraksi pemisahan yang linier.
Water regain and bed volume : Berat air yang digunakan untuk
melarutkan 1 g gel kering dikenal dengan water regain. Untuk G-50,
nilainya adalah 5.0 + 0.3 g. Sedangkan bed volume merujuk pada
jumlah volume akhir ketika 1 g gel kering dilarutkan dalam air.
Gel particle shape and size : Idealnya partikel gel harus memiliki ukuran
dan bentuk yang seragam dengan densitas pori-pori yang relative tinggi.
Ukuran partikel pori biasanya ditulis dalam satuan mesh atau diameter
pori (m).
Elution volume : ukuran volume larutan buffer yang digunakan untuk
mengelusi komponen analit hingga keluar dri kolom.

Karakteristik media gel filtrasi

Aplikasi kromatografi gel filtrasi

Desalting dan pemurnian : pemisahan garam-garam
anorganik, pelarut organik dan mineral-mineral kecil
dalam purifikasi makromolekul (protein/asam nukleat)
dapat dilakukan dengan teknik yang sederhana, cepat
dan ekonomis.
Penentuan BM : Volume elusi untuk beberapa komponen
analit dalam suatu campuran dapat ditentukan secara
proporsional dan nilainya berbanding lurus dengan
ukuran molekul.
Untuk menetukan nilai BM suatu senyawa, biasanya
digunakan molekul standar sebagai pembanding lalu
dibuat kurva kalibrasi dengan memetakan log Mi (BM)
dengan volume elusi.

KROMATOGRAFI AFINITAS
Kromatografi kolom yang digunakan untuk
pemisahan molekul yang spesifik.
Interaksi spesifik ligan-molekul target mirip
dengan
interaksi
spesifik
enzim
substrat/antibodi-antigen.

Principle of Affinity Chromatography

Inject a sample into an initially equilibrated affinity

chromatography column(AFpak).
Only the substances with affinity for the ligand are retained
in the column.
Other substances with no affinity for the ligand are eluted
from the column.
The substances retained in the column can be eluted from
the column by changing pH or salt or organic solvent
concentration of the eluent.

Jenis Ligan dan Aplikasi

Product
Product name
code
F7118954 AFpak ADS-894
F7118945 AFpak AHR-894
F7118946 AFpak APA-894
F7113050 AFpak APG-894
F7118959 AFpak AWG-894

F7118964 AFpak ACH-494

Ligand

Applications

Dextran sulfate
Heparin
Protein A
Protein G
Wheat germ agglutinin
(WGA)

Lipoproteins, blood coagulation

factors
Lipoproteins, blood coagulation
factors
Human IgG, immune complexes
Human IgG, immune complexes
Glycoproteins, polysaccharides

Choline oxydase,
acetylcholine esterase

Choline, acetylcholine