FRAKSINASI SEL DAN

PEMURNIAN PROTEIN

Contents
Prinsip Dasar Pemisahan sel
Metode Penghancuran sel

I Nyoman Suarsana

Pemisahan Organel sub-seluler dan enzim

Sentrifugasi
Metode Pemurnian protein

LABORATORIUM BIOKIMIA
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

Prinsip Dasar Pemurnian Biomolekul/Protein

TUJUAN PEMBELAJARAN
z Memahami

Prinsip Dasar Pemisahan

Biomolekul
z Mengetahui Jenis-jenis Metode Praksinasi
Sel
z Mengetahui Cara Pemisahan Sub-organel
Dan Protein
z Mengetahui Teknik Sentrifugasi
z Mengetahui Metode Pemisahan Protein

Organelle

Cell

Homogenization

Small molecule
Amino acid, Sugar,
Nucleotides, etc

Macromolecule
Nucleic
acid

Protein

Ammonium sulfate
Size
Gel filtration,
SDS-PAGE,
Ultrafiltration

Charge

Carbohydrate

(Lipid)

Cell
Debris

fractionation
Polarity

Affinity

Ion exchange,
Reverse phase
Affinity
Chromatofocusing, chromatography, chromatography,
HIC,
Disc-PAGE,
Hydroxyapatite
Salting-out
Isoelectric focusing
Juang RH (2004) BCbasics

Bagaimana memisahkan benda

Shape
Size
Density

2 3 4 5 6

10 11

2 3

Shape

4 5 6

7 8
Density

cotton

7
10 11

wood

stone

Perbedaan sidemen

Perbedaan kecepatan
menggelinding

z
z

Sel dihancurkan dengan salah satu teknik

penghancuran sel (pemilihan metode sangat
penting)
Tahap berikutnya adalah fraksinasi suspensi
yang berisi bermacam-macam organel
Biasanya menggunakan teknik sentrifugasi
standar (bergantung pada ukuran dan BJ)
Dua Teknik sentrifugasi untuk pemisahan
organel
Sentrifugasi diferensial
Sentrifugasi densitas bertingkat

Pemecahan non-mekanik
A.
B.
C.
D.

2.

Kejutan Osmotik
Pembekuan
Detergen
Enzim (lisozim)

Pemecahan mekanik
A.
B.
C.
D.
E.

Homogenisasi tingkat tinggi

Ekstruksi tekanan tinggi
Metode blending
Metode penggerusan mekanis
Metode sonikasi

Juang RH (2004) BCbasics

Pemisahan sub-organel

1.

12

Saringan perbedaan
ukuran

Metode Praksinasi Sel

12

wood stone cotton wood wood cotton stone wood stone cotton stone cotton

Size

7 8 9

Densitas Partikel sub organel dalam sukrosa

Partikel sub organel

Densitas rata-rata
(g/cm3)

Ribosom
Inti
Peroksisom (hewan)
Kloroplas
Lisosom
Mitokondria
Membran plasma
Retukulum (kasar)
Membran Golgi

1,6
1,32
1,23
1,22
1,21
1,19
1,17
1,16
1,14

Bagaimana memonitor hasil

pemurnian sub organel
z Berat

jenis
z Uji terhadap enzim penanda
z Mengukur kadar protein (Lowry)
z Teknik imunohistokimia
z Mikroskop elektron (TEM)

Sentrifugasi
z Kecepatan

pengendapan sedimen
bergantung pada:
sifat partikel (ukuran, bentuk, densitas),
sifat medium pelarut partikel (visikositas

dan densitas)
Gaya yang bekerja pada partikel (gaya
sentrifugal)

Enzim penanda sub organel

Partikel sub-organel
Sitoplasma
Membran sel
RE (kasar)
Lisosom
Peroksisom
Mitokondria
Inti
Membran Golgi

Enzim penanda
Laktat dehidrogenase
Adenilat siklase
Asam ribonukleat
Asam fosfatase
Katalase
Sitokrom c
Adenil transferase
Galaktosil transferase

Jenis-jenis pemisahan sentrifugasi

1. Sentrifugasi diferensial
2. Sentrifugasi densitu gradient (densitas

berjenjang)

Berdasarkan kecepatan
1. Sentrifugasi kecepatan rendah (2000-

6000 rpm atau 6000 g)

2. Sentrifgasi kecepatan tinggi (1800025000 rpm atau maks 60000 g)
3. Ultrasentrifugasi (lebih dari 60.000 g)

ISOLASI DAN PEMURNIAN PROTEIN

DENGAN
ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY

Out Line :
&Pendahuluan
&Dasar Purifikasi protein

I Nyoman Suarsana

&Kromatografi
&Kromatografi Penukar Ion
Prinsip Kerja
Matriks
Aplikasi dan Cara kerja

&Memonitor Hasil Pemurnian

LABORATORIUM BIOKIMIA
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

&Manfaat IEC

PENDAHULUAN
z

Ditemukan Pertama Kali Oleh Mikhail S. Tsvet 1901

Ilmuwan A.J.P.Martin dan R.L.M. Synge Th. 1953

(Nobel penemuan Kromatografi Partisi)
Teknologi kromatografi berkembang pesat

Kromatografi (Yunani:chroma=warna,
gaphein=menulis)

Kromatografi: suatu proses yg berdasarkan kepada

distrisbusi yang bersifat diferensial dari komponen
sampel diantara dua fase yaitu fase mobil dan fase
diam/Stasioner

DASAR PEMURNIAN PROTEIN

Princip Dasar Pemurnian Protein

Organelle

Cell
Secara Umum Protein harus Dipisahkan dari Bahan
Pencemar Sebelum Dipelajari Fungsi dan Strukturnya.
Metode Pemurnian Berdasarkan atas Keuntungan Sifat
Individu pada Protein :

Homogenization

Small molecule

Macromolecule

Amino acid, Sugar,

Nucleotides, etc

Nucleic
acid

Protein

Ammonium sulfate
Size
Gel filtration,
SDS-PAGE,
Ultrafiltration

Carbohydrate

Cell
Debris

(Lipid)

fractionation

Charge

Polarity

Affinity

Ion exchange,
Reverse phase
Affinity
Chromatofocusing, chromatography, chromatography,
HIC,
Disc-PAGE,
Hydroxyapatite
Salting-out
Isoelectric focusing
Juang RH (2004) BCbasics

SIFAT-SIFAT PROTEIN YANG DIGUNAKAN DALAM

PEMURNIAN

Struktur Dasar Asam Amino

L-Form Amino Acid Structure

Carboxylic group
Amino group

+
H3 N

Ion Exchange Chromatography

Basa

R group

COO

Asam

H
H = Glycine
CH3 = Alanine
Juang RH (2004) BCbasics

R = Gugus Non-polar (8)

R= Gugus Polar tidak bermuatan (7)
R= Gugus bermuatan positif (3)
R= Gugus bermuatan negatif (2)

Peptida dan Protein adalah Polimer Asam Amino yang

Dihubungkan Dengan ikatan amide

Lingkungan asam

Lingkungan netral

Lingkungan basa

pK2 ~ 9

NH2 H+
R-C-H
COOH

NH2 H+
R-C-H
COOpK1 ~ 2

NH2
R-C-H
COO-

5.5

muatan
+1

muatan
-1

Isoelectric point

Juang RH (2004) BCbasics

E nvironment pH vs P rotein C harge

Buffer pH

10
9
8
7
Isoelectric point,
pI

6
5
4
3

Net Charge of a Protein

Juang RH (2004) BCbasics

Muatan bersih protein pada berbagai nilai pH

Kurva titrasi Alanin. Bentuk Ion yang utama pada
berbagai pH diperlihatkan dalam Kotak. R menunjukkan
gugus metil dari alanin

KROMATOGRAFI
z Pemisahan

dengan Teknik Kromatografi

menyangkut beberapa Hal:
1. Kecendrungan suatu Molekul larut
dalam suatu cairan
2. Kecendrungan suatu molekul untuk
melekat pada suatu Matrik

Berdasarkan pada muatan bersih protein (net charge) pada pH yang

3. Kecendrungan suatu molekul untuk

dipilih. Protein bersifat Ampolit dan dapat berikatan pada kedua tipe
Penukar ion.
Kestabilan protein dalam kisaran pH tertentu merupakan faktor
pembatas

Dasar Teori
z Misal

resin mengandung ion B diletakkan

dalam larutan yang berisi ion A sampai
mencapai kesetimbangan, maka koefisien
selektivitas KAB dapat didefinisikan dari
kesetimbangan : A + Br
Ar + B,
dimana :
A: ion A dalam larutan,
Ar: ion A terikat dalam resin,
B : ion B dalam larutan,
Br : ion B terikat dalam resin.

menguap

Dasar Teori
Sehingga,
[Ar] [B]
KA,B =
[A] [Br]
persamaan ini didefinisikan lebih tepat menjadi:
aAr aB
KA,B =
aA aBr
dimana a adalah aktivitas ion, selanjutnya KA,B dapat
dituliskan menjadi:

Dasar Teori
KA,B =

Dasar Teori

Ar B

XAr [B]

Plate Teori menurut AJP. Martin dan RLM. Synge:

atau,
Br A

XBr [A]

Distribution Coefficient (K)

Ar B

Definition :

KA,B = Q x
Br A

Concentration of component A in stationary phase

Untuk XAr dan XBr adalah konsentrasi dalam fraksi mol sedangkan
adalah koefisien aktivitas. Q disebut sebagai koefisien konsentrasi.
Dengan demikian disederhanakan menjadi
B

Br

Ar

Q = Q

=K
K=Q
A
Ar
Br
Bagi konsentrasi ion yang rendah dalam larutan maka Q mendekati Q,
karena koefisien aktivitasnya mendekati satu. Mengapa Q (K) disebut
juga koefisien selektivitas sebab bila K besar maka resin akan
menyukai ion A, sedangkan bila nilai K kecil resin akan menyukai ion
B.

KLASIFIKASI KROMATOGRAFI
z

Berdasarkan jenis fase stasioner (padatan atau cairan) dan fase

mobil (cairan atau gas): ada 4
1. Padatan - Cairan
Kromatografi Adsorpsi (Mikhail Tsvet)
Kromatografi Penukar Ion
Kromatografi Gel Filtrasi
Kromatografi Afinitas
2. Padatan - Gas
Kromatografi Gas-Padatan (GSC)
3. Cairan - Cairan
Kromatografi Partisi
Kromatografi Kertas
Kromatografi Lapis Tipis (TLC)
4. Gas - Cairan
Kromatografi Gas-Cairan (GC)
Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi (HPLC)

Concentration of component A in mobile phase

K=diasumsikan sebagai konsentrasi bebas, dapat
berubah sesuai eksperimen.
Nilai K dipengaruhi oleh: Panjang Kolom,
kecepatan aliran, dan waktu retensi volume

ION-EXCHANGE CHROMATOGRAPHY (IEC)

Prinsip Kerja :
Pemisahan dengan IEC berdasarkan atas
interaksi muatan ionik yang berbeda dari
komponen sampel terhadap sisi aktif
muatan pada matriks penukar ion.

+NH R
3

Na+
Na+

Terdapat dua penggunaan jenis resin Penukar Ion :

RSO3
Resin

+NH R
3

Dalam Kromatografi Penukar Ion, protein dipisahkan dengan

yang lain berdasarkan atas muatannya.

+NH R
3

Na+

+NH R
3

-OOCR

Na+

RSO3Resin

+NH R
3

+NH R
3

Na+

Na+
Na+
-OOCR
+NH R
3

+NH R
3

Penukar Kation (cation exchanger)

RSO3- .......Na+
+ +NH3R
Matrik
counter
muatan
penukar ion
sampel

Ada dua tipe IEC :

1. Kromatografi Penukar Kation
2. Kromatografi Penukar Anion

-OOCR

Cl-

-OOCR

Cl(R)4N+
Resin

+NH R
3

Cl-

-OOCR
-OOCR

Cl-

RSO3-........+NH3R + Na+
ikatan molekul
ion
ion
yg ditukar

Chromatography of Amino Acids

-OOCR

ClStationary Phase

-OOCR
-OOCR

N+

(R)4
Resin

-OOCR

Mobile Phase

ClSO

Na

+NH R
3

H 3N

COOH
Na

SO

Cl-

OH

H 3N

COOH
Exchange Resin
SO

H 3N +

COOH
SO

Penukar Anion (anion exchanger)

(R)4N+.........Cl-

-OOCR

(R)4N+.......-OOCR + Cl-

H 3N +

Na
Na
SO

pH3.5

OH

3
+

COO

OH

=H

2O

=H

2O

H 3N

COO
-

SO 3 Na

OH

pH4.5

Gugus Penukar Ion yang Digunakan dalam Pemisahan Protein

Matriks
Nama matriks

Gugus bermuatan

Jenis matriks

Perkiraan cakupan
pH untuk
fraksinasi

Sellulosa DEAE

C2H3
-O-CH2-CH2N+HClC2H3
(dietilaminoetil)

Penukar
lemah

anion

3,5 - 10

AE-selulosa

-O-CH2-CH2-NH3+
(aminoetil)

Penukar
kuat

anion

3,5 - 14

Q-sepharosa

-CH2-N+(CH3)3
( Amina kuartener)

Penukar
kuat

anion

3,5 - 14

Sellulosa KM

-O-CH2-COO-N+
(karboksimetil)

Penukar
lemah

kation

3,5 - 10

S-sepharosa

-SO3-

Penukar
kuat

kation

3,5 - 10

(sulfonil)
-PO4H2(Phospat)

Penukar
lemah

kation

3,5 - 10

P-selulosa

STRONG CATION
-

SO3

Sulpho
Sulphomethyl
Sulphopropyl

CH2SO3 C3H6SO3-

COO CH2COO-

WEAK CATION
Carboxy
Carboxymethyl

STRONG ANION
Triethylaminomethyl
CH2N+(CH3)3
C2H4N+(C2H5)3
Triethylaminoethyl
C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3 Diethyl-2-hydroxypropylaminoethyl
WEAK ANION
Aminoethyl
C2H4N+H3
C2H4N+H(C2H5)2
Diethylaminoethyl

Sifat matrik
z Besar

partikel dapat mempengaruhi

kecepatan penukar dan permeabilitas kolom

z Derajat

ikatan silang dapat mempengaruhi

porositas, kekerasan dan pembengkakan

z Kekuatan

gugus fungsional dapat

mempengaruhi koefisien distribusi

z Banyaknya

gugus fungsional menentukan

matriks

10

Fast Protein Liquid Chromatograph (FPLC)

Komponen Kromatografi

No air bubbles
(Priming)
Use degassed buffers

Injector Module
2
Monitor untuk
melihat
kromatogram

Kolom berisi
matrik
Kromatografi
AXTAExplorer

Fraction
collector

Column Inlet
3
Detector 4
Fraction
5
Collector

(www.pharmacia.com)

11

Cara Kerja
Ion Exchange Chromatography

12

Tahap I adalah kesetimbangan terhadap fase

stasioner atau fase diam untuk membuat
kondisi awal yang diinginkan. Ketika terjadi
kesetimbangan, semua bagian dari gugus
muatan pada fase stasioner berikatan dengan
counter ion penukar, misalnya Ion Klorida
(Cl-) atau Sodium (Na+).

Tahap II adalah aplikasi sampel dan

pencucuian. Tujuan pada tahap ini adalah
untuk mengikatkan molekul yang menjadi
target dan mencuci semua material yang
tidak terikat dengan sampel buffer yang
mempunyai pH dan kekuatan ionik sama,
seperti buffer awal agar supaya semua
muatan protein berikatan dengan tepat

Dalam tahap ketiga ini, elusi, biomolekul

dilepaskan dari penukar ion dengan
mengubah komposisi buffer, yang umum
digunakan adalah peningkatan ionik dengan
NaCl atau garam sederhana lainnya agar
supaya terjadi penurunan ikatan protein.
Deabsorpsi protein relatif terhadap jumlah
gugus bermuatan pada permukaannya

13

0
2

Tahap akhir, regenerasi, membuang semua

molekul yang masih berikatan, ini untuk
memastikan bahwa kapasitas penuh dari fase
stasioner untuk dapat digunakan selanjutnya

MEMONITOR PEMURNIAN
z Penentuan

jumlah protein pada setiap fraksi

dg Metode Lowry 280 nm
z Uji aktivitas (assay enzim, assay hormon,
assay biologis lainnya)
z SDS-PAGE
z Focusing isoelectric
z Sequencing asam amino

MANFAAT PENGGUNAAN IEC

z Pemisahan

Protein
z Menghilangkan Ion
z Pemisahan logam
z Pemekatan bahan-bahan runut berkadar
kecil

14

Fig 1. The larger the net charge, the stronger is the

adsorption. The size of the arrow to the right represents
the adsorption strength

Fig 2. The higher the net charge, the higher

the salt concentration required for desorption

15

Prosedur IEC:
Aktivasi Resin Penukar Ion:
1 Sebanyak 5 gr resin digodok dengan NaOH 2 N
selama 2 jam.
2. Setelah digodok, cuci dengan air hingga pHnya 7
3. Rendam resin yang telah dicuci dengan HCl 6 N selama 30
menit.
4. Cuci hingga bebas Cl

Pembuatan Kromatografi Penukar Ion

1. Siapkan kolom (P=30 cm, =2,5 cm), masukkan kebawah kolom
glass wool atau kapas.
2. Isi kolom yang sudah disiapkan dengan aqudes (+15 ml)
3. Masukan resin yang sudah diaktivasi ke dalam kolom dengan
bantuan air, sambil diaduk agar tidak ada udara yang
terperangkap. Permukaan resin harus terendam pelarut.

16