Kromatografi Kolom

KROMATOGRAFI KOLOM

Kromatografi Kolom adalah suatu metoda yang

berguna untuk pemisahan dan pemurnian dari sampel
berbentuk padat dan cairan di bawah 10 gram

Kromatografi Kolom merupakan suatu teknik

pemisahan yang dilakukan berdasarkan pada
perbedaan daya adsorbsi suatu absorban tertentu
terhadap hasil suatu senyawa
Pemisahan dilakukan berdasarkan perbedaan daya
adsorbsi suatu absorben terhadap hasil suatu senyawa
sehingga bisa digunakan untuk menentukan pelarut
yang sesuai

Absorben yang paling umum digunakan yaitu aluminium oksida

karena mempunyai daya adsorbsi yang baik
• Pemisahan berjalan lambat

• Tidak dapat diguakan untuk partikel

yang terlalu kecil

• Penyerapan tidak dapat bolak balik

 FAKTOR YANG MEMPENGARUHI
KECEPATAN GERAK ZAT

Daya serap absorben

Sifat Pelarut

Suhu Sistem Kromatografi

Ukuran Partikel

Tekanan Udara dalam Kolom

Jika zat terpisah berwarna atau berfluoresensi dengan sinar UV,
kolom penyerap dapat dikeluarkan dengan cara memotong
Melintang lapisan yang diperlukan atau zat disaring dengan
Penyaring yang cocok

Jika zat terpisah tidak berwarna letak lapisan zat dapat diketahui
Dengan cara memberi warna atau menyemprot kolom dengan
Pereaksi yang dapat membentuk warna
 PEMISAHAN

Pemisahan lebih banyak dilakukan dengan cara

mengalirkan pelarut Melalui kolom sehingga zat yang
berkhasiat yang dikehendaki Keluar dari eluent

Metoda ini dapat memisahkan zat dari dari 100 – 590 mg

Pemisahan dapat berjalan lebih baik jika harga Rf < 0.5

 METODA ELUSI DALAM KK

ISOKROTIK
Eluen yang digunakan tingkat kepolaranya sama

SGP ( State Gradien Polarity)

Eluen yang digunakan kepolaranya bertingkat dari non polar ke polar
 Zat padat Penyerap

1. Alumina atau Magnesia

memisahkan serat-serat, zat warna, ester, alkaloid,
2. Silika Gel
untuk memisahkan sterol asam amino
3. Magnesium Klorida
4. Pati : memisahkan enzim
5. Gula : memisahkan klorofil dan santofil
6. Karbon : Memisahkan peptida, Karbohidrat
7. Kalsium Karbonat : Memisahkan xantofil, karotensia
8. Kalsium Pospat : memisahkan enzim, protein
 Hal- Hal yang harus diperhatikan

RONGGA UDARA
Diusahakan tidak ada rongga udara dalam kolom karena akan
Menghambat jalan sampel yang terperangkap dalam absorben
Yang mempunyai rongga udara

UKURAN ADSORBEN
Jangan terlalu kasar atau halus karena jika terlalu halus sulit
untuk dilewati sampel karena memadat
                                                                                     
                                                                                
                                                                              

Tipe Kolom

1- Kolom Gravity
Fasa gerak bergerak melalui fasa diam melalui
gerakan gravitasi.

2- Kolom Flash (Tekanan Udara atau nitrogen)      

     
  
Fasa Gerak didorong oleh tekanan udara atau
nitrogen menggunakan Adaptors.
 Tipe Kolom

3-Kolom dengan Tekanan Rendah dan sedang (pompa)

Pergerakan Fasa gerak diatur oleh pompa dengan tekanan rendah
dan sedang. Peningkatan laju alir akan mempersingkat
waktu pemisahan.
 Tipe Kolom
4-Kolom Vacuum
Adsorben dikeringkan dan dimasukan dalam corong kaca.
Sampel masukan dalam bentuk kering atau larutan. Kemudian Fase
gerak ditambahkan sedikit-sedikit dan jalankan vacuum untuk
memperoleh fraksi.
 Tipe Kolom
5- Kolom Tekanan Tinggi (HPLC)
Dalam hal ini digunakan silica gel yang sangat bagus dan dapat
memisahkan sampel dengan sangat baik. Namun kecepatan alir dari
fasa gerak dikurangi. Tekanan tinggi digunakan untuk menekan
pelarut melalui kolom.
 Cara Memasukan adsorbent kedalam kolom

1. Slurry packing (Wet method)

adsorbent disuspensikan kedalam fasa gerak dan diaduk sedemikianrupa
sehingga tidak ada gelembung udara. Hasilnya adalah slurry yang selanjutnya
dimasukan kedalam kolom. Lakukan ketukan yang cukup untuk memastikan
tidak adanya batas antara kapas dengan slury.

Pada kromatografi gel adsorbent harus didiamkan terlebih

dahulu dengan Fase gerak selama satu malam.
 Cara Memasukan adsorbent kedalam kolom

2. Dry Packing
Pada metoda ini adsorben kering dimasukan langsung kedalam
kolom. Lakukan Getaran untuk mengeluarkan gelebung udara.
Fase gerak dilewatkan pada adsorben. Metoda ini tidak bisa
digunakan pada Kromatografi Gel.
 Membuat Kolom

• Pastikan Kolom terbuat dari polyethylene frit.

• Masukan Silica gel atau alumina ke dalam kolom sampai ½ -2/3 kolom.
• Masukan silica gel kedalam suatu becker 50 mL dan tambahkan 8 mL
heksan.
• Klem kolom dalam suatu posisi tegak.
• Tambahkan 2 mL heksan kedalam kolom.

• Aduk campuran silica gel – heksan sewaktu mengalir memasuki

kolom.
• Buka klem dan keluarkan pelarut..
• Ulangi tahap diatas sampai semua silica gel berada dalam kolom.
• Tutup klem dengan beberapa pelarut berada selapis diatas silica gel
•.
KROMATOGRAFI KOLOM
 FLASH COLUMN CHROMATOGRAPHY

• Membuat Kolom
• Pengerjaan sampel
• Elusidasi
• Mengumpulkan Fraksi
• Analisa dengan KLT
• Kombinasi Fraksi murni
FLASH COLUMN CHROMATOGRAPHY