Thin Layer Chromatography

Eka Kumalasari, M.Farm., Apt

 Penggunaan KLT

ANALISIS
KUALITATIF KUANTITATIF
PREPARATIF
 JENIS-JENIS KROMATOGRAFI

• Berdasarkan prinsip kerja: partisi dan

adsorpsi

JENIS
• Kromatografi lapis tipis (TLC)
• Kromatografi kolom: HPLC, GLC, penukar
ion, gel filtrasi
 Istilah

Kromatografi Lapis Tipis = Thin Layer Chromatography

Pengembangan = development = eluasi = elusi
Eluen = pelarut untuk pengembangan
Eluat = pelarut yang mengandung analit hasil pemisahan dengan
kromatografi
Kromatogram = gambar hasil pemisahan
Kromatograf = alat untuk kromatografi
Rf = retardation factor = jarak migrasi analit dari titik awal / jarak
migrasi fase gerak setelah pengembangan
RRf = 100 x Rf
Fase stasioner : fase diam
Fase mobil – adalah fase gerak= Eluen
Sampel – adalah bahan yang dianalisis; dapat mengandung komponen
tunggal atau campuran komponen
Analit / analat – adalah senyawaan yg dipisahkan dlm kromatografi.
 DEFINISI KLT

Pemilihan eluen
Kromatografi lapis tipis Plat tipis :Kaca, didasarkan pada
(KLT) adalah salah satu Aluminium, plastik yang polaritas senyawa dan
metode pemisahan dilapisi dengan
Fase diam: padat, biasanya merupakan
komponen adsorben (Fase diam) : campuran beberapa
menggunakan fasa fase gerak: cair silika gel, aluminium cairan yang berbeda
diam berupa plat oksida (alumina) , polaritas, sehingga
dengan lapisan bahan kieselghur maupun didapatkan
adsorben inert. selulosa. perbandingan tertentu
1. FASE DIAM KLT
2. FASE GERAK, Kriteria

• Memiliki kemurnian tinggi

• Harga Rf terletak antara 0,2 -0,8 untuk

memaksimalkan pemisahan

• Minimal menggunakan 2 pelarut

 3. Aplikasi penotolan
Parameter aplikasi yang direkomendasikan

Diameter bercak Konsentrasi

Tujuan
(mm) sampel (%)

2 mm untuk volume
Densitometri 0,02-0,2
sampel 0,5 µl

3 mm untuk volume
Identifikasi 0,1-1
sampel 1µl

4 mm untuk volume
Uji kemurnian 5
sampel 2µl

Reprodusibilitas : volume sampel yang ditotolkan paling sedikit 0,5 µl.

Volume sampel > 2-10µl : penotolan harus dilakukan secara bertahap
 1. POLARITAS
• Penting untuk kromatografi
• Menunjukkan adanya pemisahan kutub
muatan positif dan negatif dari suatu molekul
sebagai akibat terbentuk konfigurasi tertentu
dari atom-atom penyusunnya
• Molekul tersebut dapat tertarik oleh molekul
lain yang mempunyai polaritas
• Tingkat pemisahan dari molekul-molekul
tersebut menentukan polaritas dan daya
tariknya
 dalam kromatografi
Polaritas digunakan sebagai petunjuk sifat:
• Pelarut/solven
• Adsorben
• Zat yang dipisahkan/solut

PRINSIP LIKE DISSOLVES LIKE

• Pelarut polar cenderung melarutkan solut polar
• Adsorben polar cenderung mengadsorbsi solut polar
 POLARITAS RELATIF BERBAGAI JENIS PELARUT

KONSTANTA DIELEKTRIK JENIS PELARUT

1,89 Petroleum ringan (petroleum eter,
heksana, heptana)
2,023 Sikloheksana
2,238 Karbon tetraklorida, trikloroetilen, toluena
2,284 Benzena, diklorometana
4,34 Etil eter
4,806 Kloroform
6,02 Etil asetat
20,70 Aseton, n-propanol
24,30 Etanol
33,62 Metanol
80,37 Air
 Polaritas pelarut
• Sebanding dengan konstanta dielektrik zat
pelarut
 2/3. PARTISI DAN ADSORBSI

• Pemisahan dengan proses partisi dan adsorbsi

dipengaruhi oleh perbedaan polaritas solut
yang dipisahkan
• Polaritas merupakan faktor yang menentukan
daya larut (kemampuan partisi) dan adsorbsi
solut
 PARTISI
• Proses partisi tergantung dari daya larut solut
dalam dua macam cairan
• Peka terhadap perbedaan BM solut
• Zat yang terdiri dari satu seri deret homolog
paling baik dipisahkan dengan kromatografi
partisi
• Misal: pemisahan berbagai jenis asam amino,
asam lemak, gula
 ADSORBSI
• Peka terhadap bentuk stereometri dari solut yang
dipisahkan
• Banyaknya solut yang dapat diadsorbsi pada
permukaan adosrben tergantung dari konfigurasi
solut
• Kemampuan untuk diadsorbsi menentukan
kemudahan solut untuk dipisahkan dengan
kromatografi adsorbsi
• Cocok untuk memisahkan campuran solut yang
serupa tetapi mempunyai perbedaan bentuk
sterometrik
 4. Pengembangan
• Bejana kromatografi sebelum digunakan harus dijenuhkan dengan
uap fase gerak

• Tepi bagian bawah lempeng lapis tipis berjarak 0,5-1 dengan volume
fase gerak
• Tinggi fase gerak harus berada dibawah lempeng yang berisi totolan

• Bejana harus tertutup rapat

• Proses penjenuhan bejana dilapisi dengan kertas saring - jika fase

gerak telah mencapai bag. Atas kertas saring bejana sudah jenuh
 5. Deteksi bercak
• Cara kimia -> penyemprotan senyawa kimia
• Cara fisika -> pencahayaan fluourosensi sinar
UV
• (jika senyawa tidak dapat berfluourosensi
maka penjerap ditambah indikator yang
berflourosensi dengan demikian bercak akan
terlihat hitam sedangkan latar belakangnya
akan terlihat berflourosesi)
Analisis Kualitatif Senyawa
FLAVONOID
Uap amonia dan sitroborat
MINYAK ATSIRI
vanilin asam sulfat dan FeCl3
ALKALOID
pereaksi dragendorf
 Sampel : Ekstrak etanol
batang Binahong
Fase diam : Silika gel 60 F254
Fase gerak: Etil Asetat :
Metanol : Air
(100 : 13,5 : 10) v/v
Deteksi : Sinar UV254 nm,
UV365 nm
Pereaksi : FeCl3

Keterangan :
P = Pembanding quersetin
S = Sampel Ekstrak etanol batang Binahong 5% b/v
A = Sinar UV254 nm
B = Sinar UV365 nm
C = Visibel
 Deteksi
Sampel Harga Rf Polifenol
UV254 nm UV365 nm Vis FeCl3

0,85 Pemadaman Fluoresensi biru Biru kehijauan (+)

Ekstrak etanol
batang Binahong
(5% b/v)

0,81 Pemadaman Fluoresensi biru kuning (-)

0,72 Pemadaman Fluoresensi biru Biru kehijauan (+)

0,66 pemadaman Fluoresensi biru Biru kehijauan (+)

Quersetin (0,25% 0,77 Pemadaman Fluoresensi biru biru (+)

b/ )
v
Mekanisme KLT (fase diam Silika /Alumina):
1. Adsorbsi senyawa pada adsorben/penjerap/fase
diam
2. Kompetisi fase gerak & solut untuk berikatan
dengan fase diam, dimana solut lepas dari
permukaan fase diam => desorbsi
3. Senyawa dielusi oleh eluen/pengembang/fase
gerak
 Rf(retention factor )
RF (retention factor ) adalah nilai perbandingan relatif antar sampel yang menyatakan
derajat retensi suatu komponen dalam fase diam dimana rf dapat dihitung dengan
membandingkan jarak yang ditempuh komponen dengan jarak yang ditempuh eluen.

Contoh soal, hitung RF jika panjang pelat 10 cm batas atas dan bawah 1 cm
(artinya jarak tempuhnya 10-(1+1)= 8 cm. Maka

Rf = jika ditanya HRF maka kalikan 100%

ANALISIS KUANTITATIF SENYAWA DENGAN
KLT DENSITOMETER
= Thin Layer Chromato Scanner

Densitometri: metode analisis instrumen

berdasar pada interaksi antara
radiasi elektromagnetik dengan analit
(bercak)
Interaksi tersebut ditentukan oleh:
absorbsi, transmisi, dan pantulan
Prinsip analisis hampir sama dengan metode
spektrofotometri.
Kadar diperoleh dari area bercak yang
terdeteksi, yang selanjutnya dibandingkan
dengan kurva baku.
Kurva Baku dibuat dengan cara
menotolkan senyawa baku pada seri
kadar kemudian dibaca areanya.
Selanjutnya dibuat persamaan Y=Bx+A.

Y= area
x = kadar senyawa
Gambar alat densitometer
Kunyit & pemisahan komponen
kimiawinya
Penghitungan kadar