Kromatografi Afinitas

Natasha Agustin Ikhsan*

Jurusan Teknik Kimia, Fakultas Teknologi Industri, Institut Teknologi Bandung

Jalan Ganesa No. 10, Bandung, Indonesia

*Corresponding Author: natashaagustin@students.itb.ac.id

Abstrak
Proses pemisahan secara kimia merupakan salah satu teknologi yang esensial untuk keperluan baik penelitian
mapun komersial. Kromatografi merupakan instrumen pemisahan yang sangat selektif dan digunakan secara
luas pada proses isolasi atau permurnian makromolekul. Jenis kromatografi yang sudah banyak digunakan
dalam kegiatan biopurifications (pemurnian hayati) adalah size-exclusion chromatography, reversed-phase
chromatography, hydrophobic interaction chromatography, ion-exchange, dan affinity chromatography
(kromatografi afinitas). Kromatografi semakin populer digunakan karena dapat digunakan untuk analisis zat
yang bervariasi begitu pula halnya dengan kromatografi afinitas, yaitu kromatografi cair yang menggunakan
bantuan agen pengikat spesifik (specific-binding agent). Teknik yang digunakan oleh kromatografi afinitas
adalah mengadaptasi interaksi yang bersifat reversibel dan spesifik layaknya peristiwa yang banyak terjadi
pada sistem biologis seperti interaksi antigen dengan antibodi atau enzim dengan substrat. Afinitas merupakan
gaya tarik antar dua komponen atau zat yang besarannya sangat spesifik untuk tiap komponen. Interaksi antara
dua komponen karena afinitas tersebut dimanfaatkan pada kromatografi afinitas dengan cara membuat salah
satu komponen terimobilisasi (ligan) pada matriks. Kromatografi afinitas memiliki berbagai variasi bergantung
pada jenis ligan yang digunakan. Proses utama pada pemurnian komponen dengan kromatografi afinitas
adalah pengikatan komponen target pada ligan, pencucian komponen nontarget, elusi komponen target dari
ligan dan regenerasi ligan. Aplikasi kromatografi afinitas umumnya untuk pemurnian protein untuk keperluan
terapi yang bernilai tinggi.

Kata kunci: kromatografi, afinitas, ligan, pemurnian, protein

1. Pendahuluan permurnian makromolekul [2]. Jenis

Proses pemisahan secara kimia merupakan
salah satu teknologi yang esensial untuk
keperluan baik penelitian mapun komersial
terutama untuk memisahkan sampel yang
kompleks. Contoh aplikasi proses pemisahan
dalam jumlah kecil adalah proses untuk
mendapatkan hormon atau kandungan obat
dalam darah manusia yang hanya merupakan
senyawa tapak (trace compound), sedangkan
contoh dalam jumlah besar adalah proses
isolasi protein atau enzim skala industri [1].
Kromatografi merupakan instrumen
pemisahan yang sangat selektif dan digunakan
secara luas pada proses isolasi atau
kromatografi yang sudah banyak digunakan
dalam kegiatan biopurifications (pemurnian
hayati) adalah size-exclusion chromatography,
reversed-phase chromatography, hydrophobic
interaction chromatography, ion-exchange,
dan affinity chromatography (kromatografi
afinitas) [3].
Kromatografi semakin populer digunakan
karena dapat digunakan untuk analisis zat
yang bervariasi begitu pula halnya dengan
kromatografi afinitas, yaitu kromatografi cair
yang menggunakan bantuan agen pengikat
spesifik (specific-binding agent) [1]. Menurut
International Union of Pure and Applied
Chemistry (IUPAC), kromatografi afinitas
 Natasha Agustin Ikhsan, Kromatografi Afinitas, 2015, 1-13
merupakan varian dari kromatografi yang
menggunakan spesifitas biologis pada
interaksi antara analit dan ligan pemisahan [4].
Teknik yang digunakan oleh kromatografi
afinitas adalah mengadaptasi interaksi yang
bersifat reversibel dan spesifik layaknya
peristiwa yang banyak terjadi pada sistem
biologis seperti interaksi antigen dengan
antibodi atau enzim dengan substrat [5], [1].
Proses pemisahan dengan kromatografi
afinitas semakin disukai karena spesifitas
biologisnya yang tinggi [6] dan terhindarnya
komponen yang ingin dimurnikan dari
kontaminasi mikroorganisme jika komponen
tersebut merupakan produk farmasi [7].
Cikal bakal kromatografi afinitas sudah
berkembang sejak tahun 1910 saat Starkensen
berhasil menjerat α-amilasi dengan pati yang
tidak larut [3]. Kromatografi afinitas mulai
dikembangkan pada tahun 1968 oleh
Cuatrecasas, et al [3]. Penggunaan
kromatografi afinitas sudah sangat luas
dimulai dari skala laboratorium sampai skala
industri.
2. Prinsip Dasar Kromatografi Afinitas
Sesuai dengan namanya, kromatografi afinitas
menggunakan prinsip afinitas untuk
memurnikan atau memisahkan berbagai
macam komponen. Afinitas merupakan gaya
tarik antar dua komponen atau zat yang
besarannya sangat spesifik untuk tiap
komponen. Gaya tarik inilah yang akan
membuat dua komponen berkombinasi satu
sama lain.
Interaksi antara kedua komponen tesebut
tidaklah terjadi karena sifat-sifat umum seperti
titik isoelektrik, hidrofobisitas, atau ukuran.
Interaksi terjadi karena adanya spesifitas
biologis seperti bentuk atau konformasi yang
dapat ‘mengenali’ komponen lain lalu
berikatan karena memiliki bentuk yang sesuai
[8]. Persitiwa ini terjadi pada interaksi enzim
dengan substrat atau antibodi dan antigen yang
merupakan substansi biologis. Interaksi ini
bersifat sangat spesifik sehingga sangat bisa
diandalkan untuk memurnikan produk dengan
kualitas tinggi.
2
Interaksi antara dua komponen karena afinitas
tersebut dimanfaatkan pada kromatografi
afinitas dengan cara membuat salah satu
komponen terimobilisasi pada matriks atau
dapat disebut material pendukung (support
material). Media padat tersebut kemudian
dimasukan dalam kolom kromatografi yang
kemudian dikenal sebagai ligan afinitas
(affinity ligand). Ligan tersebut merupakan
fasa stasioner pada kolom kromatografi
afinitas [1].
Komponen yang diinginkan tidak harus
menjadi komponen yang dapat berikatan
dengan ligan. Komponen pengotor juga dapat
berikatan dengan ligan sehingga komponen
yang diinginkan dapat keluar dari kolom
dengan bebas dan cepat. Hal ini juga lebih
diinginkan karena lebih cepat dan mudah
karena komponen langsung dapat diperoleh.
Pada gambar 1, dijelaskan prinsip kerja
kromatografi afinitas. Dapat dilihat pada
gambar tersebut, terdapat fasa bergerak atau
pelarut yang membawa dua komponen
berbeda. Pelarut tersebut disebut sebagai
application buffer. Kemudian campuran
tersebut diinjeksikan ke dalam kolom
kromatografi afinitas.
Molekul yang memiliki afinitas yang spesifik
dengan ligan akan berinterakasi (binding)
dengan ligan sehingga molekul lain akan
keluar terlebih dahulu dari kolom. Setelah itu,
untuk memisahkan ligan dengan molekul yang
terikat kuat dengannya, molekul tersebut
dielusi menggunaan pelarut yang disebut
elution buffer.
 Natasha Agustin Ikhsan, Kromatografi Afinitas, 2015, 1-13
aplikasi
regenerasi pencucian
n n
Elusi
Gambar 1. Prinsip kerja kromatografi afinitas
(Diadaptasi dari: [1])
Regenerasi
Aplikasi
Elusi
Respon
Waktu (atau volume)
Gambar 2. Skema pemisahan pada
kromatografi afinitas (Diadaptasi dari: [1])
3. Pemilihan Material Pendukung
(Matriks) pada Kromatografi Afinitas
Pemilihan matriks merupakan kunci penting
dalam desain kromatografi afinitas. Matriks
berperan penting dalam memfasilitasi saling
berinteraksinya ligan dengan komponen
spesisfiknya. Matriks terbagi menjadi matriks
berpori (porous matrix) dan tidak berpori
(nonporous matrix). Matriks dengan pori
memiliki luas permukaan yang besar tetapi
waktu difusi bagi komponen target menuju
ligan yang tertambat dalam pori matriks juga
lebih besar dibandingkan dengan matriks tidak
3
berpori. Namun, apapun jenis matriks yang
digunakan, matriks yang baik harus memiliki
sifat-sifat sebagai berikut.
Inert
Matriks harus tidak memberikan kontribusi
apapun terhadap proses pemisahan. Oleh
karena itu, matriks harus inert secara kimia
[8], [9].
Hidrofilik
Matriks harus memiliki sifat yang sangat mirip
dengan medium operasi kromatografi afinitas.
Karena umumnya kromatografi afinitas
menggunakan aqueous solutions yang bersifat
hidrofilik, matriks juga harus bersifat
hidrofilik [10].
Stabil secara kimia
Matriks haruslah bersifat stabil secara kimia
dibawah kondisi operasi yang digunakan.
Selain itu, matriks juga harus stabil dibawah
paparan pelarut, eluen, dan molekul lain yang
terdapat dalam sistem [10].
Stabil secara mekanik
Matriks juga harus memiliki kekuatan yang
cukup untuk menahan pressure drop yang
cukup besar sepajang kolom. Pressure drop
dalam kolom dapat mencapai ratusan bar.
Memiliki ukuran pori yang sesuai
Matriks tidak boleh menghalangi akses ligan
dengan komponen spesifiknya. Oleh karena itu
jika zat terlarut yang ingin berikteraksi dengan
ligan merupakan makromolekul, matriks harus
memiliki diameter pori yang besar. Terdapat
perumusan ukuran diameter pori yang sesuai
dengan kebutuhan yang dirumuskan oleh [10].
𝑅 𝑅
3
𝑅
5
𝐷𝑒𝑓𝑓 = 𝐷𝐾𝐷 𝜀𝑝 [1 − 2.10 ( 𝑠 ) + 2.09 ( 𝑠 ) − 0.95 ( 𝑠 ) ] /𝜏
𝑅𝑝 𝑅𝑝 𝑅𝑝
(1)
Pada persamaan 1 diatas, 𝐷𝑒𝑓𝑓 adalah
koefisien difusifitas efektif suatu zat terlarut
dalam material berpori, D adalah koefisien
difuivitas pada larutan biasa, KD koefisien
distribusi untuk zat terlarut, 𝜀𝑝 adalah
porositas partikel, RS adalah jari-jari zat
 Natasha Agustin Ikhsan, Kromatografi Afinitas, 2015, 1-13 4

terlarut, RP adalah jari-jari pori, τ adalah
tortuosity factor.Ukuran diameter pori paling
tidak lima kali diameter zat terlarut untuk
mencegah penyumpatan [10]. Sebagai contoh,
ukuran pori pada matriks silika adalah 40 –
4000 Å dan pada matriks polimetakrilat adalah
100, 200, 500, atau 1000 Å [10].
mengurangi efek perpindahan massa yang
terjadi pada matriks [9]. Namun, matriks
dengan diameter yang kecil memiliki
kemungkinan terbentuknya fouling pada
kolom yang lebih besar. Pada tabel 1
ditampilkan jenis-jenis matriks yang umum
digunakan.

Memiliki diameter partikel matriks yang 4. Pemilihan Ligan

sesuai
Afinitas antara ligan dan komponen target
Secara teori, diameter partikel matriks adalah hal yang paling utama untuk
yang kecil selalu lebih disukai. Hal ini dipertimbangkan. Umumnya konstanta afinitas
disebabkan semakin kecilnya waktu difusi zat (konstanta asosiasi) sebesar 106-108 M-1 sudah
terlarut untuk dapat bertemu dengan ligan dapat digunakan untuk permurnian.
yang tertambat pada pori matriks dan untuk

Tabel 1. Contoh Matriks Tradisional [10]

Nama Dagang Material Diameter Partikel Contoh Ligan

Rata-rata (µm)
Sepharose HP Agarose 34 Protein A, heparin, Cibacron Blue
Sepharose FF Agarose 90 Protein A, heparin, Cibacron Blue
Mimetic series Agarose 105 Synthetic ligands
TSK-Gel Polymethacrilate 10 Boronate, IMACa, heparin
Fractogel Polymethacrilate 30, 65 IMACa, heparin
Cellufine Cellulose 85, 90, 170 Heparin, IMACa, gelatin
a
IMAC, immobilized metal-ion affinity chromatography

Ligan dapat dikelompokkan menjadi ligan menunjukkan perbandingan ligan sintetik dan
sintetik dan ligan biologis [11]. Ligan biologis ligan biologis.
memiliki kelebihan pada spesifitas dan
afinitasnya terhadap komponen target yang Tabel 2. Perbandingan ligan sintetik dan
tinggi. Namun, ligan biologis memiliki biologis [11]
kekurangan pada ketidakstabilannya saat
proses sterilisasi. Hal ini menyebabkan usia Sifat Jenis Ligan
ligan menjadi lebih singkat. Selain itu, potensi Sintetik Biologis
adanya kontaminasi dari sumber biologis lebih Selektivitas Sedang- Sangat tinggi
besar sehingga meningkatkan penanganan tinggi
pada tahap akhir proses poduksi yang Stabilitas Tinggi Rendah-
menyebabkan bertambah mahalnya produk sedang
hasil permurnian. Contoh dari ligan biologis Kapasitas Tinggi Rendah-
adalah peptida, protein, oligosakarida, protein, sedang
dan (oligo)-nukleotida [11]. Ligan sintetik Harga Rendah- Medium-
dapat menjadi solusi bagi semua kekurangan medium tinggi
ligan biologis kecuali afinitas dan Toksisitas Sedang rendah
spesifitasnya. Tabel 2
Ligan juga dapat dikelompokkan berdasarkan
jenis molekulnya, antara lain ligan berbasikan
 Natasha Agustin Ikhsan, Kromatografi Afinitas, 2015, 1-13 5

struktur nukleotida. Ligan yang berbasikan Tabel 4. Jenis ligan group-specific gels dan
nukleotida dapat berupa deoxyribonucleotide spesifitasnya [8]
acid (DNA) yang banyak digunakan untuk
menangkap komponen target berupa enzim Ligan Spesifitas
atau DNA-binding proteins. Selain itu, adapula NAD, NADP Dehidrogenase
ligan yang berupa oligonukleotida dan Lektin Polisakarida
koenzim nukeotida yang digunakan untuk Poliurasil Poliadenin (Poli(A))
komponen target berupa nucleotide- (Poli(U))
recognizing enzymes seperti dehridrogenase, Histon DNA
kinase, sintetase, dan lain-lain. Ligan Protein A Fc Antibodi
berbasikan struktur peptida. Ligan peptida Protein G Antibodi
dapat berupa peptida linear maupun Lisin rRNA, dsDNA,
mikroprotein. Selain itu, adapula Ligan yang plasminogen
berbasikan pewarna tekstil (dye-ligand). Arginin Fibronektin, protombin
Heparin Lipoprotein, DNA, RNA
Terdapat dua jenis ligan bergantung pada Blue F3G-A NAD+
interaksinya dengan komponen target. Ligan Red HE-3B NADP+
yang berinteraksi dengan komponen target Orange A Laktat dehidrogenase
berdasarkan konformasi atau bentuk dari suatu Benzamidine Serin protease
gugus spesifik disebut sebagai group-specific Green A Protein CoA, HAS,
gels sedangkan ligan yang berinteraksi dehidrogenase
menggunakan ikatan kovalen dengan Gelatin Fibronektin
komponen target disebut sebagai covalent Polimiksin Endotoksin
coupling gels. Pada tabel 4, terdapat contoh 2’,5’-ADP NADP+
ligan yang merupakan kelompok group- Calmodulin Kinase
specific gels dan pada tabel 3, terdapat contoh Boronate cis-Diols, tRNA,
ligan yang merupakan kelompok covalent plasminogen
coupling gels. Blue B Kinase, dehidrogenase,
protein pengikat asam
Tabel 3. Jenis ligan covalent coupling [8] nukleat
Ikatan Grup ligan Spesifitas
CNBr NH2 Protein, 5. Penyematan ligan pada matriks
peptide
Thiolpropil SH Sulfihidril Terdapat tiga komponen yang harus disatukan
Thiol SH Sulfihidril untuk membentuk fasa stasioner pada kolom
Epoksi NH2 Protein, kromatografi afinitas, yaitu permukaan atau
OH peptida resin (matriks), pengikat (spacer), dan ligan.
SH Salah satu faktor yang memengaruhi
Tresil NH2 Karbohidrat pengikatan ligan pada matriks adalah
Aminoheksil COOH Sulfihidril keberadaan gugus fungsional pada ligan.
Karboksilheksil NH2 Protein, asam Gugus fungsi yang umum terdapat pada ligan
amino pada adalah gugus amin primer, karboksil, dan
peptida, thiol. Selain itu, ligan juga dapat dimodifikasi
asam untuk mendapatkan gugus yang reaktif pada
karboksilat ligan. Modifikasi tersebut dapat berupa
pada protein oksidasi karbohidrat atau penyematan secara
kovalen gugus reaktif ortogonal.

Afinitas dari ligan dapat dipengaruhi oleh tiga

hal, yaitu multi-site attachment, streric
hindrance, dan orientasi dari ligan. Multisite
 Natasha Agustin Ikhsan, Kromatografi Afinitas, 2015, 1-13 6

attachment terjadi saat satu molekul ligan tidak terhalangi untuk berinteraksi dengan
berikatan dengan matriks melalui lebih dari komponen target. Gambar 5 menunjukkan
satu gugus fungsi (lebih dari satu ikatan). pengaruh steric hindrance pada ligan.
Seringkali ikatan yang lebih dari satu ini
menghasilkan tambatan ligan pada matriks
yang lebih kuat dan stabil. Namun, ikatan yang
banyak ini juga berpotensi menimbulkan
deteriorasi atau denaturasi pada ligan yang
berujung pada rendahnya afinitas ligan [9].
Salah satu cara untuk mengurangi
kemungkinan terjadinya multi-site attchment
adalah dengan menggunakan matriks yang
memiliki reactive site terbatas. Gambar 3
menunjukkan peristiwa multi-site attchment. Steric hindrance Spacer arm digunakan
(binding site terhalangi) (lebih banyak sites yang tersedia)
(binding site terhalangi)
Binding
sites Gambar 5. Perbandingan ligan dengan dan
tanpa spacer arm

Panjang dari spacer arm haruslah diatur

Multi-site attachment Single-site attachment
Gambar 3. Perbandingan multi-site
attachment dan single-site attachment
Orientasi ligan juga menjadi hal yang penting
saat disematkan pada matriks. Jika ligan
memiliki afinitas yang tidak sesuai, potensi
ligan untuk berinteraksi dengan komponen
target menjadi semakin berkurang. Gambar 4
meneunjukakan persitiwa tdak tepatnya
orientasi penyematan ligan pada matriks.
sedemikian rupa agar tidak memberikan steric
hindrance yang baru terhadap ligan.
Umumnya, spacer arm yang digunakan
memiliki panjang kurang dari 1000 Da [9].
Fungsi dari spacer arm ditunjukkan pada
gambar 6. Pada tabel 5 disajikan dasar
pemilihan panjang spacer arm secara
kualitatif.
Ligan

Spacer arm
Target
Matriks
a) b)
) 0
Orientasi yang tidak tepat Orientasi tepat (binding
(binding site terhalangi) site tidak terhalangi) Gambar 6. Perbandingan sistem kromatografi
afinitas a) tanpa spacer arm dan b) dengan
Gambar 4. Perbandingan ligan dengan spacer arm
orientasi yang tepat dan tidak

Selain afinitas yang rendah, ikatan interaksi

antara ligan dan komponen target dapat
terhalangi oleh steric hindrance yang
disebabkan oleh matriks atau ligan lainnya.
Oleh karena itu, dalam penyematan ligan pada
matriks seringkali digunakan spacer arm yang
menjaga agar situs aktif (active site) dari ligan
 Natasha Agustin Ikhsan, Kromatografi Afinitas, 2015, 1-13
Tabel 5. Pemilihan panjang spacer arm [8]
Ligan Komponen Panjang
Target Spacer Arm
Kecil Kecil Pendek
Kecil Besar Panjang
Besar Kecil - komponen target oleh ligan yang kemudian di
Besar Besar - ikuti dengan pencucian untuk memisahkan
Terdapat beberapa teknik untuk menyematkan
ligan pada matriks, antara lain dengan ikatan
kovalen, adorpsi pada permukaan dengan
interakasi biospesifik dan nonspesifik,
diperangkap dalam pori (entrapment), dan
berkoordinasi dengan ion logam [9].
Imobilisasi menggunakan ikatan kovalen
merupakan teknik yang paling umum
digunakan [12]. Imobilisasi dengan ikatan
kovalen lebih selektif dibanding metode
imobilisasi lainnya. Namun, imobilisasi secara
kovalen membutuhkan tahapan dan reagen
kimia yang lebih banyak. Oleh karena itu,
biaya produksinya juga lebih besar. Namun,
karena ligan hasil imobilisasi secara kovalen
lebih tahan lama dibanding imobilisasi dengan
teknik lainnya, imobilisasi secara kovalen
lebih ekonomis untuk digunakan dalam waktu
yang lama [9].
Imobilisasi dengan adsorpsi nonspesifik
adalah dengan membuat ligan teradsorp pada
matriks melalui interaksi coulombic, ikatan
hidrogen, dan interaksi hidrofobik [9].
Imobilisasi dengan adsoprsi nonspesifik dapat
dilakukan dengan menggunakan amine-
reactive methods [9].
Teknik lain untuk mengimobilisasi ligan pada
matriks adalah dengan entrapment,yaitu
memerangkap ligan dengan capping agent.
Salah satu contoh metode ini adalah
entrapment albumin dari serum manusia
(Human Serum Albumin) menggunakan
matriks berupa hydrazide-activated supports
dan capping agent berupa glikogen teroksidasi
[13]. Pada imobilisasi dengan teknik ini, tidak
ada ikatan yang terbentuk antara ligan dan
matriks sehingga masalah yang dapat
ditimbulkan seperti pada gambar 5 tidak akan
terjadi [9].
7
6. Metode pemurnian menggunakan
kromatografi afinitas
Pemurnian dengan kromatografi afinitas
dimulai dengan penanganan sampel dan
matriks. Selanjutnya adalah penangkapan
komponen lain. Tahap berikutnya dilakukan
elusi untuk melepaskan ikatan antara ligan
dengan komponen target. Berikut adalah
pembahasan dari masing-masing tahap.
Penyiapan sampel
Pada penyiapan sampel, sampel diusahakan
tetap berada pada konformasi yang
memungkinkan untuk terjadinya interaksi
antara sampel target dengan ligan. Selain itu,
sampel juga dikurangi viskositasnya agar
dapat mengurangi turun tekan, meningkatkan
laju alir, dan mencegah tertinggalnya sampel
pada kolom.
Beberapa protein juga dapat mengalami
agregasi atau saling berkumpul sehingga dapat
memperlambat laju difusi dan dapat
mengurangi probabilitas untuk ditangkap oleh
ligan. Oleh karena itu, terkadang sampel harus
diencerkan terlebih dahulu.
Pengikatan dan pencucian
Efisiensi pengikatan ligan dengan komponen
target bergantung pada kinetika pengikatan
yang sangat ditentukan oleh berbagai faktor
seperti afinitas dari komponen itu sendiri dan
konsentrasi dari ligan komponen target. Proses
pemisahan menggunakan kromatografi afinitas
dapat dirumuskan pada persamaan dibawah
ini.
ka
𝐿 + 𝑇 . ⇌ 𝐿𝑇 (2)
2
kd
Ka adalah
2 konstanta kesetimbangan asosiasi,
ka adalah konstanta laju reaksi asosiasi, dan kd
adalah konstanta laju reaksi disosiasi. Ka =
ka/kd.
 Natasha Agustin Ikhsan, Kromatografi Afinitas, 2015, 1-13
Ka = [LT]/[L].[T] dengan [LT] adalah
kosentrasi produk interakasi antara ligan dan
komponen target, [L] adalah konsentrasi ligan
dan [T] adalah konsentrasi komponen target.
Setalah pengikatan (binding) terjadi,
pencucian komponen lain yang bukan target
dilakukan dengan menambahkan reagen
sebagai wash buffer.
Elusi
Elusi adalah proses yang berkebalikan dengan
proses binding. Pada proses ini, nilai Ka dibuat
menjadi sekecil mungkin agar reaksi disosiasi
terjadi. Terdapat dua metode elusi, yaitu elusi
spesifik dan elusi nonspesifik. Pada elusi
spesifik, reagen baru ditambahkan untuk
berkompetisi dengan salah satu antara ligan
dan komponen target sehingga kompleks
antara ligan dan komponen target dapat
terlepas. Pada jenis elusi ini, jumlah dan
afinitas dari reagen ‘pengganggu’ sangat
penting.
Elusi jenis lain, yaitu elusi nonspesifik
menggunakan manipulasi pada kondisi solven
agar nilai Ka bernilai sangat kecil bahkan
sampai mencapai nol. Kondisi elusi dapat
dioptimasi sesuai dengan mekanisme interaksi
antara ligan dan komponen target seperti
meningkatkan konsentrasi garam untuk
menurunkan interaksi ionik atau dengan
mengubah pH untu mengubah keadaan
ionisasi/protonisasi. Salah satu contoh elusi
dengan mengubah pH adalah elusi antibodi
dari protein A atau protein G.
7. Berbagai variasi kromatografi afinitas
Immobilized metal ion affinity
chromatography (IMAC)
IMAC merupakan jenis kromatografi afinitas
yang banyak digunakan dalam pemurnian
protein. IMAC berbeda dengan kromatografi
afinitas yang lain karena IMAC menggunakan
sebuah penanda atau ‘tag’ pada protein. IMAC
banyak digunkan untuk memurnikan
komponen dalam suatu campuran yang sangat
kompleks seperti memurnikan protein dalam
serum. IMAC memanfaatkan interaksi antara
asam amino dari protein target dengan ion
8
logam yang terkelat (chelated metal ion) pada
kolom [14]. IMAC dapat mengikat protein
dengan konstanta disosiasi mencapai 10-5-10-7.
[15].
Prinsip dasar yang masih digunakan hingga
saat ini adalah menngunakan ion logam yang
terimobilisasi seperti Cu2+, Ni2+, dan Zn2+
untuk memurnikan protein dengan basis
kandungan asam asmino histidin pada protein
tersebut. Ion logam tersebut membentuk
kompleks dengan agen pengkelat (chelating
agent) yang disebut immobilized metal chelat
complex (IMCC).
Sebagai contoh, interaksi antara histidin
dengan IMCC adalah transfer elektron. Karena
histidin memiliki pKa 6, histidin menjadi
mudah untuk melakukan transfer elektron saat
pH lebih besar dari 6,5. Jika histidin sudah
mendonorkan elektron pada IMCC, IMCC dan
histidin akan membentuk kompleks. Untuk
mengelusi histidin, dapat dilakukan dengan
menambahkan imidazol, yaitu gugus fungsi
pada histidin yang dapat bersaing dengan
histidin yang sedang membentuk kompleks
dengan IMCC. Cara lain adalah dengan
menurunkan pHmenjadi kurang dari 6,5 yang
mencegah histidin untuk mendonorkan
elektronnya sehingga kompleks IMCC dan
ligan dapat terlepas [15].
Bioaffinity chromatography
Bioaffinity chromatography adalah
keomatogrfafi afinitas yang menggunakan
ligan biologis atau sering dikenal sebagai
biospecific adsoption. Terdapat beberapa jenis
ligan biologis yang sering digunakna, yaitu
protein pengikat immunoglobulin, enzim,
lektin, karbohidrat, protein serum, dan sistem
avidin/biotin [16].
Immunoaffinity chromatography
Immunoaffinity chromatography adalah teknik
yang sangat ampuh untuk memurnikan protein
[15]. Kromatografi afinitas jenis ini
memurnikan protein khusunya antibodi
(immunoglobulin) menggunakan ligan-ligan
seperti protein A yang diproduksi oleh bakteri
Staphylococcus aureus dan protein G yang
diperoleh dari grup C dan G Streptococci [16].
 Natasha Agustin Ikhsan, Kromatografi Afinitas, 2015, 1-13
Namun, harga ligan-ligan untuk mengikat
immunogobulin ini terbilang mahal. [17].
Immobilized enzyme
Enzim yang terimobilisasi sering digunakan
untuk memurnikan enzim inhibitor atau
sebaliknya, enzim inhibitor sering digunakan
untuk memurnikan enzim. Masalah yang
menjadi penghalang bagi penggunaan
immbolized enzyme adalah harganya yang
cukup mahal [15].
Proses imobilisasi enzim dilakukan melalui
dua tahap, yaitu tahap pertama dengan aktivasi
media pendukung (support) dengan carrier.
Jenis support yang paling banyak digunakan
adalah selulosa dan polisakarida. Selanjutnya,
tahap kedua, yaitu enzim berikatan kovalen
dengan carrier. Umumnya, ikatan kovalen
terjadi pada gugus amin dari lisin atau arginin,
gugus karboksil dari asam aspartat atau asam
glutamat, gugus hidroksil pada serin atau
treonin, atau gugus imidazol pada histidin
[15].
Lektin
Lektin adalah protein yang bukan berasal dari
sistem imun tetapi memiliki kemampuan untuk
mengenali dan berikatan dengan residu
karbohidrat spesifik. Dua jenis lektin yang
paling umum digunakan pada kromatografi
afinitas adalah canavalin A dan wheat germ
agglutinin [15]. Pada tabel 6 disajikan jenis-
jenis lektin.
Tabel 6. Jenis-jenis lektin [14]
Residu Lektin
Karbohidrat
D-N-Asetil Soybean lectin
galaktosamin Lektin 60 dari Ricinus
communis
Fitohemagglutinin E4 dan L4
α-D-Galaktosa Jacalin
Peanut and soybean lectin
β-D-Galaktosa Lekton 60 dan 120 dari
Ricinus communis
α-D-Glukosa Pea and leentil lectin
Konkanavalin A
α-D-Manosa Pea lectin
Lentil lectin
Konkanavalin A
9
Karbohidrat
Ligan lain yang digunakan pada kromatografi
afinitas adalah karbohidrat. Salah satu
karbohidrat yang banyak digunakan adalah
siklodestrin. Keutaman penggunaan
siklodekstrin adalah kiralitas yang dimilikinya
sehingga dapat dimanfaatkan untuk mengikat
molekul kiral.
Ligan karbohidrat tidak hanya dapat menjerat
kabohidrat tetapi juga dapat menjerat protein.
Sebagai contoh, protein fikolin berhasil
diisolasi dari serum manusia dengan
mengunakan kolom sepharose yang
mengandung N-Asetil glukosamin [15].
Protein serum
Protein serum juga banyak digunakan sebagai
ligan pada kromatografi afinitas. Contoh
protein serum yang banyak digunakan adalah
Human Serum Albumin (HSA) atau Bovine
Serum Albumin. Aplikasi protein serum salah
satunya untuk meneliti interaksi protein
dengan zat padat [15].
Avidin dan Biotin
Avidin atau streptovidin dapat berikatan
nonkovalen secara kuat dengan biotin
sehingga avidin/biotin digunakan pada
kromatografi afinitas. Aplikasi dari
penggunaan avidin/biotin adalah biotin dapat
dijadikan penanda ata ‘tag’ pada target yang
diinginkan kemudan biotin ditangkap oleh
avidin.streptovidin yang terimobilisasi [15].
Reversed phase chromatography
Reversed phase ditujukan pada terbaliknya
sifat ligan dengan fasa bergerak pada
kromatografi afinitas. Alih-alih menggunakan
ligan yang hidrofilik dan polar serta fasa
bergerak yang hidrofobik dan nonpolar
layaknya kromatografi afinitas pada
umumnya, pada reversed phase ligan bersifat
hidrofobik nonpolar dan fasa bergerak bersifat
hidrofilik polar. Contoh ligan yang bersifat
nonpolar adalah oktadesil (C18).
8. Aplikasi industri kromatografi afinitas
 Natasha Agustin Ikhsan, Kromatografi Afinitas, 2015, 1-13 10

Aplikasi kromatografi afinitas di industri Kromatografi afinitas saat ini banyak

didominasi oleh purifikasi protein bernilai
tinggi khususnya untuk therapeutic protein
pada bidang farmasi [11].
Produksi protein plasma therapeutical protein,
pharmaceutical protein, dan enzim
digunakan untuk pemurnian protein plasma
yang digunakan untuk keperluan terapi seperti
Factor VIII, Factor IX, von Willebrand
Factor, Protein C, Antithrombin III, dan
Factor XI. Tabel 7 menunjukkan produk
protein plasma yang sudah berlisensi [18].

Tabel 7. Protein plasma berlisensi yang diproduksi dengan kromatografi afinitas [18]

Protein Plasma Metode Fraksionasi Proses Kromatografi yang umum di industri

Tradisional
Factor VIII Cryo-precipitation Anion-exchange chromatography [19]
+ Precipitation C + ion exchange chromatography [20]
Factor IX DEAE adsoption of Anion exchange + immobilized heparin affinity
cryo-poor plasma chromatography
Anion-exchange chromatography + immunoaffinity
Anion-exchange + Cu Metal-chelat affinity chromatography
Von Willebrand Cryo-precipitation Anion exchange + immobilized gelatin affinity [21]
Factor + Precipitation chromatography
NAa
Factor XI NAa Anion exchange + immobilized heparin affinity
chromatography
Fibronectin NAa Anion-exchange + cation-exchange chromatography
Antithrombin III NAa immobilized heparin affinity chromatography
Alpha-1-antitrypsin NAa Anion-exchange chromatography
Anion-exchange+size exclusion chromatography
Protein C NAa Anion exchange + immobilized heparin affinity
chromatography
Albumin Ethanol Anion-exchange+ immunoaffinity chromatography
Fractination
Immunoglobulin G Ethanol Ethanol fractionationqion-exchange
Fractination Chromatography [22]
Anion-exchangeqimmobilized arginin
affinity chromatography

Protein plasma yang banyak dihasilkan di
indistri adalah protein yang berperan sebagai
faktor koagulasi, yaitu Factor VIII, Factor IX,
von Willebrand Factor, Fibronectin, Factor
XI; inhibitor protease, yaitu Antithrombin III,
Alpha-1-antitrypsin, Inter-alpha-trypsin
inhibitor; anti-koagulan, yaitu Protein C ;
albumin; dan immunoglobulin [18].
Selain itu, kromatografi afinitas yang
menggunakan dye sebagai ligan juga banyak
digunakan dalam jumlah besar untuk
menghasilkan pharmaceutical protein dan
enzim. Berikut adalah tabel 8 yang
menampilkan jenis-jenis protein dan enzim
yang dimurnikan menggunakan dye-ligand
affinity chromatography.
 Natasha Agustin Ikhsan, Kromatografi Afinitas, 2015, 1-13 11

Tabel 8. Protein dan enzim yang diproduksi menggunakan dye-ligand affinity

chromatography [2]

Protein/enzim Sumber Ligan

Format dehidrogenase C. boidinii Procion Red HE3b

Endotoksin A, B, C2 Staphylococcus Red A

α-antitripsin [23] Serum manusia Cibacron Blue F3G-A

Karboksipeptidase G2 Pseudomonas spp. Procion Red H-8BN

Glukokinase B. stearothermophilus Procion Brown H-3R

Interferon Firoblas manusia Cibacron Blue F3G-A

Fosfotransferase
Hati sapi Cibacron Blue F3G-A
ATP:AMP

Pemurnian Plasmid DNA untuk terapi gen dan
vaksin DNA
Saat ini mulai berkembang adanya terapi gen,
yakni memasukkan asam nukleat ke dalam sel
manusia dengan tujuan memperbaiki keadaan
genetik seseorang. Asam nukleat yang
dimasukkan dapat berupa DNA rantai tunggal
dan ganda atau RNA. Asam nukleat tersebut
dibawa ke dalam sel manusia menggunakan
vektor berupa plasmid DNA. Plasmid DNA
diperoduksi oleh bakteri rekombinan yang
kemudian di murnikan menggunakan
kromatografi afinitas jenis reversed phase
[24].
9. Kesimpulan
Kromatografi afinitas merupakan teknik
pemurnian yang saat ini sedang berkembang
pesat karena kelebihannya dalam memurnikan
komponen dengan spesifitas dan kemurnian
yang tinggi. Kromatografi afinitas
menggunakan prinsip biologis antara dua
molekul yang dapat mengenali bentuk atau
konformasi untuk dapat berinteraksi secara
spesifik layaknya enzim dan substrat atau
antara antigen dan antibodi. Terdapat berbagai
jenis kromatografi afinitas bergantung pada
ligan yang digunakan. Sampai saat ini,
penggunaan kromatografi afinitas di industri
masih didominasi untuk menghasilkan protein
atau molekul murni lain yang bernilai tinggi.
Adapun penggunaan kromatografi afinitas
selain itu masih sebatas untuk analisis skala
laboratorium.
Daftar Pustaka
[1] P. S. Ruhn, Handbook of Affinity
Chromatography, 2nd penyunt., S. D.
Hage, Penyunt., Northwest: Taylor &
Francis Group, 2006.
[2] N. E. Labrou, "Design and selection of
ligands for affinity chromatography,"
Journal of Chromatography B, pp. 67-78,
2003.
[3] N. E. Labrou, "Design and selection of
ligands for affinity chromatography,"
Journal of Chromatography B, p. 2, 2003.
[4] L. S. Ettre, "Nomenclature for
Chromatography," Pure and Applied
Chemistry, pp. 818-872, 1993.
[5] M. Wilchek and M, "Thirty years of
affinity chromatography," Reactive &
Functional Porperty, pp. 263-268, 1999.
[6] A. C. A. Roque and C. R. Lowe, "Affinity
Chromatography," in Affinity
Chromatography, Methods and
Protocols, New Jersey, Humana Press,
2008, p. 13.
[7] J. Janson, "Large-scale affinity
 Natasha Agustin Ikhsan, Kromatografi Afinitas, 2015, 1-13 12

purification - State of the Art and Future
Aspects," Trends in Biotechnology, vol. 2,
pp. 31-38, 1984.
[8] S. Ostrove, "Affinity Chromatography:
General Methods," vol. 182, 1990.
[9] S. Magdeldin and A. Moser, Affinity
Chromatography: Pronciples and
Applications, China: InTech, 2012.
[10] P. Gustavsson and P. Larsson, "Support
Material for Affinity Chromatography,"
in Handbook of Affinity Chromatography,
Northwest, Taylor & Francis, LLC, 2006,
p. 15.
[11] Y. D. Clonis, "Affinity chromatography
matures as bioinformatic and
combinatorial tools develop," Journal of
Chromatography A, pp. 1-24, 2006.
[12] H. S. Kim and D. S. Hage,
"Immobilization Methods for Affinity
Chromatography," in handbook of
Chromatography, Nortwest, Taylor &
Francis Group, LLC, 2006, pp. 35-78.
[13] A. B. Jackson, H. Xuan and D. S. Hage,
"Entrapment Of Proteins In Glycogen-
Capped And Hydrazide-Activated
Supports," Anal Biochem., pp. 1-6, 2012.
[14] M. C. Smith, T. C. Furman, T. D. Ingolia
and C. Pigdeon, "Chelating Peptide-
immobilized Metal Ion Affinity
Chromatography," The Journal of
Biological Chemistry, p. 1, 1987.
[15] A. Charlton and M. Zachariou,
"Immobilized Metal Ion Affinity
Chromatography of Native Proteins," in
Affinity Chromatography, New Jersey,
Humana Press, 2008, pp. 35-37.
[16] D. S. Hage, M. Bian, R. Burks, E. Karle,
C. Ochnmact and C. Wa, "Bioaffinity
Chromatography," in Handbook of
Affinity Chromatography, Northwest,
Taylor & Francis Group, 2006, pp. 102-
104.
[17] Z. Wang, Q. Liang, .. Wen, S. Zang and J.
Shen, "Antibody Purification using
Affinity Chromatography: A Case Study
with Monoclonal Antibody to
Ractopamine," Journal of
Chromatography B, p. 1, 2015.
[18] T. Burnouf and M. Radosevich, "Affinity
chromatography in the industrial
purification of plasma proteins for
therapeutic use," Journal of Biochemical
and Biophysical Methods, pp. 575-586,
2001.
[19] T. Burnouf, M. Burnouf-Radosevich, M.
Goudemand and J. J. Huart, "A Highly
Purified Factor VIII:c concentrate
prepared from cryoprecipitate by ion-
exchange chromatography," Vox Sang,
pp. 8-15, 1991.
[20] J. C. Goldsmith, "Pasteurized,
monoclonal antibody factor VIII
concentrate: establishing a new standard
for purity and viral safety of plasma-
derived concentrates," Blood Coagulation
& Fibrinolysis, pp. 203-215, 2000.
[21] T. Burnouf and M. Burnouch-
Radosevich, "Chromatographic
preparation of a therapeutic highly
purified von Willebrand factor
concentrate from human cryoprecipitate,"
Vox Sang, pp. 1-11, 1992.
[22] L. Hofbauer, L. Bruckschwaiger, H. A.
Butterweck and W. Teschner, Affinity
Chromatography for Purification of IgG
from Human Plasma, Shanghai: InTech,
2012.
[23] P. Cuatrecasas, M. Wilchek and C. B.
Anfinsen, "Selective Enzyme Purification
By Affinity Chromatography,"
Biochemsitry, pp. 1-8, 1968.
[24] G. N. M. Ferreira, G. A. Monteiro, D. M.
F. Prazeres and J. M. S. Cabral,
"Downstream processing of plasmid
DNA for gene therapy and DNA vaccine
 Natasha Agustin Ikhsan, Kromatografi Afinitas, 2015, 1-13 13

applications," TIBTECH, pp. 380-387,

2000.