Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak sepanjang
fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik
(ascending), atau karena pengaruh graitasi pada pengembangan secara menurun
(descending). KLT dalam pelaksanaannya lebih mudah dan lebih murah
dibandingkan dengan kromatografi kolom. Demikian juga peralatan yang digunakan.
Dalam KLT, peralatan yang digunakan lebih sederhana dan dapat dikatakan bahwa
hampir semua laboratorium dapat melaksanakan setiap saat secara cepat.
Beberapa keuntungan KLT adalah: (1) KLT banyak digunakan untuk tujuan analisis;
(2) identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna,
fluoresensi, atau dengan radiasi menggunakan sinar ultra violet;(3) dapat dilakukan
elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau dengan cara elusi 2
dimensi; dan (4) ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang
akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.
Gambaran utama yang mengatur kemampuan daya pisah lempeng KLT adalah
ukuran bercak (spot) dan dimensi fisik lempeng, dengan diameter sebesar 0,5 cm
dan panjang lempeng pada umumnya 10 cm. Dengan ukuran seperti ini, lempeng
hanya mampu memisahkan 20 analit secara optimal supaya terpisah secara
sempurna. Meskipun demikian, dengan penghantaran kapiler normal eluat, maka
lempeng teoretis maksimum adalah < 5.000. Kecepatan fase gerak bervariasi di
sepanjang lempeng KLT. Semakin jauh fase gerak melewati lempeng maka
kecepatannya akan menurun.
K = Cs/Cm
Nilai Rf ini terkait dengan faktor perlambatan. Nilai Rf bukanlah suatu nilai fisika
absolut untuk suatu komponen; meskipun demikian, dengan pengendalian kondisi
KLT secara hati-hati, nilai Rf dapat digunakan sebagai cara untuk identifikasi
kualitatif. Disebabkan oleh banyaknya variabel yang berpengaruh pada nilai Rf -
misalnya adanya sedikit perbedaan komposisi fase gerak, suhu, ukuran chamber,
lapusan penjerap, dan sifat campuran- maka penentuan nilai Rf dalam suatu sistem
KLT yang berbeda merupakan cara yang harus dilakukan ketika melakukan
identifikasi untuk membuktikan adanya suatu komponen/analit yang dituju dalam
sampel.
Sifat-sifat umum penjerap pada KLT harus serupa dengan sifat-sifat pada penjerap
dalam kromatografi kolom (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dan Kromatografi Gas).
Dua sifat penjerap yang penting adalah ukuran partikel dan fase diam yang
digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan diameer partikel
antara 10=30 μm. Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase diam dan semakin
sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja KLT dalam hal
efisiensinya dan resolusinya.
Penjerap yang paling sering digunakan adalah silika dan serbuuk selulosa,
sementara mekanisme sorpsi-desorpsi (perpindahan analit dan fase diam ke fase
gerak dan sebaliknya) yang utama pada KLT adala partisi dan adsorpsi. Lapisan
tipis yang digunakan sebagai penjerap juga dapat dibuat dari silika yang telah
dimodifikasi, resin penukar ion, gel eksklusi, dan siklodekstrin yang digunakan untuk
pemisahan kkiral Beberapa penjerap KLT serupa dengan penjerap yang digunakan
pada KCKT. Kebanyakan penjerap dikontrol keajegan ukuran partikel dan luas
permukaan. Berikut merupakan ringkasan beberapa penjerap (fase diam) yang
sering digunakan dalam kromatografi lapis tipis beserta mekanisme pemisahannya,
serta penggunaannya untuk analisis:
Silika Gel
Mekanisme sorpsi: Adsorpsi
Penggunaan: Asam amino, hidrokarbon, vitamin, alkaloid.
Silika yang dimodifikasi dengan hidrokarbon
Mekanisme sorpsi: Partisi termodifikasi
Penggunaan: Senyawa-senyawa non-polar.
Serbuk selulosa
Mekanisme sorpsi: Partisi
Penggunaan: Asam amino, nukleotida, karbohidrat.
Alumina
Mekanisme sorpsi: Adsorpsi
Penggunaan: Hidrokarbon, ion logam, pewarna makanan, alkaloid.
Kieselguhr (tanah Diatomae)
Mekanisme sorpsi: Partisi
Penggunaan: Gula, asam-asam lemak.
Selulosa penukar ion
Mekanisme sorpsi: pertukaran ion
Penggunaan: Asam nukleat, nukleotida, halida dan ion-ion logam.
Gel sephadex
Mekanisme sorpsi: eksklusi
Penggunaan: Polimer, protein, kompleks logam.
β-siklodekstrin
Mekanisme sorpsi: Interaksi adsorpsi stereospesifik
Penggunaan: Campuran enantiomer.
pemisahan pada KLT dikendalikan oleh rasio distribusi komponen dalam sistem fase
diam/penjerap dan eluen tertentu. Profil pemisahan pada KLT dapat dimodifikasi
dengan mengubah komposisi fase gerak dengan memperhatikan polaritas dan
kekuatan elusinya.
Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan
mencoba-coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling
sederhana ialah campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua
pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi
secara optimal. Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi
fase gerak:
Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT
merupakan teknik yang sensitif.
Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf
terletak antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.
Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel,
polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti
juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar
seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzen akan
meningkatkan harga Rf secara signifikan.
Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan campuran pelarut
sebagai fase geraknya seperti campuran air dan menatol dengan
perbandingan tertentu. Penambahan sedikit asam etanoat atau amonia
masing-masing akan meningkatkan solut-solut yang bersifat basa dan asam.
Pelarut/fase gerak yang digunakan harus cukup murah, karena biasanya sejumlah
besar fase gerak digunakan untuk elusi. Pelarut yang digunakan pada fase gerak
KLT harus berupa pelarut dengan kemurnian yang tinggi.
Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan diperoleh hanya jika
menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin.
Sebagaimana dalam prosedur kromatografi yang lain, jika sampel yang digunakan
terlalu banyak maka akan menurunkan resolusi. Hasil penelitian menunjukkan
bahwa penotolan sampel secara otomatis lebih dipilih daripada penotolan secara
manual terutama jika sampel yang akan ditotolkan lebih dari 15 μl. Penotolan sampel
yang tidak tepat akan menyebabkan bercak yang menyebar dan puncak ganda.
Berdasarkan pada tujuan analisis, berbagai macam jumlah sampel telah disarankan
untuk digunakan. Metode penotolan sampel secara otomatis diperlukan untuk
menghasilkan reprosudibilitas yang baik, yang tentunya diperlukan untuk analisis
kuantitatif.
Untuk memperoleh reprodusibilitas, volume sampel yang ditotolkan paling sedikit 0,5
μl. Jika volume sampel yang akan ditotolkan lebih besar dari 2-10 μl maka penotolan
harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar totolan. Jarak
antar pusat penotolan bercak sebaiknya lebih dari 1 cm, bercak sebaiknya
berdiameter antara 2-5 mm dan tidak terlalu dekat dengan ujung lempeng
(sebaiknya jaraknya 1,5 cm dari ujung pada lempeng 20 × 20 cm).
Pengembangan KLT
Bejana kromatografi harus tertutup rapat dan sedapat mungkin volume fase gerak
sedikit mungkin (akan tetapi harus mampu mengelusi lempeng sampai ketinggian
lempeng yang telah ditentukan). Untuk melakukan penjenuhan fase gerak, biasanya
bejana dilapisi dengan kertas saring. Jika fase gerak telah mencapai ujung atas
kertas saring, maka dapat dikatakan bahwa fase gerak telah jenuh. Selama proses
elusi, bejana kromatografi harus ditutup rapat, misalkan dengan lembar aluminium
dan sebagainya.
Deteksi Bercak
Keunggulan KLT-KT lainnya adalah bahwa sampel yang digunakan hanya sedikit
sehingga bercak penotolannya berdiameter antara 0,1-0,5 mm. Lempeng dengan 10
× 10 cm sudah cukup untuk analisis, karenanya pada KLT-KT ini juga lebih
menghemat fase gerak dibanding dengan KLT-konvensional. Penyaiapn sampel
pada KLT-KT serta pemilihan fase geraknya dapat dikatakan tidak ada perbedaan
dengan KLT, hanya saja konsentrasi sampel pada KLT-KT ini lebih kecil dibanding
dengan KLT biasa. Pada KLT-KT, resolusi sudah akan nampak nyata pada jarak
pengembangan sampel antara 3-6 cm.
Penggunaan KLT
KLT, dan termasuk juga HPTLC, digunakan secara luas untuk analisis solut-solut
organik terutama dalam bidang biokimia, farmasi, klinis, forensik, baik untuk analisis
kualitatif dengan cara membandingkan nilai Rf solut dengan Rf senyawa baku atau
untuk analisis kualitatif. Penggunaan umum KLT adalah untuk: menentukan
banyaknya komponen dalam campuran, identifikasi senyawa, memantau
berjalannya suatu reaksi, menentukan efektifitas pemurnian, menentukan kondisi
yang sesuai untuk kromatografi kolom, serta untuk memantau kromatografi kolom,
dan melakukan screening sampel untuk obat dan klinis.