METODE

PEMISAHAN
01
An Introduction to Planar
Chromatography

Simon Gibbons
The International Union of Pure and
Applied Chemistry (IUPAC)
mendefinisikan kromatografi sebagai
metode pemisahan fisik di mana
komponen yang akan dipisahkan
didistribusikan antara dua fase, fase
diam tidak bergerak dan fase gerak.
KLT
• Kromatografi lapis tipis (KLT) telah
menjadi teknik analisis yang banyak
digunakan.
• Karena: sederhana, murah, cepat, dan
efisien, dan hanya membutuhkan bahan
atau sampel dalam jumlah miligram.
• Kegunaan KLT untuk menentukan berapa
jumlah senyawa dalam suatu campuran,
membantu menentukan apakah dua
senyawa identik atau tidak.
• Untuk melakukan analisis KLT, sejumlah
kecil sampel dilarutkan dalam pelarut
yang sesuai dan diaplikasikan atau
diteteskan pada adsorben dekat salah
satu ujung pelat KLT.
• Kemudian pelat ditempatkan dalam
ruang tertutup, dengan tepi yang paling
dekat dengan titik penotolan sampel
dicelupkan ke dalam lapisan fase gerak
yang disebut pelarut pengembang (elusi)
• Pelarut naik melalui fase diam melalui aksi
kapiler, suatu proses yang disebut
pengembangan kromatogram.
• Saat pelarut naik ke pelat, sampel
didistribusikan antara fase gerak dan fase
diam.
• Pemisahan selama proses
pengembangan terjadi sebagai akibat
terjadinya kesetimbangan antara fase
gerak dan fase diam serta senyawa yang
dipisahkan.
• Semakin erat suatu senyawa berikatan
dengan adsorben, maka semakin lambat
senyawa tersebut bergerak pada pelat KLT.
• Ketika silika gel merupakan fase diam,
fase gerak akan memindahkan zat
nonpolar ke atas pelat dengan paling
cepat.
• Saat terjadi elusi, pada kromatogram
akan terlihat zat polar naik ke atas pelat
secara perlahan atau tidak sama sekali.
• Pelat KLT dikeluarkan dari ruang chamber
ketika bagian depan pelarut (tepi depan
pelarut) berjarak 1-1,5 cm dari bagian
atas pelat.
• Posisi bagian depan pelarut ditandai
segera, sebelum pelarut menguap,
dengan garis pensil.
• Plat KLT tersebut kemudian ditempatkan di
dalam wadah hingga kering.
• Untuk memvisualisasikan senyawa dalam
sampel. Beberapa senyawa berwarna dan
bercak noda mudah terlihat.
• Jika pelat KLT diresapi dengan indikator
fluoresen, pelat tersebut dapat
divisualisasikan dengan paparan sinar
ultraviolet.
• Senyawa dapat divisualisasikan
menggunakan reagen yang
menghasilkan bintik-bintik berwarna.
• Pelat yang dikembangkan dan
divisualisasikan kemudian siap untuk
analisis kromatogram.
Nilai Rf adalah rasio, < 1, tergantung
pada fase diam dan sistem fase
gerak.
SOAL KLT
Tiga komponen dipisahkan dengan
menggunakan fase diam silica gel.

Hitunglah nilai Rf dan jelaskan tentang

kepolaran senyawa tersebut.
PLAT KLT

Pelat kromatografi lapis tipis terdiri

dari bahan pendukung padat,
seperti kaca, logam, atau plastik
dengan lapisan tipis bahan
penyerap yang melapisi permukaan
padat, yang menghasilkan fase
diam.
Adsorben
• Silika gel (SiO2.xH2O) adalah
adsorben serba guna yang paling
umum digunakan untuk kromatografi
partisi senyawa organik.
• Aluminium oksida (Al2O3, alumina)
juga dapat digunakan sebagai
adsorben polar.
• Selulosa digunakan untuk
memisahkan senyawa yang sangat
polar.
 Adsorben
Gaya antarmolekul yang menyebabkan
ikatan molekul organik dan fase diam
polar :
• Gaya van der Waals yang lemah
yang mengikat senyawa nonpolar ke
adsorben,
• Molekul polar juga dapat teradsorpsi
melalui interaksi dipol-dipol, ikatan
hidrogen, dan koordinasi pada
permukaan oksida logam yang
sangat polar.
Adsorben

• Silika gel dan aluminium oksida.

Adsorben silika gel dan alumina
dalam bentuk serbuk. Aktivasi
serbuk silika dan alumina dengan
cara pemanasan menggunakan
oven selama 15-30 menit (suhu
direkomendasikan oleh produsen)
untuk menghilangkan air yang
teradsorpsi.
Adsorben

Silica gel bersifat agak asam, dan

biasanya efektif memisahkan
senyawa asam dan netral yang tidak
terlalu polar.
Aluminium oksida (alumina) terdapat
dalam formulasi asam, basa, dan
netral untuk pemisahan senyawa yang
relatif nonpolar.
Adsorben

Silica gel bersifat agak asam, dan

biasanya efektif memisahkan
senyawa asam dan netral yang tidak
terlalu polar.
Aluminium oksida (alumina) terdapat
dalam formulasi asam, basa, dan
netral untuk pemisahan senyawa yang
relatif nonpolar.
Adsorben

Selulosa.
Selulosa kurang polar dibandingkan
silika gel dan alumina dan digunakan
untuk kromatografi partisi senyawa
organik yang larut dalam air dan
cukup polar, seperti gula, asam amino,
dan turunan asam nukleat.
Adsorben

• Selulosa dapat menyerap hingga

20% beratnya di dalam air; zat yang
dipisahkan mempartisi dirinya
sendiri antara fase gerak dan
molekul air yang terikat hidrogen
pada partikel selulosa.
• Kromatografi kertas adalah contoh
penggunaan selulosa sebagai fase
diam.
Adsorben untuk KLT fase terbalik.

• Adsorben yang digunakan pada

plat untuk KLT fase terbalik adalah
silika gel yang dimodifikasi dengan
mengganti gugus hidroksil yang
biasanya terikat pada atom silikon
dengan gugus alkoksi dan dengan
gugus alkil rantai panjang, seperti
9(CH2)17CH3.
• Rantai alkil menghasilkan fase diam
cair nonpolar.
 Adsorben untuk KLT fase terbalik.

• Pelarut yang digunakan dalam KLT

fase terbalik cukup polar, misalnya
metanol atau asetonitril, dan air.
• Pada KLT fase terbalik, urutan
pergerakan ke atas plat KLT dibalik;
senyawa yang lebih polar bergerak
lebih cepat dibandingkan senyawa
yang kurang polar, yang mengikat
lebih erat pada permukaan adsorben
nonpolar.
 Penotolan Sampel

• Sampel harus dilarutkan dalam

pelarut organik yang mudah
menguap; dengan konsentrasi sangat
encer (1–2%), Karena atmosfer dalam
ruang pengembangan harus jenuh
dengan uap pelarut, maka pelarut
memerlukan volatilitas yang tinggi
agar mudah menguap pada suhu
kamar.
 Penotolan Sampel

• Sampel zat padat sejumlah 10–20 mg

dilarutkan ke dalam 1 mL pelarut,
• Sampel dalam bentuk cairan yang
tidak mudah menguap, larutkan
sekitar 10 μl cairan ke dalam 1 mL
pelarut.
B. Mekanisme Pemisahan

1. Adsorption Chromatography
2. Partition Chromatography
3. Size-Inclusion/Exclusion
Chromatography
4. Ion Exchange Chromatography
 1. Adsorption Chromatography

Komponen senyawa yang melalui

sorben, perpindahan komponen
dipengaruhi afinitas komponen
terhadap sorben.
Komponen yang lebih kuat teradsorpsi
oleh sorben akan bergerak perlahan
(polar) dibandingkan non polar bila
sorben adalah silika atau alumina.
 2. Partition Chromatography

Kelarutan (relatif) senyawa antara

sorben (fase diam) dan eluen pelarut
(fase gerak).

Senyawa yang lebih mudah larut

dalam fase gerak akan bermigrasi
lebih cepat daripada komponen yang
larut didalam fase diam
 2. Partition Chromatography

Reversed-phase TLC (KLT fase terbalik).

Fase diam : berlemak
Fase gerak : air

Ex. Fase diam : silika yang direaksikan

dengan rantai lurus unit alkil Karbon-18
membentuk fase octadecasilyl (ODS)
3. Size-Inclusion/Exclusion
Chromatography

Komponen dipisahkan berdasarkan

ukuran bobot molekul.

Fase diam : gel dextran,

Sorben lipofilik Sephadex LH-20, yang
bila dilarutkan didalam metanol akan
membentuk gel
3. Size-Inclusion/Exclusion
Chromatography

Sephadex LH-20 digunakan untuk

memisahkan senyawa hidrofobik kecil
dari kontaminan yang besar seperti
klorofil, asam lemak dan gliserida.
3. Size-Inclusion/Exclusion
Chromatography

Komponen akan bermigrasi bersama

fase gerak melewati gel, molekul kecil
akan inklud kedalam geo matrik,
sedangkan komponen yang lebih
besar akan bermigrasi dengan
kecepatan yang tinggi.
4. Ion Exchange Chromatography

Digunakan terbatas pada campuran

yang mengandung komponen dengan
muatan.

Fase diam : polimer resin, yang

mengandung gugus bermuatan dan
ion senyawa akan bertukar dengan ion
fase diam ketika fase gerak melewati
fase diam.
 4. Ion Exchange Chromatography

Pertukaran anion : gugus amonium

kuartener (-N+R3) akan bergabung
dengan resin dan terjadi pertukaran
anion dengan komponen.
C. APLIKASI KLT

KLT digunakan untuk deteksi dan

monitoring komponen melalui proses
pemisahan.

Untuk mengetahui ada atau tidaknya

metabolit Senyawa bahan alam
 D. SISTEM PENGEMBANGAN

Sistem pengembangan :
Ø Isokratis (satu sistem pelarut dengan
komposisi yang konstan)
Ø SGP (salute gradient Polarity) :
pengembangan pertama dalam
pelarut nonpolar dan meningkat
berdasarkan polaritas pelarut
 SISTEM PELARUT ELUEN (1)

Heksan : etil asetat (EtOAc)

FD : Silika gel
Cat : sistem universal, heksan dapat
diganti dengn petroleum atau pentana.
 SISTEM PELARUT ELUEN (2)

Petroleum : dietil eter (Et2O)

FD : Silika gel
Cat : sistem universal, Untuk metabolit
non polar. Terbaik untuk terpen dan
asam lemak.
Hati-hati dengan dietil eter karena
campuran mudah terbakar.
SISTEM PELARUT ELUEN (3)

Petroleum : Chloroform -- CHCl3

FD : Silika gel
Cat :digunakan untuk memisahkan
turunan asam sinamat dan khususnya
kumarin
 SISTEM PELARUT ELUEN (4)

Toluena : EtOAc: asam asetat (TEA)

FD : Silika gel
Cat :banyak komposisi.. Contoh : 80 :
18 : 2 atau 60 : 38 : 2. digunakan untuk
metabolit bersifat asam.
SISTEM PELARUT ELUEN (5)

CHCl3 : aseton
FD : Silika gel
Cat :sistem eluen umum untuk
senyawa dengan polaritas sedang
 SISTEM PELARUT ELUEN (6)

Benzen : aseton
FD : Silika gel
Cat :digunakan untuk memisahkan
senyawa aromatiks.
Benzen : pelarut dengan karsinogen
tinggi.
Ganti benzen dengan toluena.
 SISTEM PELARUT ELUEN (7)

Butanol : asam asetat : air

FD : Silika gel
Cat :sistem polar untuk flavonoid dan
glikosida.
 SISTEM PELARUT ELUEN (8)

Butanol : air : pyridine : toluena

FD : Silika gel
Cat : sistem analisis gula. Coba
dengan 10 : 6 : 6 :1
SISTEM PELARUT ELUEN (9)

Metanol : air
FD : C18
Cat : dimulai dengan MeOH untuk
menentukan metabolit yang akan
bergerak dari asal.
Tingkatkan konsentrasi air untuk
memperlambat senyawa.
Tambahan sejumlah kecil asam akan
meningkatkan kromatografi.
 SISTEM PELARUT ELUEN (10)

Acetonitril : air
FD : C18 / C2
Cat : eluen unoversal unuk sistem fase
terbalik ( reverse-phase system)
 SISTEM PELARUT ELUEN (11)

Metanol : air
FD : polyamide
Cat : universal

Metanol : air
FD : selulosa
Cat : untuk memisahkan komponen
yang kepolarannya tinggi seperti gula
dan glikosida
E. DETEKSI SENYAWA ALAM
DENGAN KLT

1) Deteksi Ultraviolet
2) Deteksi dengan reagen semprot
(reaksi warna)
 1. Deteksi dengan Ultraviolet

Deteksi UV menggunakan senyawa

UV-aktif (indikator) yang dimasukkan
ke dalam sorben (fase diam) pada plat
KLT oleh pembuatnya (Pabrik).
 1. Deteksi dengan Ultraviolet

Plat KLT dari Merck* : alumina,

ketebalan 0,2 mm, 20 x 20 cm,
indikator 254 nm.
Dibawah sinar UV gelombang pendek
(254 nm), indikator Mn-Zn silikat.
Memancarkan cahaya hijau pucat.
1. Deteksi dengan Ultraviolet

Dibawah sinar UV gelombang panjang

(366 nm), indikator Mn-Zn silikat.
Memancarkan cahaya ungu pucat.
Senyawa yang menyerap cahaya
pada 254 atau 366 nm akan muncul
sebagai bintik-bintik gelap dengan
latar belakang cahaya ketika sinar UV
ke plat.
 1. Deteksi dengan Ultraviolet

Senyawa yang memancarkan

floresensi biru atau kuning yang khas
dibawah sinar UV.
Kerugian : untuk senyawa yang tidak
dapat menyerap sinar UV 254 dan 366
nm.
Keuntungan : tidak destruktif, deteksi
senyawa lebih mudah.
1. Deteksi dengan Reagen
Semprot
Tergantung pada reaksi warna antara
senyawa pada plat KLT dengan reagen
semprot.

Ex. Reagen Dragendorff

 a. Vanillin/asam sulfat

Larutkan 1 g vanillin didalam H2SO4 p

P : semprotkan ke atas plat dan
panaskan pada 100oC hingga
berwarna.
Cat : universal spray.
Terpen : warna merah dan biru
Bila warna yang dihasilkan jelek, dapat
disemprot 2 x. Lakukan di lemari asam.
 b. Reagen Dragendorff

P : umumnya tidak membutuhkan

pemanasan, tetapi bila rx tidak
spontan, dapat dilakukan pemanasan
hingga terjadi warna.

Cat : deteksi alkaloid, dengan warna

orange gelap hingga merah.
 c. Reagen 2,4 Dinitri-phenyl
hydrazine

Larutkan 2,4-dinitrophenylhydrazine
(0,2 G) kedalam HCl 2N (50 ml).
P : umumnya tidak membutuhkan
pemanasan, tetapi bila rx tidak
spontan, dapat dilakukan pemanasan
hingga terjadi warna.
Cat : aldehid dan keton dengan warna
kuning hingga merah
 d. Asam perklorat

Larutan 20 % dalam air

P : Panaskan hingga 100oC hingga

berwarna.

Cat : steroid dan triterpen

e. Ninhydrin

Tambahkam Ninhydrin (0,3 g) kedalam

campuran butanol (100 ml) dan asam
asetat ( 3 ml)

P : Panaskan hingga 100oC hingga

berwarna.

Cat : untuk asam amino, amina dan

alkaloid (merah).
F. CENTRIFUGAL PREPARATIVE
THIN-LAYER CHROMATOGRAPHY
(CPTLC) : Chromatotron

Teknik untuk pemurnian senyawa alami.

CPTLC : menggunakan rotor yang

dilapisi sorben untuk membentuk pelat
melingkar, kemudian dilekatkan ke
spindel dan diputar menggunakan
motor
CENTRIFUGAL PREPARATIVE THIN-
LAYER CHROMATOGRAPHY
(CPTLC)

Pelarut kemudian dimasukkan ke

tengah plat lingkaran dengan pompa
vakum untuk menyeimbangkan sorben.
Plat berputar dan pelarut bermigrasi
melalui sorben, sampel dipisahkan
dalam pita-pita melingkar.
KEUNGULAN CPTLC

a) Pemisahan berlangsung dengan

cepat , karena pengembangan
(penjenuhan) secara sentrifugas
lebih cepat oleh karena rotasi plat.
b) Perubahan pelarut dapat dilakukan
dengan cepat, dapat
menggunakan mode SGP atau
isokratik.
Pembuatan plat CPTLC

Plat dapat dibuat dengan sorben :

silica (Kieselgel 60 PF254 Merck Art 7749)
(65 atau 100 g : untuk ketebalan 2 atau
4 mm) dan pengikat (CaSO4 4 atau 6
g) tambahakan aqua destilata (100
atau 190 ml) dan kocok seluruhnya.
Plat dikeringkan diudara 30 menit dan
dioven 50O selama 12 jam.
G. KLT DUA DIMENSI

KLT dua dimensi sering digunakan

untuk skrining campuran kompleks.

Ekstrak ditotolkan pada plate (kondisi

normal), setelah di elusi, keringkan dan
putar 90o dan elusi kembali untuk
kedua kalinya.
H. UJI AKTIVITAS DENGAN KLT

KLT dapat digunakan untuk mendeteksi

aktivitas biologi dari komponen yang
dipisahkan.

Contohnya adalah :
1. UJI ANTIOKSIDAN KLT

Sifat antioksidan dari senyawa

flavonoid menggunakan 2,2-diphenyl-
picrylhydrazyl (DPPH).

Adanya senyawa antioksidan akan

mengubah warna ungu menjadi
kuning.
1. UJI ANTIOKSIDAN KLT

Aktivitas antioksidan dengan cara elusi

plat KLT dengan sampel (konsentrasi
0,1 – 100 μg , plat dikeringkan, dan
disemprot dengan larutan DPPH ( 2
mg/ml dalam MeOH). Dan diamkan
satu jam, komponen antioksidan
diperlihatkan dengan noda (spot)
kuning dengan latar belakang ungu.
2. UJI ANTIMIKROBA KLT

Plat KLT yang telah dielusi, semprotkan

mikroorganisme pada plat
( bioautographi langsung) atau plat
diletakkan pada medium yang
mengandung mikroorganisme didalam
cawan petri.