Kromatografi Afinitas

Disusun Oleh
Desta Vantyca
M. Nizar Aristya
Resky
Yuke Puspita
Yulia Nofiana

PROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
2016
 Kromatografi

Apa itu kromatografi?

Kromatografi merupakan instrumen pemisahan yang sangat selektif dan
digunakan secara luas pada proses isolasi atau permurnian
makromolekul.
 Jenis Kromatografi

hydrophobic
interaction
chromatography
reversed-phase
chromatography ion-exchange

size-exclusion Jenis affinity

chromatography Kromatografi chromatography
 Prinsip Kerja
Kromatografi afinitas menggunakan prinsip afinitas untuk
memurnikan atau memisahkan berbagai macam komponen.
Afinitas merupakan gaya tarik antar dua komponen atau zat
yang besarannya sangat spesifik untuk tiap komponen.
Interaksi terjadi karena adanya spesifitas biologis seperti
bentuk atau konformasi yang dapat mengenali komponen
lain lalu berikatan karena memiliki bentuk yang sesuai
(Ostrove, 1990).
Persitiwa ini terjadi pada interaksi enzim dengan substrat atau
antibodi dan antigen yang merupakan substansi biologis.
Interaksi ini bersifat sangat spesifik sehingga sangat bisa
diandalkan untuk memurnikan produk dengan kualitas tinggi.
Pada gambar 1, dijelaskan prinsip kerja
kromatografi afinitas. Dapat dilihat pada
gambar tersebut, terdapat fasa bergerak atau
pelarut yang membawa dua komponen berbeda.
Pelarut tersebut disebut sebagai application
buffer. Kemudian campuran tersebut
diinjeksikan ke dalam kolom kromatografi
afinitas.
Molekul yang memiliki afinitas yang spesifik
dengan ligan akan berinterakasi (binding)
dengan ligan sehingga molekul lain akan keluar
terlebih dahulu dari kolom. Setelah itu, untuk
memisahkan ligan dengan molekul yang terikat
kuat dengannya, molekul tersebut dielusi
menggunaan pelarut yang disebut elution
buffer.

Gambar 1. Prinsip kerja kromtorafi afinitas

Teknik Kromatografi Afinitas
Afinitas merupakan gaya tarik
antar dua komponen atau zat
yang besarannya sangat
Teknik yang digunakan
oleh kromatografi afinitas spesifik untuk tiap komponen.
adalah mengadaptasi
interaksi yang bersifat
reversibel dan spesifik
layaknya peristiwa yang
Interaksi antara dua komponen
banyak terjadi pada
sistem biologis seperti karena afinitas tersebut
interaksi antigen dengan dimanfaatkan pada kromatografi
antibodi atau enzim afinitas dengan cara membuat salah
dengan substrat.
satu komponen terimobilisasi (ligan)
pada matriks. Kromatografi afinitas
memiliki berbagai variasi bergantung
pada jenis ligan yang digunakan.
 Interaksi antara dua komponen karena afinitas tersebut
dimanfaatkan pada kromatografi afinitas dengan cara
membuat salah satu komponen terimobilisasi pada matriks
atau dapat disebut material pendukung (support material).
Media padat tersebut kemudian dimasukan dalam kolom
kromatografi yang kemudian dikenal sebagai ligan afinitas
(affinity ligand). Ligan tersebut merupakan fasa stasioner pada
kolom kromatografi afinitas (Ruhn, 2006)
 Pemilihan Material Pendukung
(Matriks) pada Kromatografi Afinitas
Matriks berperan penting dalam memfasilitasi saling
berinteraksinya ligan dengan komponen spesisfiknya.
Matriks terbagi menjadi matriks berpori (porous matrix)
dan tidak berpori (nonporous matrix).
Matriks dengan pori memiliki luas permukaan yang besar
tetapi waktu difusi bagi komponen target menuju ligan
yang tertambat dalam pori matriks juga lebih besar
dibandingkan dengan matriks tidak berpori.
Kriteria matriks yang baik digunakan

Hidrofilik

Stabil
Inert secara
kimia

Matriks

Memiliki
diameter Memiliki
partikel ukuran
matriks pori yang
yang sesuai
sesuai
Stabil
secara
mekanik
Tabel 1. Matriks yang umum digunakan
 Pemilihan Ligan
Afinitas antara ligan dan komponen target adalah hal yang paling utama
untuk dipertimbangkan.
Ligan dapat dikelompokkan menjadi ligan sintetik dan ligan biologis.
Ligan biologis memiliki kelebihan pada spesifitas dan afinitasnya terhadap
komponen target yang tinggi. Namun, ligan biologis memiliki kekurangan
pada ketidakstabilannya saat proses sterilisasi. Hal ini menyebabkan usia
ligan menjadi lebih singkat. Selain itu, potensi adanya kontaminasi dari
sumber biologis lebih besar sehingga meningkatkan penanganan pada
tahap akhir proses poduksi yang menyebabkan bertambah mahalnya
produk hasil permurnian. Contoh dari ligan biologis adalah peptida,
protein, oligosakarida, protein, dan (oligo)-nukleotida (Clonis, 2006).
Ligan sintetik dapat menjadi solusi bagi semua kekurangan ligan biologis
kecuali afinitas dan spesifitasnya.
 Tabel 2. Perbandingan ligan sintetik dan bilogis

Sifat Jenis Ligan

Sintetik Biologis
Selektivitas Sedang-tinggi Sangat tinggi

Stabilitas Tinggi Rendah-sedang

Kapasitas Tinggi Rendah- sedang

Harga Rendah-Medium Medium- tinggi

Toksisitas Sedang rendah

 Jenis Ligan
ligan
oligonukle
otida dan
koenzim
nukeotida

ligan Berdasarkan Ligan

Jenis
nukleotida Molekulnya peptida

Ligan
pewarna
tekstil
(dye-
ligand).
 Terdapat dua jenis ligan Tabel 3. Jenis ligan covalent coupling
bergantung pada interaksinya Ikatan Grup ligan Spesifitas
dengan komponen target. CNBr NH2 Protein,
Peptide
Thiolpr SH Sulfihidril
Ligan yang berinteraksi opil
dengan komponen target Thiol SH Sulfihidril
berdasarkan konformasi atau Epoksi NH2 Protein,
OH Peptida
bentuk dari suatu gugus SH
spesifik disebut sebagai Tresil NH2 Karbohidrat
group-specific gels. Amino COOH Sulfihidril
heksil
Ligan yang berinteraksi Karbok NH2 Protein, asam
menggunakan ikatan kovalen silheks
dengan komponen target il
disebut sebagai covalent amino pada
peptida,
coupling gels. Asam
Karboksilat
pada protein
Tabel 4. Jenis ligan group-specific gels dan spesifitasnya

Ligan Spesifitas
NAD, NADP Dehidrognase
Lektin Polisakarida
Poliurasil (Poli(U)) Poliadenin (Poli(A))

Histon DN
Protein A Fc Antibodi
Protein G Antibodi
Lisin rRNA,dsDNA, plasminogen

Arginin Fibronektin, protombin

Heparin Lipoprotein, DNA, RNA
Blue F3G-A NAD+
Red HE-3B NADP+
Orange A Laktat dehidrogenase
Benzamidine Serin protease
Green A Protein CoA,HAS, dehidrogenase

Gelatin Fibronektin
Polimiksin Endotoksin
2,5-ADP NADP+
Calmodulin Kinase
Boronate cis-Diols,tRNA, plasminogen
Blue B Kinase,dehidrogenase, protein pengikat asam nukleat
 Penyematan ligan pada matriks

Terdapat tiga komponen yang harus disatukan untuk membentuk fasa

stasioner pada kolom kromatografi afinitas, yaitu permukaan atau resin
(matriks), pengikat (spacer), dan ligan.
Salah satu faktor yang memengaruhi pengikatan ligan pada matriks
adalah keberadaan gugus fungsional pada ligan.
Gugus fungsi yang umum terdapat pada ligan adalah gugus amin primer,
karboksil, dan thiol.
Selain itu, ligan juga dapat dimodifikasi untuk mendapatkan gugus yang
reaktif pada ligan.
Modifikasi tersebut dapat berupa oksidasi karbohidrat atau penyematan
secara kovalen gugus reaktif ortogonal.
Afinitas
Ligan

multi-site streric orientasi

attachment hindrance dari ligan
 Teknik Penyematan Ligan

adorpsi
biospesifik
dan
nonspesifik

Teknik Penyematan
Ligan

diperangkap
Imobilisasi
dalam pori
Ikatan Kovalen
(entrapment)
 Terdapat beberapa teknik untuk menyematkan ligan pada matriks, antara
lain dengan ikatan kovalen, adorpsi pada permukaan dengan interakasi
biospesifik dan nonspesifik, diperangkap dalam pori (entrapment), dan
berkoordinasi dengan ion logam (Magdeldin, 2012).
Imobilisasi menggunakan ikatan kovalen merupakan teknik yang paling
umum digunakan (Kim dkk, 2006). Imobilisasi dengan ikatan kovalen
lebih selektif dibanding metode imobilisasi lainnya.
Imobilisasi dengan adsorpsi nonspesifik adalah dengan membuat ligan
teradsorp pada matriks melalui interaksi coulombic, ikatan hidrogen, dan
interaksi hidrofobik.
entrapment, yaitu memerangkap ligan dengan capping agent. Salah satu
contoh metode ini adalah entrapment albumin dari serum manusia (Human
Serum Albumin) menggunakan matriks berupa hydrazide-activated
supports dan capping agent berupa glikogen teroksidasi (Jakson, 2012).
 Metode pemurnian menggunakan kromatografi afinitas

Pemurnian dengan kromatografi afinitas dimulai dengan

penanganan sampel dan matriks.
Selanjutnya adalah penangkapan komponen target oleh ligan
yang kemudian di ikuti dengan pencucian untuk memisahkan
komponen lain.
Tahap berikutnya dilakukan elusi untuk melepaskan ikatan
antara ligan dengan komponen target.

Pengikatan
Penyiapan
dan Elusi
sampel
pencucian
 Proses Pemurnian
Kromatografi Afinitas
pencucian
komponen
nontarget

pengikatan elusi
komponen Proses komponen
target pada Pemurnian target dari
ligan ligan

regenerasi
ligan
 IMAC berbeda dengan kromatografi afinitas yang lain karena IMAC menggunakan
sebuah penanda atau tag pada protein.
IMAC memanfaatkan interaksi antara asam amino dari protein target dengan ion
Immobilized logam yang terkelat (chelated metal ion) pada kolom (Smith dkk, 1987).
metal ion Prinsip dasar yang masih digunakan hingga saat ini adalah menngunakan ion logam
affinity yang terimobilisasi seperti Cu2+, Ni2+, dan Zn2+ untuk memurnikan protein dengan
chromatography basis kandungan asam asmino histidin pada protein tersebut.
(IMAC)
. Ion logam tersebut membentuk kompleks dengan agen pengkelat (chelating agent)
yang disebut immobilized metal chelat complex (IMCC).
IMAC banyak digunkan untuk memurnikan komponen dalam suatu campuran yang
sangat kompleks seperti memurnikan protein dalam serum.

Bioaffinity chromatography adalah kromatografi afinitas yang menggunakan ligan

Bioaffinity biologis atau sering dikenal sebagai biospecific adsoption.
chromatography Terdapat beberapa jenis ligan biologis yang sering digunakna, yaitu protein pengikat
immunoglobulin, enzim, lektin, karbohidrat, protein serum, dan sistem avidin/biotin
(Hage dkk, 2006).

Kromatografi afinitas jenis ini memurnikan protein khusunya antibodi (immunoglobulin)

Immunoaffinity menggunakan ligan-ligan seperti protein A yang diproduksi oleh bakteri Staphylococcus
chromatography aureus dan protein G yang diperoleh dari grup C dan G Streptococci.
 Proses imobilisasi enzim dilakukan melalui dua tahap, yaitu tahap pertama dengan
aktivasi media pendukung (support) dengan carrier.
Immobilized
enzyme Jenis support yang paling banyak digunakan adalah selulosa dan polisakarida.
Selanjutnya, tahap kedua, yaitu enzim berikatan kovalen dengan carrier.

Lektin adalah protein yang bukan berasal dari sistem imun tetapi memiliki
kemampuan untuk mengenali dan berikatan dengan residu karbohidrat spesifik.
Lektin
Dua jenis lektin yang paling umum digunakan pada kromatografi afinitas adalah
canavalin A dan wheat germ agglutinin.

Ligan lain yang digunakan pada kromatografi afinitas adalah karbohidrat. Salah
satu karbohidrat yang banyak digunakan adalah siklodestrin.
Keutaman penggunaan siklodekstrin adalah kiralitas yang dimilikinya sehingga
Karbohidrat
dapat dimanfaatkan untuk mengikat molekul kiral.
Sebagai contoh, protein fikolin berhasil diisolasi dari serum manusia dengan
mengunakan kolom sepharose yang mengandung N-Asetil glukosamin.
 Protein serum juga banyak digunakan sebagai ligan pada kromatografi afinitas.
Contoh protein serum yang banyak digunakan adalah Human Serum Albumin
(HSA) atau Bovine Serum Albumin. Aplikasi protein serum salah satunya untuk
Protein serum meneliti interaksi protein dengan zat padat.

Aplikasi dari penggunaan avidin/biotin adalah biotin dapat dijadikan penanda ata
Avidin dan tag pada target yang diinginkan kemudan biotin ditangkap oleh avidin
Biotin streptovidin yang terimobilisasi.

Reversed phase ditujukan pada terbaliknya sifat ligan dengan fasa bergerak pada kromatografi
Reversed phase afinitas.
chromatography Pada reversed phase ligan bersifat hidrofobik nonpolar dan fasa bergerak bersifat hidrofilik
polar. Contoh ligan yang bersifat nonpolar adalah oktadesil (C18).
 Aplikasi industri kromatografi afinitas

Aplikasi kromatografi afinitas di industri didominasi oleh purifikasi protein bernilai

tinggi khususnya untuk therapeutic protein pada bidang farmasi (Clonis, 2006).

Pemurnian Plasmid DNA untuk terapi

gen dan vaksin DNA
Produksi protein plasma therapeutical protein, Saat ini mulai berkembang
adanya terapi gen, yakni
pharmaceutical protein, dan enzim memasukkan asam nukleat ke
Kromatografi afinitas saat ini banyak digunakan dalam sel manusia dengan
tujuan memperbaiki keadaan
untuk pemurnian protein plasma yang digunakan genetik seseorang.
untuk keperluan terapi. Asam nukleat yang dimasukkan
dapat berupa DNA rantai
Selain itu, kromatografi afinitas yang tunggal dan ganda atau RNA.
menggunakan dye sebagai ligan juga banyak Asam nukleat tersebut dibawa
ke dalam sel manusia
digunakan dalam jumlah besar untuk menggunakan vektor berupa
menghasilkan pharmaceutical protein dan enzim. plasmid DNA.
Plasmid DNA diperoduksi oleh
bakteri rekombinan yang
kemudian di murnikan
menggunakan kromatografi
afinitas jenis reversed phase
(Ferreira dkk, 2000).
 Kesimpulan
Kromatografi afinitas merupakan teknik pemurnian yang saat ini
sedang berkembang pesat karena kelebihannya dalam memurnikan
komponen dengan spesifitas dan kemurnian yang tinggi. Kromatografi
afinitas menggunakan prinsip biologis antara dua molekul yang dapat
mengenali bentuk atau konformasi untuk dapat berinteraksi secara spesifik
layaknya enzim dan substrat atau antara antigen dan antibodi. Terdapat
berbagai jenis kromatografi afinitas bergantung pada ligan yang digunakan.
Sampai saat ini, penggunaan kromatografi afinitas di industri masih
didominasi untuk menghasilkan protein atau molekul murni lain yang bernilai
tinggi. Adapun penggunaan kromatografi afinitas selain itu masih sebatas
untuk analisis skala laboratorium.
 Daftar Pustaka
D. S. Hage, M. Bian, R. Burks, E. Karle, C. Ochnmact and C. Wa, "Bioaffinity Chromatography," in
Handbook of Affinity Chromatography, Northwest, Taylor & Francis Group, 2006, pp. 102- 104.
G. N. M. Ferreira, G. A. Monteiro, D. M. F. Prazeres and J. M. S. Cabral, "Downstream processing
of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications," TIBTECH, pp. 380-387, 2000.
H. S. Kim and D. S. Hage, "Immobilization Methods for Affinity Chromatography," in handbook of
Chromatography, Nortwest, Taylor & Francis Group, LLC, 2006, pp. 35-78.
J. C. Goldsmith, "Pasteurized, monoclonal antibody factor VIII concentrate: establishing a new
standard for purity and viral safety of plasma- derived concentrates," Blood Coagulation &
Fibrinolysis, pp. 203-215, 2000
J. Janson,"Large-scale affinity purification - State of the Art and Future Aspects," Trends in
Biotechnology, vol. 2, pp. 31-38, 1984.