Makalah TLC kimia analisis farmasi

BAB I
PENDAHULUAN
A. Pendahuluan
Pada perkembangan metode Kromatografi saat ini pemakaian "Thin Layer Chromato
Scanner" yang lebih dikenal dengan nama densitometer makin banyak dipakai secara luas
oleh peneliti/ilmuwan.
Densitometri adalah metode analisi instrumental yang berdasarkan interaksi radiasi
elektromagnetik dengan analit yang merupakan bercak atau noda pada lempeng
KLT.Interaksi radiasi elektromagnetik dengan noda pada lempeng KLT yang ditentukan
adalah adsorpsi, transmisi, pantulan (refleksi) pendar fluor atau pemadaman pendar fluor dari
radiasi semula. Keunggulannya adalah dititikberatkan untuk analisis analit-analit dengan
kadar sangat kecil yang perlu dilakukan pemisahan terlebih dahulu dengan KLT. Metode ini
yang banyak digunakan dalam analisis kualitatif maupun kuantitatif di bidang farmasi
terutama di bidang analisis obat bahan alam.

B. Rumusan masalah
1. Bagaimana cara identifikasi kompenen kimia suatu senyawa dengan Metode KLT?
2. Bagaimana cara identifikasi kompenen kimia suatu senyawa dengan Metode instrument
densitometri?
C. Maksud dan Tujuan
1. Mengetahui dan memahami cara identifikasi kompenen kimia suatu senyawa dengan Metode
KLT
2. Mengetahui dan memahami cara identifikasi kompenen kimia suatu senyawa dengan Metode
instrument densitometri

BAB II
PEMBAHASAN
A. Pengertian Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi Lapis Tips (KLT) merupakan metode pemisahan komponen-komponen
atas dasar perbedaan adsorpsiatau partisi oleh fase diam di bawah ngerakan pelarut
pengembang/pengembang campur.
Kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan oleh Izmailoff dan
Schraiber pada tahun 1938. KLT merupakan bentuk kromatografi planar, selain
kromatografi kertas dan elektroforesis.
Berbeda dengan kromatografi kolom yang mana fase diamnya diisikan atau dikemas di
dalamnya, pada kromatografi lapis tipis, fase diamnya berupa lapisan yang seragam
(uniform) pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat
aluminium atau pelat plastik.
Meskipun demikian, kromatografi planar ini dapat dikatakan sebagai bentuk terbuka
dari kromatografi kolom.
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa
menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya yang
menggunakan. Kromatografi juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan
sangat sedikit, baik penyerap maupun cuplikannya.
 KLT dapat dipakai dengan dua tujuan.Pertama, dipakai selayaknya sebagai metode
untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif, atau preparatif. Kedua, dipakai untuk menjajaki
system pelarut dan system penyangga yang akan dipakai dalam kromatografi kolom atau
kromatografi cair kinerja tinggi.
KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa yang
sifatnya hidrofobik seperti lipida -lipida dan hidrokarbon yang sukar
dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna untuk mencari eluen
untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom,
identifikasi senyawasecara kromatografi, dan isolasi
senyawa murni skala kecil. Pelarut yang dipilih untuk pengembang disesuaikan
dengan sifat kelarutan senyawa yang dianalisis.Bahan lapisan tipis seperti silika gel adalah
senyawa yang tidak bereaksi dengan pereaksi – pereaksi yang lebih reaktif seperti asam
sulfat. Data yang diperoleh dari KLT adalah nilai Rf yang berguna untuk identifikasi
senyawa. Nilai Rf untuk senyawa murni dapat dibandingkan dengan nilai Rf dari senyawa
standar. Nilai Rf dapat didefinisikan sebagai jarak yang ditempuh oleh senyawa dari titik asal
dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut dari titik asal. Oleh karena itu bilangan Rf
selalu lebih kecil dari 1,0
Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak sepanjang fase
diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending) atau karena
pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun (descending). Komponen-
komponen yang berbeda bergerak pada laju pergerakan yang berbeda. Kromatografi
kebanyakan digunakan sebagai alat analisa kuantitatif tetapi dapat juga dipakai secara
kualitatif (pembandingan terhadap senyawa-senyawa referensi.
Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan beberapa sifat fisika umum dari
molekul, yaitu sebagai berikut.
1. Kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan).
2. Kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan halus (adsorpsi/penyerapan).
3. Kecenderungan molekul untuk menguap atau berubah ke keadaan uap.
Kromatografi Lapisan Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa
menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya. Bahan lapisan tipis seperti silika
gel adalah senyawa yang tidak bereaksi dengan pereaksi-pereaksi seperti asam sulfat.
Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaannya lebih mudah dan lebih murah
dibandingkan dengan kromatografi kolom.Demikian juga peralatan yang digunakan.Dalam
kromatografi lapis tipis, peralatan yang digunakan lebih sederhana dan dapat dikatakan
hampir semua laboratorium dapat melaksanakan setiap saat secara cepat.(1)
Beberapa keuntungan dari kromatografi planar ini:
a. Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis.
b. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluorosensi
atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.
c. Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau dengan cara
elusi 2 dimensi.
d. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan
merupakan bercak yang tidak bergerak.

PEMBUATAN LAPISAN TIPIS

Penyerap dituangkan diatas permukaan plat yang kondisi bentuknya baik, biasanya
digunakan plat kaca / aluminium. Ukuran yang digunakan tergantung pada jenis dari
pemisahan yang akan dilakukan dan jenis dari bejana kromatografi. Seringkali bentuk plat
kaca / aluminium dijual dengan ukuran 20 x 5 cm atau 20 x 20 cm, dua ukuran ini dianggap
sebagai “standard”. Hal yang penting yaitu bahwa permukaan dari plat harus rata. Plat -plat
kaca / aluminium sebelum dipakai dicuci terlebih dahulu dengan air dan detergent kemudian
dikeringkan. Terakhir, dapat dicuci dengan aseton, tetapi hal ini tidak mesti dilakukan. Satu
hal yang perlu diperhatikan jangan menyentuh permukaan dari plat yang bersih dengan jari
tangan karena bekas jari tangan yang menempel akan merubah tebal dari permukaan
penyerap pada plat.
Untuk membuat penyerap, pertama bahan penyerap dicampur dengan air sampai
menjadi bubur, biasanya dengan perbandingan x gram penyerap dan 2x ml air. Bubur diaduk
sampai rata dan dituangkan diatas plat dengan berbagai cara. Tebal lapisan merupakan faktor
yang paling penting dalam kromatografi lapisan tipis.Tebal standard adalah 250 mikron.
Lapisan-lapisan yang lebih tebal ( 0.5 - 2.0 mm ) digunakan untuk pemisahan-pemisahan
yang sifatnya besar, dengan menggunakan penyerap hingga 250 mg untuk plat dengan
ukuran 20 x 20 cm. Salah satu kesukaran dengan lapisan tebal ialah adanya tendensi
mengelupas bila kering.
Tabel 2.1 Perbandingan untuk membuat bubur penyerap
Penyerap Medium bubur penyerap Perbandingan, gram
dalam ml
Silika gel Metilena klorida : methanol 35 gr dalam 100 ml
(2:2, v/v)
Serbuk selulosa Metilena klorida : methanol 50 gr dalam 100 ml
(50:50, v/v)
Alumina Metilena klorida : methanol 60 gr dalam 100 ml
(70:30, v/v)

Sifat yang terpenting dari penyerap adalah besar partikel bubur penyerap dan
homogenitasnya, karena adhesi terhadap plat sangat tergantung pada kedua sifat tersebut.
Besarnya partikel yang biasa digunakan adalah 1 – 25 mikron. Partikel yang butirannya
sangat kasar tidak akan memberikan hasil yang memuaskan dan salah satu alasan untuk
menaikkan hasil pemisahan adalah menggunakan penyerap yang butirannya halus.
Sedangkan dalam kolom partikel yang sangat halus akan mengakibatkan aliran pelarut
menjadi lambat, pada lapisan tipis butiran yang halus memberikan aliran pelarut yang lebih
cepat. Beberapa contoh penyerap yang digunakan untuk pemisahan-pemisahan dalam
kromatografi lapisan tipis adalah sebagai berikut :
Tabel 2.2 Macam-macam penyerap untuk kromatografi lapisan tipis
Zat padat Digunakan untuk memisahkan
Silika Asam- asam amino, alkaloid, gula,
asam-asam lemak, lipida, minyak
esensial, anion, dan kation organic,
sterol, terpenoid.
Alumina Alkaloid, zat warna, fenol, steroid,
vitamin-vitamin, karoten, asam-asam
amino
Kieselguhr Gula, oligosakarida, asam- asam
lemak, trigliserida, asam -asam
amino, steroid.
Bubuk selulosa Asam-asam amino, alkaloid, nukleotida
Pati Asam-asam amino
Sephadex Asam-asam amino, protein
 Silika Gel. Merupakan penyerap yag paling banyak dipakai dalam kromatografi
lapisan tipis. Sebagian besar silika gel bersifat sedikit asam maka asam sering agak mudah
dipisahkan. Adapun pengikat yang digunakan adalah kalsium sulfat dan kebanyakan
biasanya pada saat membeli telah diberi pengikat.
Alumina.Salah satu penyerap yang dipakai untuk pemisahan basa dan terdapat dalam
beberapa bentuk modifikasi.Alumina dapat diperlakukan memakai asam klorida untuk diubah
menjadi bentuk asam atau memakai asam nitrat untuk diubah menjadi bentuk netral.Dalam
menggunakan alumina biasanya dapat ditambah dengan pengikat saat membeli di toko-toko
perdagangan kimia.

PELAKSANAAN KLT
1. Fase Diam
Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan
diameter partikel antara 10-30 µm. Semakin kecil ukuran rata- rata partikel fase diam dan
semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja KLT dalam hal
efisiensi dan resolusinya.
Penjerap yang paling sering digunakan adalah silica dan serbuk selulosa, sementara
mekanisme sorpsi yang utama pada KLT adalah adsorpsi dan partisi.
Tabel 2.3 Beberapa penjerap fase diam yang digunakan pada KLT
Penjerap Mekanisme Sorpsi Penggunaan
Silika gel Adsorpsi Asam amino, hdirokarbon, vitamin,
alkaloid
Silika modifikasi Partisi termodifikasi Senyawa-senyawa non polar
dengan hidrokarbon
Serbuk selulosa Partisi Asam amino, nukleotida,
akrbohidrat
Alumina Adsorpsi Hidrokarbon, ion logam, pewarna
makanan, alkaloid
Kieselgur Partisi Gula, asam-asam lemak
Selulosa penukar ion Pertukaran ion Asam nukleat, nukleotida, halide
dan ion-ion logam
Gel sephadex Eksklusi polimer, protein, kompleks logam
β-siklodekstrin Interaksi adsorpsi Campuran enansioner
stereospestik

2. Fase Gerak
Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan mencoba-
coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar.Sistem yang paling sederhana ialah
campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur
sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Berikut adalah beberapa
petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak :
a. Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan teknik
yang sensitif.
b. Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf terletak antara 0,2-0,8
untuk memaksimalkan pemisahan.
 c. Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silica gel,
polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solute yang
berarti juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti
dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzene akan meningkatkan harga Rf
secara signifikan.
d. Solut-solut ionik dan solute-solut polar lebih baik digunakan campuran
pelarut sebagai fase geraknya, seperti campuran air dan methanol dengan perbandingan
tertentu. Penambahan sedikit asam etanoat atau ammonia masing-masing akan meningkatkan
solute-solut yang bersifat basa dan asam.
3. Aplikasi (Penotolan) Sampel
Untuk memperoleh roprodusibilitas, volume sampel yang ditotolkan paling sedikit 0,5
µl. Jika volume sampel yang ditotolkan lebih besar dari 2-10
µl, maka penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar
totolan.
4. Pengembangan
Bila sampel telah ditotolkan maka tahap selanjutnya adalah mengembangkan sampel
dalam bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhi dengan uap fase gerak. Tepi
bagian bawah lempeng tipis yang telah ditotoli sampel dicelupkan kedalam fase gerak kurang
lebih 0,5-1 cm. Tinggi fase gerak dalam bejana harus dibawah lempeng yang telah berisi
totolan sampel.
Bejana kromatografi harus tertutup rapat dan sedapat mungkin volume fase gerak
sedikit mungkin (akan tetapi harus mampu mengelusi lempeng sampai ketinggian lempeng
yang telah ditentukan. Untuk melakukan penjenuhan fase gerak, biasanya bejana dilapisi
dengan kertas saring . Jika fase gerak telah mencapai ujung dari kertas saring, maka dapat
dikatakan bahwa fase gerak telah jenuh.
Gambar berikut ini menunjukkan posisi dari totolan sampel, posisi lempeng dalam
bejana serta ketinggian eluen dalam bejana :
5. Deteksi Bercak
Deteksi bercak pada KLt dapat dilakukan secara kimia dan fisika. Cara kimia yang
biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui cara
penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas. Cara fisika yang dapat digunakan untuk
menampakkan bercak adalah dengan denagan cara pencacahan radioaktif dan fluorosensi
sinar ultraviolet. Fluorosensi sinar ultraviolet terutama untuk senyawa yang dapat
berfluorosensi, membuat bercak akan terlihat jelas.
Berikut adalah cara-cara kimiawi untuk mendeteksi bercak :
1. Menyemprot lempeng KLT dengan reagen kromogenik yang akan bereaksi secara
kimia dengan solute yang mengandung gugus fungsional tertentu sehingga bercak menjadi
berwarna. Kadang-kadang dipanaskan terlebih dahulu untuk mempercepat reaksi
pembentukan warna dan intensitas warna bercak.
2. Mengamati lempeng dibawah lampu ultraviolet yang dipasang panjang
gelombang emisi 254 atau 366 untuk menampakkan solute sebagai bercak yang gelap
atau bercak yang berfluorosensi terang pada dasar yang berfluorosensi seragam. Lempeng
yag diperdagangkan dapat dibeli dalam bentuk lempeng yang sudah diberi dengan senyawa
fliorosen yang tidak larut yang dimasukkan ke dalam fase diam untuk memberikan dasar
fluorosensi atau dapat pula dengan menyemprot lempeng dengan reagen fluorosensi setelah
dilakukan pengembangan.
3. Menyemprot lempeng dengan asam sulfat pekat atau asam nitrat pekat lalu dipanaskan untuk
mengoksidasi solute-solut organic yang akan Nampak sebagai bercak hitam sampai kecoklat-
coklatan.
4. Memaparkan lempeng dengan uap iodium dalam chamber tertutup.
5. Melakukan scanning pada permukaan lempeng dengan densitometer,
suatu instrument yang dapat mengukur intensitas radiasi yang direfleksikan dari
permukaan lempeng ketika disinari dengan lampu UV atau lampu sinar tampak. Solut-solut
yang mampu menyera[p sinar akan dicatat sebagai puncak (peak) dalam pencatatan
(recorder).
6. Perhitungan Nilai Rf
Senyawa -senyawa yang terpisah pada lapisan tipis lebih baik dikerjakan dengan
pereaksi kimia dan reaksi -reaksi warna. Pada umumnya untuk identifikasi senyawa
menggunakan harga Rf. Harga Rf didefinisikan sebagai berikut :
Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen
jarak yang ditempuh oleh pelarut
Harga Rf untuk senyawa-senyawa murni dapat dibandingkan dengan harga -harga
standard. Perlu diperhatikan bahwa harga -harga Rf yang diperoleh hanya berlaku untuk
campuran tertentu dari pelarut dan penyerap yang digunakan, meskipun demikian harga Rf
untuk berbagai campuran dari pelarut dan penyerap dapat diperoleh. Senyawa standard
biasanya memiliki sifat-sifat kimia yang mirip dengan senyawa yang dipisahkan pada
kromatogram.
Dalam kromatografi lapisan tipis perlu mengusahakan atmosfer bejana dalam keadaan
jenuh dengan uap pelarut. Bila atmosfer dalam bejana tidak jenuh dengan uap pelarut dan
digunakan pelarut campuran maka akan terjadi pengembangan dengan permukaan pelarut
yang berbentuk cekung dan fasa bergerak lebih cepat dibagian tepi-tepi plat daripada
dibagian tengahnya. Keadaan ini harus dicegah karena dapat menimbulkan tidak ratanya
dalam memisahkan tiap -tiap senyawa / sampel.
Nilai Rf dinyatakan hingga angka 1,0 beberapa pustaka menyatakan nilai Rf yang baik
yang menunjukkan pemisahan yang cukup baik adalah berkisar antara 0,2-0,8.
7. Alternatif Prosedur KLT
Adanya variasi prosedur pengembangan KLT dilakukan untuk meningkatkan resolusi,
sensitifitas, kecepatan, reprosudibilitas dan selektifitas. Beberapa pengembangan ini meliputi
KLT 2 dimensi, Pengembangan kontinyu dan Pengembangan gradient.
KLT 2 dimensi atau KLT 2 arah ini bertujuan untuk meningkatkan resolusi sampel
ketika komponen-komponen solute mempunyai karakteristik kimia yang hampir sama,
karenanya nilai Rf juga hampir sama sebagaimana dalam asam-asam amino. Selain itu,
system 2 fase gerak yang sangat berbeda dapat digunakan secara berurutan pada suatu
campuran sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang mempunyai
tingkat polaritas yang berbeda.
Pengembangan kontinyu dilakukan dengan cara mengalirkan fase gerak secara terus
menerus pada lempeng KLT melalui suatu wadah
(biasanya alas tangki) melalui suatu lapisan dan dibuang dengan cara tertentu pada
ujung lapisan.
Pengembangan gradient dilakukan dengan menggunakan komposisi fase gerak yang
berbeda-beda.Tujuan utama system ini adalah untuk mengubah polaritas fase gerak.Meskipun
demikian untuk memperoleh komposisi fase gerak yang reprodusibel sangatlah sulit.

PENGGUNAAN KLT
Penggunaan umum KLT adalah untuk menentukan banyaknya komponen dalam
campuran, identifikasi senyawa, memantau berjalannya suatu reaksi, menentukan efektivitas
pemurnian, menentukan kondisi yang
sesuai untuk kromatografi kolom, serta memantau kromatografi kolom, melakukan
screening sampel untuk obat.(1)
 Analisa kualitatif dengan KLT dapat dilakukan untuk uji identifikasi
senyawa baku. Parameter pada KLT yang digunakan untuk identifikasi adalah nilai Rf.
Analisis kuantitatif dilakukan dengan 2 cara, yaitu mengukur bercak langsung pada lengpeng
dengan menggunakan ukuran luas atau dengan teknik densitometry dan cara berikutnya
dalaha dengan mengerok bercak lalu menetapkan kadar senyawa yang terdapat dalam bercak
dengan metode analisis yang lain, misalnya dengan metode spektrofotometri. Dan untuk
analisis preparatif, sampel yang ditotolkan dalam lempeng dengan lapisan yang besar lalu
dikembangkan dan dideteksi dengan cara yang non-dekstruktif. Bercak yang mengandung
analit yang dituju selanjutnya dikerok dan dilakukan analisis lanjutan.
Saat ini metode KLT semakin berkembang dengan hadirnya KLT-KT (Kromatografi
Lapis Tipis Kinerja Tinggi), dimana cara ini lebih efisien dan dengan menghasilkan analisa
yang lebih baik dibandingkan KLT biasa.

B. Pengertian KLT-Densitometri

Densitometri merupakan metode analisis instrumental yang didasarkan pada interaksi

radiasi elektromagnetik dengan analit yang merupakan bercak pada Kromatografi Lapis Tipis
(KLT). Densitometri dimaksudkan untuk analisis kuantitatif analit dengan kadar kecil, yang
sebelumnya dilakukan pemisahan dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) (Rohman, 2009).
Densitometri adalah metode analisis instrumental yang berdasarkan interaksi radiasi
elektromagnetik dengan analit yang merupakan noda pada KLT. Interaksi radiasi
elektromagnetik dengan noda KLT yang ditentukan adalah absorpsi, transmisi, pantulan
(refleksi) pendar fluor atau pemadaman pendar fluor dari radiasi semula. Densitometri lebih
dititik beratkan untuk analisis kuantitatif analit-analit dengan kadar yang sangat kecil yang
perlu dilakukan pemisahan terlebih dahulu dengan KLT. Densitometri merupakan metode
penetapan kadar suatu senyawa pada lempeng kromatografi, menggunakan instrumen TLC
scanner, pengukuran dilakukan dengan cara mengukur serapan analit (cahaya yang diukur
dapat berupa cahaya yang dipantulkan atau yang diteruskan), pemadaman fluoresensi untuk
lapisan yang mengandung bahan berfluorsensi analit atau hasil eaksi analit.
Densitometri adalah alat pelacak kuantitatif yang sangat terkenal. Alat ini dilengkapi
dengan spektrofotometer yang panjang gelombangnya dapat diatur dari 200-700 nm. Alat
tersebut dinamakan TLC Scanner. Teknik penggunaannya didasarkan pada pengukuran sinar
yang diteruskan, diserap dan dipantulkan atau yang dipendarkan. Sinar yang dipantulkan
mengalami hambatan oleh pendukung lempeng dan keseragaman fase diamnya. Sinar yang
dipantulkan dengan arah yang sudah pasti menuju bercak, maka arah pantulannya sehingga
dapat dipantau jumlah sinar yang diserap. Sinar ini sangat sensitif, maka untuk setiap
senyawa dapat dicari dengan serapan maksimalnya. Susunan optik densitometer ini tidak
banyak berbeda dengan spektrofotometer tetapi pada densitometer digunakan alat
khusus yaitu reflection photomultiflier, sebagai pengganti photomultiflier pada
spektrofotometer yang dapat memperbesar tenaga beda potensial listrik sehingga mampu
menggerakkan integrator.
S. LEVI dan R. Reisfeld telah mengangkat metode densitometri ke tingkat analisis
kualitatif ultrmikro. Prinsipnya analisis kuantitatif dengan metode densitometri hampir sama
dengan spektrofotometri.
C. Instrumen
Komponen penting dari densitometer antara lain:
1. Sumber radiasi (Source), pengatur panjang gelombang (λ selector), beam spliter, thin layer
plate (end view), detector phototube (transmitance position) Sumber radiasi ada 3 macam
tergantung rentang panjang gelombang dan prinsip penentuan. Pada umumnya densitometri
memberikan rentang gelombang penentuan 200-630 nm. Lampu Deuterium (D2) dipakai
 untuk pengukuran pada daerah cahaya tampak. Untuk penetapan pendar fluor dan
pemadaman pendar fluor dipakai lampu busur Hg bertekanan tinggi. Sama seperti pada
spektorfotometri, pada densitometri juga dilakukan penentuan transmisi atau adsorpsi dan
refleksi pada panjang gelombang maksimal. Pada penetapan pendar fluor dan pemadaman
pedar fluor juga harus dilakukan pada panjang gelombang dimana terjadi emisi atau intensitas
realitif pendar fluor yang optimal.
2. Monokromator dengan fungsi yang sama seperti pada spektrofotometri UV-Vis yang
diperlukan pada densitometer. Biasanya dipakai monokromator kisi difraksi 1200 garis/mm.
3. Detektor PMT Photo Multiplier Tube = Tabung Penggandaan Foto) merupakan detektor
umum yang dipakai pada densitometer.

INSTRUMENT KLT (TLC Scanner 3 CAMAG)

a. Detektor
Detektor pada alat TLC Scanner 3 CAMAG menggunakan photomultipliers.Komponen
didalam phot omultipier (PMT) sendiri adalah photomultiplier tube (tabung vakum
photomultiplier), photocathode (katoda metalik yang terbuat dari bahan logam multi alkali),
struktur dynode (berbentuk lempengan cekung) dan anoda (memilki spectral sensitivity 185-
850 nm).
Prinsip kerja dari PMT adalah permukaan logam katoda disinari dengan seberkas
cahaya dan sejumlah elektron terpancar dari permukaannya, yang biasa disebut dengan efek
fotoelektrik dengan kondisi hampa udara.
Elektron yang terpancar dan terlepas karena adanya sekumpulan energi yang timbul dan
dikuatkan oleh susunan komponen dynode (linier -focused type) secara berurutan dan keluar
mengenai anoda.Elektron tersebut terikat dalam logam dengan energi W (eV), yang dikenal
sebagai fungsi kerja (work function), logam yang berbeda memilki fungsi kerja yang berbeda
pula. Dan logam katoda yang digunakan sebagai permukaan fotosensitif, dibawah panjang
gelombang pancung (cutoff wavelength) λc, sembarang sumber cahaya, selemah apapun,
akan menyebabkan terjadinya pemancaran fotoelektron. Cahaya yang masuk difokuskan
dengan melewati focusing electrode dan elektron mengenai dynode pertama kemudian
dipantulkan dan dipancarkan ke dynode kedua sampai ke dynode yang terakhir (proses
pengalian) sehingga terjadi muatan elektron yang lebih besar dan timbul tegangan.
b. Monokromator
Monokromator adalah alat yang paling umum dipakai untuk menghasilkan berkas
radiasi dengan satu panjang gelombang.Monokromator untuk radiasi ultra violet, sinar
tampak dan infra merah adalah serupa, yaitu mempunyai celah (slit), lensa, cermin dan
prisma atau grating. Terdapat 2 macam monokromator yaitu monokromator prisma Bunsen
dan monokromator grating Czerney-Turney
Fungsi prisma adalah untuk memisahkan sinar polikromatis dari sumber cahaya
menjadi sinar monokromatis. Bila seberkas cahaya dilewatkan melalui sebuah prisma, maka
cahaya tersebut akandiuraikan menjadi beberapa warna (terdapat berbagai warna merah,
jingga, hijau, biru, dan lain-lain).

Beda lintasan (modus refleksi) :

AB+CD = a(sin (θm) + sin (θi)) (2.1)
Sehingga kondisi untuk puncak maksimum menjadi:
a(sin (θm ) + sin (θi)) = m λ (2.2)
c. Absorbansi
 Penyerapan hanya terjadi jika energi foton yang datang cocok dengan energy yang
diperlukan untuk memindahkan satu elektron terluarnya dari tingkat dasar ke tingkat
tereksitasi (atau dari pita valensi ke pita konduksi di dalam zat padat). Dengan spektroskopi
dari cahaya transmisi bisa diketahui tingkat/pita energi dari suatu atom/molekul/zat padat.
Berkas radiasi elektromagnet bila dilewatkan pada sampel kimia maka sebagian
akan terabsorpsi. Energi elektromagnet yang ditransfer ke molekul sampel akan menaikan
tingkat energi (tingkat tereksitasi). Molekul akan dieksitasi sesuai dengan panjang gelombang
yang diserapnya.
Rumus yang digunakan untuk menghitung besarnya energi yang diserap:
E = h x ν = h x C /λ = h x C / v (1.3)
dimana, E = energi yang diserap
h = tetapan Planck = 6,626 x 10-34
v = frekuensi
C = kecepatan cahaya = 2,998 x 108 m/det
λ = panjang gelombang
ν = bilangan gelombang
Absorbansi dengan simbol A dari suatu larutan merupakan logaritma dari 1/T atau
logaritma Io/It.
A = log (1/T) = log (Io/It) = - log (T) (1.4)
dimana, A = Absorbansi / serapan
Io = Intensitas sinar yang datang
It = Intensitas sinar yang diteruskan
T = Transmitance / transmitansi
d. Transmitansi
Apabila suatu berkas sinar radiasi dengan intensitas Io dilewatkan melalui suatu
larutan dalam wadah transparan maka sebagian radiasi akan diserap sehingga intensitas
radiasi yang diteruskan It menjadi lebih kecil dari Io. Transmitansi dengan simbol T dari
larutan merupakan fraksi dari radiasi yang diteruskan atau ditansmisikan oleh larutan, yaitu :
T = It/Io (2.5)
Transmitansi biasanya dinyatakan dalam persen (%).
TLC Scanner 3 CAMAG
Alat TLC Scanner 3 CAMAG, terdiri atas bagian -bagian elektronik, yaitu :
1. A compartment for plate positioning (with motor driver).
2. Optical system.
3. Three light source ( Deuterium lamp, Tungsten – halogen lamp, Mercury vapor lamp).
· Scanner setup.
Terdapat 2 macam cara sistem kerja / sistem pengukuran TLC Scanner 3 CAMAG, a ntara
lain :
1. Absorbance Mode.
2. Fluorescence Mode.
Gambar 2.8 TLC Scanner 3 (CAMAG) (Service Manual Book TLC Scanner 3 CAMAG)
Absorbance Mode
Setelah sampel pada plat TLC mengalami pemisahan, selanjutnya plat TLC
dimasukkan kedalam alat TLC Scanner untuk dilakukan pengukuran. Dan ditentukan range
panjang gelombang, lalu di start/ dimulai. Prinsip kerja dengan cara absorbance, yaitu energy
cahaya dari sumber lampu yang telah dipilih masuk ke monokromator (M) kemudian cahaya
yang keluar dari monokromator akan mengenai mirror dan dipantulkan menurun mengenai
dan melalui Beam Splitter dan langsung mengenai permukaan putih pada plat TLC yang
kemudian akan dipantulkan ke detektor pengukuran. Sebagian cahaya yang mengenai Beam
Splitter dipantulkan ke reference detektor. Reference detektor berfungsi untuk mengatur
 sensitivity / kepekaan cahaya secara otomatis pada detektor pengukuran sehingga
mendapatkan pancaran cahaya lampu yang tepat pada panjang gelombang tertentu. Kedua
detektor memakai photomultiplers yang mana lebih sensitive dengan range panjang
gelombang yang besar.
Energi cahaya yang dipantulkan dideteksi oleh photomulplier, yang mana photon
memukul/mengenai katoda photomultiplier dan dikuatkan oleh dynodes. Kemudian
kromatogram (sampel pada plat) discan dan timbul perbedaan tegangan yang dihasilkan pada
detektor yang mana diplot sebagai fungsi posisi pengukuran untuk hasil dari sebuah
absorption scan. Jika backgr ound plat discan, intensitas cahaya yang penuh dipantulkan
kembali dan menghasilkan sinyal 100% karena disana tidak ada zat yang menyerap cahaya.
Bila daerah kromatogram discan kemudian akan menyerap bagian penyinaran cahaya dan
memancarkan intensitas cahaya rendah daripada background plat kemudian akan
menghasilkan sinyal pada detektor.
Sistem scanning bekerja berdasarkan pergerakan plat TLC pada compartment secara
otomatis dan mempunyai posisi yang dapat diatur terhadap sumbu x dan y. Plat TLC / objek
pengukuran yang berada pada compartment digerakkan oleh motor stepper yang terletak
dibawah sorotan lampu.
Absorbance adalah perbedaan diantara cahaya yang terjadi dan cahaya yang terserap
diukur sebagai fungsi karakteristik zat. Dengan kata lain, absorbance adalah perbedaan
diantara pantulan cahaya yang diukur dari tempat yang kosong pada plat TLC dan pantulan
cahaya dari zat pada plat TLC yang sama.
Flourescence Mode
Prinsip kerja dengan cara fluorescence sama dengan cara absorbance, yaitu pada saat
melakukan scan pada suatu zat pada plat TLC, background plat tidak ada sinyal karena
adanya panjang gelombang yang tidak diperlukan akan dihalangi oleh filter.
Jika daerah fluorescent (sampel pada plat) mengalami scanning maka akan
memancarkan cahaya yang akan masuk dan melewati filter kemudian menghasilkan sinyal
pada detektor. Pengukuran fluorescent ini hanya untuk menganalisa zat yang tidak tampak.
Hasil sinyal output dari detektor dihubungkan dengan perangkat elektronik seperti
amplifier dan A/D Converter. Setelah sinyal output dari detektor masuk ke A/D Converter,
lalu sinyal output (analog) ini akan diubah menjadi sinyal digital, yang mana akan
dihubungkan langsung ke PC melalui connection serial interface RS232. Dengan
didukungnya software WinCATS maka dapat mengetahui nilai konsentrasi zat dan dapat
menampilkan gambar Peak (puncak kromatogram), yang mana gambar peak ini berbentuk
mirip dengan kurva Gaussian, yang menunjukkan karakteristik tersendiri dari zat yang
diukur.

D. Aplikasi KLT-Densitometri
1) Analisis Kualitatif
Analisis kualitatif dengan KLT-Densitometri pada prinsipnya mengacu kepada nilai
Rf(Retardation factor) atau Faktor retardasi yaitu : membandingkan Rf analit dengan Rf baku
pembanding atau membandingkan bercak kromatogram sample dengan
kromatogram "Reference Standart" yang dikenal dengan : Factro Retensi Relatif (Rx)
Untuk penentuan kualitatif dengan Rs harus dilakukan bersamaan dengan sample pada pelat
yang sama.
2) Analisis Kuantitatif
Analisis kuantitatif hampir sama dengan spektrofotometri, penentuan kadar analit
dikorelasikan dengan area bercak pada pelat KLT.
Cara penetapan kadar dapat dilakukan dengan :
 1. Membandingkan area bercak analit dengan area bercak baku pembanding yang diketahui
konsentrasinya.
Cx = Ax / Ap x Cp
Cx = konsentrasi analit
Ax = area analit
Ap = area baku pembanding
Cp = konsentrasi baku pembanding
2. Kurva kalibrasi :
Kurva kalibrasi dibuat dengan cara memplot area bercak terhadap konsentrasi dari satu
seri larutan baku pembanding. Kurva yang tebentuk harus linear, kemudian dengan
persamaan garis regresi dapat ditentukan kadar analit.
Penentuan kadar analit yang dikorelasikan dengan area noda plat KLT akan lebih terjamin
kesahihannya dibanding metode KCKT atau KGC, sebab area noda kromatogram diukur
pada posisi diam atau “zig-zag” menyeluruh. Korelasi kadar analit pada noda kromatogram
yang dirajah terhadap area tidak menunjukkan garis lurus, akan tetapi merupakan garis
lengkung mendekati parabola (mulja,1985).

BAB III
PENUTUP
A. Kesimpulan
1. Kromatografi Lapis Tips (KLT) merupakan metode pemisahan komponen-komponen atas
dasar perbedaan adsorpsiatau partisi oleh fase diam di bawah ngerakan pelarut
pengembang/pengembang campur.
2. Densitometri merupakan metode analisis instrumental yang didasarkan pada interaksi radiasi
elektromagnetik dengan analit yang merupakan bercak pada Kromatografi Lapis Tipis
(KLT).

DAFTAR PUSTAKA

Gandjar, Ibnu Ghalib dan Abdul Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta:Pustaka
Pelajar.

Mulja M., Suharman. 1995. Analis Instrumental. Surabaya: Airlangga University Press.

Stahl, E.1985. Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi, Diterjemahkan oleh Kosasih
Padmawinata dan Iwang Soediro. Bandung : Penerbit ITB.
Sastrohamidjojo, H. 1991. Kromatografi. Yogyakarta: Liberty.
Touchstone, JC., Rogers, D. 1980. Thin Layer Chromatography Quantitative Enviromental and
Clinical Application. New York: A Willey Intenscience Publication, John Willey & Sons.