KROMATOGRAFI

KOLOM
 KROMATOGRAFI KOLOM
■ Berguna untuk:
1. Sampel yang mengandung molekul besar
2. Zat yang bersifat ion dengan tekanan uap yang
rendah
3. Zat yang termolabil yang tidak dapat diuapkan
tanpa penguraian.
 Kromatografi Kolom
• KROMATOGRAFI ADSORPSI
• KROMATOGRAFI KOLOM PEMBAGIAN
• KROMATOGRAFI PERTUKARAN ION
• KROMATOGRAFI GEL
• KROMATOGRAFI AFINITAS
 KROMATOGRAFI ADSORPSI
■ Adsorpsi merupakan
peristiwa penyerapan pada
lapisan permukaan atau antar
fasa, dimana molekul dari
suatu materi terkumpul pada
bahan pengadsorbsi atau
adsorben.
■ Sifat atom, ion, molekul
pada permukaan zat padat
berbeda bila terletak pada
bagian sebelah dalam zat
padat.
Hubungan antara zat yang diadsopsi
dengan fase gerak
■ K = Cs / CM atau Cs = K CM
■ Garis Lurus
Permukaan adsorben tidak menjadi jenuh dengan spesies yang
ada
■ Garis Cembung
Bentuk ini disebabkan adanya variasi dari bidang adsorpsi
yang ada. Banyak sistem cair padat yang mengikuti hubungan
ini yang dikenal sebagai Freundlich isoterm
■ Garis Cekung
Adanya reaksi-reaksi tambahan pada peristiwa adsorpsi yang
kadang-kadang dapat meningkatkan proses adsorpsi secara
keseluruhan
 Adsorben (Penyerap)
■ Zat padat yang digunakan untuk pemisahan dalam
kromatografi
■ Adsorben berhubungan erat dengan aktivasi
■ Silika gel, karbon, dan alumina adsorben yang aktif
karena memiliki permukaan spesifik beratus-ratus
meter persegi
■ Sedangkan kalsium karbonat dan kalsium hidroksida,
mempunyai luas permukaan spesifik yang
mempunyai ukuran dalam puluhan meter persegi atau
kurang, hingga ini dapat dikatagorikan relatif kurang
aktif.
■ Kekuatan adsorpsi dari gugus polar pada
senyawa-senyawa polar naik dengan urutan :
CH = CH, -OCH, -CO2R, =C=O, -CHO, =SH,
-NH2, -OH, -CO2H
■ Aktivasi adsoben di lakukan dengan
pemanasan
 Tabel 1. Jenis adsorben dan kegunaannya

Digunakan untuk memisahkan

Zat padat
Alumina/magnesia Sterol-sterol, zat warna, vitamin-vitamin, ester-ester,
alkaloid-alkaloid, senyawa anorganik
Silika gel Sterol-sterol, asam-asam amino
Karbon Peptida-peptida,karbohidrat-karbohidrat, asam-asam amino

Magnesium silikat Sterol-sterol, ester-ester, gliserida-gliserida, alkaloida-

alkaloida
Magnesium karbonat Porphirin
Kalsium hidroksida Karotenoida-karotenoida
Kalsium karbonat Karotenoida-karotenoida, Xantofil
Kalsium fosfat Enzim-enzim, protein-protein, polinukleotida-
polinukleotida
Aluminium silikat Sterol-sterol
Pati Enzim-enzim
Gula Klorofil, xantofil
 Eluen
■ Pemilihan pelarut sama pentingnya dengan pemilihan
adsorben
■ Fasa gerak cair tidak hanya menyediakan
pengangkutan sebagai wahana tetapi juga
mempengaruhi koefisien pembagian melalui daya
pelarutnya
■ Disamping kelarutan relatif zat terlarut dalam pelarut
elusi, perlu dipertimbangkan pula persaingan antara
zat terlarut dengan pelarut terhadap bidang adsorpsi
pada permukaan dari fasa diam
■ Pelarut yang mengelusi zat terlarut cepat tidak akan
dapat memisahkan dengan baik, sebaliknya pelarut
yang bergerak terlalu lambat akan memberikan waktu
retensi yang terlalu panjang.
■ Waktu retensi yang terlalu panjang dapat
menyebabkan pelebaran pita dan peristiwa
pengenceran yang tidak perlu.
■ Kadang-kadang perlu digunakan suatu campuran
pelarut atau suatu seri pencampuran (gradient
elution) dengan variasi eluen yang polaritasnya
makin tinggi.
■ Menurut Trappe kekuatan elusi dari pelarut-pelarut
berikut akan diturunkan dalam suatu kolom yang
berisi silika gel :
Air < metanol < etanol < propanol < aseton <
etilasetat <dietil eter < kloroform < metilena klorida
< benzene < toluene ( trikloroetilena ) <
karbontetraklorida < sikloheksana < heksana
■ Sedang untuk adsorben karbon aktif, pelarut-pelarut
di bawah ini diturunkan daya elusinya untuk
pemisahan asam-asam amino dan sakarida-sakarida:
Etil asetat < dietil eter < propanol < aseton < etanol <
metanol < air
 Teknik Analisis
a. Pengisian kolom
■ Pengisian kolom yang kurang baik dapat
menyebabkan:
■ Rusaknya batas-batas jalur-jalur kromatografi
■ Adanya gelembung udara atau tempat berongga pada
kolom mengakibatkan putusnya penyerap (adsorben)
■ Cara Pengisian Adsorben
■ Cara Kering: dangan cara dilakukan penggoyangan atau
penekanan selama pengisian adsorben
■ Cara lain dengan menuangkan pelan-pelan bubur adsorben
dalam pelarut
b. Pemasukan cuplikan
■ Cuplikan dimasukkan dan dibuat serata mungkin pada puncak
dari kolom
■ Cuplikan dalam bentuk larutan yang pekat dan jangan sampai
terjadi jalur-jalur yang terputus
■ Untuk memperoleh permukaan yang rata biasanya pada bagian
atas kolom diberi kertas saring atau dengan pasir yang bersih
■ Untuk memasukkan sampel dapat digunakan pipet yang kecil
dan panjang dengan menggerakan memutar kesekeliling
kolom
■ Cuplikan yang tertinggal pada dinding kolom dapat dilarutkan
dengan pelarutnya
■ Setelah semua cuplikan berada dibagian atas kolom maka
dapat ditambahkan eluen perlahan-lahan menggunakan corong
pisah
■ Proses elusi dimulai
c. Elusi
■ Ada tiga macam cara elusi yaitu :
- Elusi sederhana
Yaitu elusi yang menggunakan campuran pelarut dengan
komposisi yang tidak berubah selama proses pemisahan
- Elusi berfraksi (fractional elution)
Adalah elusi dimana untuk memisahkan suatu komponen dari
suatu campuran digunakan satu macam eluen, sehingga untuk
memisahkan suatu campuran perlu digunakan beberapa
macam eluen yang berbeda-beda.
- Elusi bertingkat (gradient elution)
Adalah elusi untuk memisahkan suatu komponen campuran
dimana eluen yang digunakan terus menerus berubah.
Misalnya mula-mula digunakan air dalam pemisahan dan
kemudian ditambahkan sedikit demi sedikit pelarut yang lain
misalnya etanol
d. Cara deteksi
■ Fasa diam dalam bentuk serbuk umumnya tidak
berwarna atau berwarna putih, sehingga
memudahkan dalam penglihatan analisa zat yang
berwarna
■ Dalam teknik yang khusus elusi dihentikan jika pita
yang pertama tampak pada ujung bawah.
■ Kemudian bahan penyerap dikeluarkan dan
ditambahkan suatu pereaksi yang dapat
menunjukkan posisi pita.
■ Cara lain adalah memisahkan setiap fraksi dari
eluen dan diperiksa dengan alat-alat lain seperti
spektrofotometer, fluorometer, pH meter dan
sebagainya. Selain itu fraksi pelarut dapat diuapkan
dan diidentifikasi.
 KROMATOGRAFI KOLOM
PEMBAGIAN
■ Fasa diam berupa zat cair sedang fasa gerak dapat berupa zat
cair ataupun gas
■ Zat padat digunakan sebagai penunjang fase diam
■ Sebagai zat penunjang harus memenuhi syarat:
1. Mengadsorpsi dan menahan fasa diam dan membuat luas
permukaan fasa diam seluas-luasnya
2. Selain itu juga dipersyaratkan harus stabil, mudah diisikan
dan tidak menghalangi aliran fasa gerak
■ Sebagai zat padat penunjang dapat digunakan silika gel,
serbuk selulosa dan tanah diatomae
 Teknik Analisis
a. Pemasukkan Penyerap
■ Mula-mula mencampur penunjang dengan cairan yang
akan digunakan sebagai fasa diam, diaduk-aduk dan
dibuat bubur dengan fasa gerak yang akan digunakan
■ Bubur ini kemudian dimasukkan ke dalam kolom sedikit
demi sedikit dimana kolom telah diisi dengan sedikit
pelarut
■ Sebaiknya setiap pemasukkan bubur ke dalam kolom
disertai dengan penekanan dengan batang gels yang
ujungnya datar
■ Semakin kompak isi kolom semakin baik pemisahan
yang terjadi
b. Pemasukan Cuplikan
■ Cara pemasukkan cuplikan dengan
menggunakan pipet seperti pada kromatografi
kolom adsorpsi.
■ Dengan melarutkan cuplikan dalam suatu
pelarut dan mencampurkannya dengan
sejumlah zat padat penunjang sehingga
diperoleh suatu bubuk yang kering.
■ Bubuk ini kemudian diletakkan dibagian atas
kolom dan sedikit fasa gerak ditambahkan
c. Elusi
■ Cara elusi yang digunakan dalam kromatografi kolom
pembagian sama seperti ada kromatografi
penyerapan.
■ Jika fasa diam adalah molekul air maka fasa gerak
dapat digunakan pelarut organik.
■ Pada perkembangan selanjutnya ada suatu teknik
dalam kromatografi partisi dengan menggunakan
pelarut organik yang bersifat non polar sebagai fasa
diam, teknik ini dimaksudkan agar diperoleh nilai
koefisien partisi yang lebih menguntungkan untuk
proses pemisahan. Oleh sebab itu sebagai penunjang
digunakan yang bersifat tidak polar.
 Tabel 2 Contoh Beberapa pemisahan pada kolom partisi

Penyokong Fasa tetap Fasa gerak

Pemisahan
Alkohol-alkohol Celite Air CHCl3 atau CCl4
C1 – C4
Asam-asam lemak Silika gel Air CHCl3 / n-BuOH
C1 – C4
Asam-asam amina Pati Air n-PrOH atau n-BuOH
/ HCl
Fenol-fenol Selulosa Air Me-OH/n-BuOH/
CHCl3
Lipida-lipida Silika gel Air Bermacam-macam
 KROMATOGRAFI PERTUKARAN
ION
■ Sebagai bahan penukar ion digunakan resin penukar
ion sintetik yang mempunyai stabilitas kimiawi serta
ukuran partikel yang seragam
■ Resin merupakan suatu polystyrene yang dibuat
dengan proses polimerisasi dari styrene dan adanya
sedikit divinyl benzene
■ Kemudian ke dalam polystyrene dimasukkan gugus-
gugus polar yang dapat memberikan sifat pertukaran
ion
■ Mekanisme pemisahan resin penukar ion ada 2
macam:
■ Penukar kation yaitu yang mempunyai gugus
polar yang bersifat asam seperti : -SO 3H atau
–COOH
■ Penukar anion yaitu yang mempunyai gugus
polar yang bersifat basa seperti ; -CHNR
Pemisahan Berdasarkan Pertukaran
ion
M+ + RH ⇔ H+ + RM
M+ adalah kation bebas
RH adalah simbol dari proton yang terikat
Jika butiran resin dimasukkan ke dalam air maka
gugus sulfon akan terionisir seluruhnya, tetapi
proton-protonnya tidak dapat pergi meninggalkan
kerangka resin karena secara elektris tidak netral dan
disebabkan tidak adanya kemungkinan dapat terjadi
pertukaran antara kation tersebut dengan proton
karena biasanya larutan juga terdapat anion.
 Teknik Analisis
a. Pembuatan Resin
Beberapa sifat dari resin untuk keperluan analisis :
■ harus mempunyai gugus pertukaran yang berfungsi
tunggal
■ mempunyai derajat hubungan silang yang tertentu (4 – 8
%)
■ ukuran partikel sebaiknya sekecil mungkin
Kadangkala perlu dilakukan perubahan bentuk resin yaitu bentuk
yang satu ke bentuk yang lain, misal dari bentuk hidrogen
menjadi bentuk natrium dengan cara pencucian memakai
larutan natrium klorida pekat sampai eluennya bereaksi
netral.
b. Pengisian Kolom
■ Untuk analisis mikro dapat digunakan buret
dengan sumbat kapas atau gelas wool
penyangga resin.
■ Resin diisikan dalam bentuk bubur dan
dibiarkan mengenap dan kadang-kadang perlu
digoyang-goyang
■ Setelah diisi puncak resin harus terendam
cairan agar tidak kemasukkan udara
c. Metode Pemisahan
Menggunakan larutan sampel yang encer supaya
mendapatkan hasil yang memuaskan
d. Kapasitas Pertukaran Ion
■ Mempengaruhi ukuran sampel maksimum yang dapat
dipisahkan dan digunakan untuk memeriksa stabilitas
resin dalam jangka lama
■ Kapasitas resin dinyatakan dalam mili-ekivalen/gram
resin kering
■ Resin umumnya mempunyai kapasitas 1–5
miliekivalen/ml atau secara kasar 1–5 N dalam asam atau
basa.
e. Metoda Deteksi
■ Cara deteksi yang paling umum adalah
mengumpulkan sesama volume fraksi-fraksi
untuk spesies yang dicari
■ Digunakan pula cara deteksi dengan adsorpsi
cahaya indeks bias, pH radioaktivitas,
polarografi dan spektrofotometri.
 Pemakaian
■ Untuk menghilangkan ion
■ Untuk menentukan kadar konstituen yang
sangat kecil
■ Larutan baku primer dari asam kuat dan basa
kuat
■ Pemisahan logam-logam
■ Pemisahan asam-asam amino
 KROMATOGRAFI GEL
■ Fasa diam adalah gel yaitu suatu matriks polimer
yang berpori-pori dan pori-porinya seluruhnya terisi
oleh pelarut yang digunakan sebagai fasa gerak
■ Dasar pemisahan ditentukan oleh ukuran pori
■ Molekul yang ukuran besar diatas ukuran pori akan
sama sekali tidak dapat masuk ke dalam gel, sedang
molekul yang lebih kecil dari ukuran pori akan dapat
masuk dan menggunakan sebagian atau seluruh
ruangan bagian gel tersebut.
■ Adanya fasa gerak menyebabkan molekul
besar akan masuk melewati dasar kolom tanpa
hambatan, sehingga akan keluar terlebih
dahulu, sedangkan molekul kecil akan
terhambat sesuai dengan masuknya ke dalam
gel.
 Teknik Analisis
a. Pemilihan Gel
■ Gel merupakan senyawa yang terdiri dari rantai-rantai
polimer panjang berhubungan silang dan membentuk
kerangka tiga dimensi.
■ Untuk dapat memilih gel yang sesuai untuk suatu
campuran yang akan dipisahkan perlu diketahui tipe-tipe
dari gel seperti :
1. Sephadex untuk pemisahan molekul yang besar dalam biokimia
2. Biogel P untuk molekul dengan bobot molekul 1.800 – 400.000
3. Agarose untuk molekul dengan bobot molekul > 500.000
4. Styragel untuk molekul dengan bobot molekul 1.600 – 40 juta
b. Pembuatan Kolom
■ Dibuat seperti kolom pertukaran ion
■ Gel mula-mula dimuaikan dulu dengan pelarut
selama beberapa jam, kemudian dimasukkan
ke dalam kolom dalam bentuk bubur.
■ Lapisan gel ditopang dengan gelas wool atau
jala nilam dan diusahakan tidak ada
gelembung udara yang terperangkap di dalam
lapisan dengan cara permukaan zat cair di atas
lapisan.
c. Pemasukan Cuplikan
■ Sampel dimasukkan secara berhati-hati
sehingga tidak merusak lapisan
■ Elusi biasanya dilakukan di bawah tekanan
hidrostatik (atmosfer) yang tetap untuk
memperoleh laju aliran yang tetap
d. Deteksi
■ Metode deteksi yang umum meliputi
pengumpulan dan penganalisaan fraksi-fraksi
eluat
■ Selanjutnya dilakukan pengukuran-
pengukuran seperti spektrofotometri UV, index
bias atau radioaktivitas.
d. Pemakaian
■ Penghilangan garam (desalting)
■ Pemekatan
■ Pemisahan senyawa berbobot molekul tinggi,
misal: protein, polisakarida, dll
KROMATOGRAFI AFINITAS
 KROMATOGRAFI AFINITAS
■ Dalam sistem ini fasa diam berupa suatu kerangka zat
padat yang mempunyai afinitas berlainan dengan
berbagai senyawa.
■ Pemisahan terjadi karena komponen hasil reaksi akan
dapat melewati keluar sedang komponen yang
belum/tidak bereaksi akan tertahan oleh fasa diam
■ Proses ini digunakan misalnya dalam reaksi enzimatis
secara kontinyu
TERIMA KASIH