Dosen Pengampu : Nailys Saadah, M.

Si

KROMATOGRAFI
 Prinsip dasar kromatografi
Klasifikasi metode kromatografi
Teori dasar kromatografi: kesetimbangan distribusi,
laju migrasi komponen, waktu retensi, faktor
kapasitas, faktor selektifitas
Mekanisme dan aplikasi berbagai jenis kromatografi
 Metode kromatografi merupakan
metode yang digunakan untuk
memisahkan komponen kimia yang
bercampur dalam sampel.

Michael Tswett (1906) ahli botani

dari Rusia.
Menemukan pigmen warna dalam
ekstrak tumbuhan dengan
menggunakan serbuk kalsium
karbonat yang diisikan ke dalam
kolom, dan petroleum eter sebagai
pelarut

Melibatkan 2 fasa yaitu fasa diam

dan fasa gerak
 Metode pemisahan suatu senyawa yang didasarkan
atas migrasi differensial komponen zat diantara 2
fasa yaitu fasa diam (fasa stasioner) dan fasa gerak
(fasa mobile)
Fasa diam (bagian yang tidak bergerak dalam sistem
kromatografi): dapat berupa cair atau padat
Fasa gerak (bagian yang membasahi sambil
mengambil senyawa yang dipisahkan): dapat berupa
gas atau cair. Fase gerak sering disebut dengan
eluen, yang fungsinya meng-elusi sampel sepanjang
kolom kromatografi melewati fase diamnya. Eluen
yang mengelusi dan keluar lagi diujung kolom
disebut dengan eluat.
 Analit yang berinteraksi kuat
dengan fasa diam tertahan
lebih lama, sehingga
pemisahaan dari kolom akan
lebih akhir dibandingkan
analit yang berinteraksi lemah.
Analit akan terpisah dalam
dua pita.
Analit terdeteksi saat keluar
kolom dan signalnya dicatat.
Kromatogram berupa plot
antara waktu dan sinyal
detektor.
 Tujuan Kromatografi
ANALITIK menentukan komposisi kimia
dari sampel

PREPARATIF memurnikan dan mengisolasi

salah satu komponen dari sampel

Dalam kromatografi perhatikan:

- Jenis kromatografi
- Fasa diam
- Fasa gerak
 Memisahkan sampel/konstituen yang sangat kecil
(semi mikro & mikro)
Memisahkan molekul-molekul besar seperti polimer
Memisahkan senyawa-senyawa organik multi
komponen/ kompleks
Waktu lebih singkat, relatif murah, sederhana
Dapat memisahkan senyawa-senyawa yang tidak
stabil
Berdasarkan Tipe Gas/Cair GLC
Fase gerak Gas/Padat GSC
dan Fase diam Cair/Cair LLC
Cair/Padat LSC
Fluidasuperkritik/Cair SFLC
Fluidasuperkritik/Padat SFSC

Berdasarkan Krom.Partisi d=cair, g=cair

Mekanisme Krom.Adsorpsi d=padat, g=gas
Terbentuknya Pertukaran Ion Melibatkan ikatan kimia
Distribusi Fase

Berdasaarakan Kolom Kolom kemasan/kapiler

Geometri (packed)
Pipa terbuka (open tubular)
Planar/Bidang Kertas
Lapis Tipis
 Kromatografi

Cair Gas

Planar Kolom GSC GLC

TLC CZE PC LSC LLC BPC IEC BC

GPC GFC
Klasifikasi Kromatografi
Berdasarkan Jenis Fasa

Fasa gerak
Gas: Inert (helium, argon)
Fasa diam
Padat: silka, alumina
Klasifikasi Kromatografi
Berdasarkan Mekanisme Pemisahan Yang Terjadi

Kromatografi Adsorpsi
Kromatografi Partisi
Kromatografi Penukar Ion
Kromatografi Eksklusi (kromatografi permeasi
gel atau filtrasi gel)
Kromatografi Afinitas
Kromatografi Supercritical Fluida (SFC)
 Beberapa mekanisme yang digunakan untuk
menjelaskan proses terjadinya pemisahan :
Mekanisme Adsorpsi Bahan dari fasa gerak
mengalami penyerapan di permukaan fasa diam.
Digambarkan dengan isoterm Freundlich, Langmuir
dan BET (Brunauer-Emmer-Teller).
Mekanisme Pemisahan Partisi jika senyawa dibagi
antara 2 fase (terjadi jika fs diam dan fs gerak = cair).
Mekanisme Kromatografi Fase Balik Fs.diam dibuat
tidak polar dan hidrofobik, fs.gerak dibuat polar dan
hidrofil (ex: Krom.Pertukaran Ion).
 Hukum Kesetimbangan Distribusi
Gambaran sederhana dari dinamika di antara fase
diam dan fase gerak dalam kolom
 Di dalam kolom, aliran fasa gerak akan
membawa komponen-komponen analit ke arah
sepanjang kolom.
Pada saat fasa gerak mengalir sepanjang kolom
akan terjadi kesetimbangan dinamis antara
komponen yang terdapat dalam fasa gerak,
dengan komponen yang terdapat dalam fasa
diam.

C(FasaGerak) C(Fasa Diam)

 Tetapan kesetimbangannya dinyatakan dengan
koefisien distribusi/partisi, yaitu perbandingan
konsentrasi komponen analit dalam fasa diam
dan fasa gerak.

Cs
K
Cm
dimana,
K = koefisien distribusi atau koefisien partisi;

Cs = konsentrasi analit dalam fasa diam;

Cm = konsentrasi analit dalam fasa gerak
Berdasarkan persamaan tersebut, laju
migrasi ditentukan oleh:
1. Laju alir fasa gerak (sama untuk semua
komponen)
2. Perbandingan volume fasa diam terhadap fasa
gerak (sama untuk semua komponen)
3. Koefisien distrbusi (spesifik untuk setiap
komponen)
 Waktu retensi (tR) adalah selang waktu yang
diperlukan oleh komponen untuk keluar dari
kolom dan mencapai detektor
Waktu Mobile (tM) adalah Waktu yang
diperlukan oleh fase gerak untuk melewati
kolom
Volume retensi adalah volume yang diperlukan
oleh fase gerak untuk mengelusi komponen
sampai maksimum dari kolom
 Adalah faktor yang menyatakan perbandingan mol
komponen analit dalam fase diam terhadap mol
komponen dalam fasa gerak.
K dijadikan ukuran kekuatan interaksi suatu komponen
dengan fasa diam.
tR tM
K'
tM

Jika harga k kecil, maka komponen/analit akan

bergerak dalam kolom lebih cepat.
Bila komponen A dan B mempunyai harga k yang
berbeda cukup besar, maka akan terjadi pemisahan
yang lama.
 Adalah ukuran kemampuan kolom untuk
memisahkan campuran
2
tR
2
5,55t
N 16 R

W W1/ 2
Dimana,
N= jumlah plat teori
W= lebar puncak
 Adalah ukuran kuantitatif yang menyatakan
kemampuan kolom dalam memisahkan
komponen-komponen
Tujuan : untuk mendapat
pemisahan yang sempurna
Resolusi dipengaruhi oleh
tiga faktor yaitu efisiensi,
selektivitas dan retensi (K)
Untuk memperbaiki resolusi kromatogram (Pecsok, et al) :
1. Menaikkan harga tR = ty tx dengan cara :
a. Menambah panjang kolom (L)
b. Menaikkan jumlah fase diam (Vs)
c. Membuat faktor separasi (=t2/t1) lebih baik :
- Menurunkan T
- Memilih fase diam yang lain
- Memilih fase gerak yang lain
2. Menurunkan lebar puncak (W) dengan cara :
a. Menggunakan isi kolom dengan ukuran yang lebih seragam
- Menggunakan partikel yang lebih kecil
- Hindari rongga udara
b. Menaikkan daerah atar muka antara fase diam dan fase gerak
c. Optimasi laju alir
d. Mengecilkan ukuran sampel yang dimasukkan dalam kolom
e. Menghindari terjadinya rongga udara
f. Mengecilkan diameter kolom
Pada kromatografi ideal, bentuk pita (puncak)
kromatogram yang diperoleh seharusnya berupa
puncak yang sempit, yang terpisah satu sama lain.

Penyebab Pelebaran Puncak :

1. Difusi Eddy
2. Difusi Longitudinal
3. Efek Perpindahan Massa
 Contoh Chromatography
Liquid Chromatography
digunakan untuk identifikasi pigmen
tumbuhan atau komponen lain

Thin-Layer Chromatography
Menggunakan lapisan tipis atau gelas
kaca untuk memisahkan komponen
kimia dan bahan lainnya

Gas Chromatography
Digunakan untuk menentukan komposisi kimia Paper Chromatography
zat-zat yang tidak diketahui, seperti senyawa Dapat digunakan untuk memisahkan
berbeda dalam bensin yang ditunjukkan oleh tiap- komponen-komponen tinta,
tiap puncak dalam grafik di bawah ini. pewarna, senyawa tumbuhan
(klorofil), make-up, dan banyak zat
lain
Kromatografi Adsorpsi

Kromatografi Partisi

Kromatografi Gas

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT/HPLC)

Kromatografi Pertukaran Ion

Kromatografi Fluida Superkritik

 Kromatografi kolom adalah sebutan untuk semua jenis
pemisahan kimia menggunakan kolom sebagai wadah
fase diamnya.
Tujuan : Analisis Kualitatif (menentukan senyawa yang
terkandung) dan Analisis Kuantitatif (menentukan
jumlah senyawa yang dibandingkan dengan standarnya)
Fasa diam kolom (padat/cair)
Fasa gerak cair/gas

Syarat penggunaan isi dalam kolom adalah

digunakannya material berpori. Hal ini digunakan agar
fase gerak dapat mengalir dan melewati kolom sambil
membawa komponen campuran yang hendak
dipisahkan.
1.Sampel yang dilarutkan dalam sedikit pelarut,
dituangkan melalui atas kolom dan dibiarkan mengalir ke
dalam adsorben (bahan penyerap).
2.Komponen dalam sampel diadsorbsi dari larutan secara
kuantitatif oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada
permukaan atas kolom.
3.Dengan penambahan pelarut secara terus menerus,
masing-masing komponen akan bergerak turun melalui
kolom dan akan terbentuk pita yang setiap zona berisi
satu macam komponen.
4.Setiap zona yang keluar kolom dapat ditampung dengan
sempurna sebelum zona yang lain keluar kolom.
Gambar kromatogafi kolom
 Bentuk Kurva
kromatografi
Fase Gerak
Adsorpsi
dan Fase
Diam
Pengertian
Adsorpsi
 Proses
adsorpsi suatu proses penarikan partikel di
permukaan materi.

Dalam permukaan suatu lapisan akan ada penarikan

partikel oleh partikel lain aktivitas adsorpsi.
Hal ini dapat terjadi jika permukaan mempunyai situs
aktif/gugus fungsi yang dapat bereaksi dengan analit,
mempunyai permukaan yang luas (material berpori).

Dalam proses kromatografi adsorpsi berlaku Hukum

Kesetimbangan Adsorpsi-Desorpsi.
Proses pemisahan di permukaan dinyatakan dalam bentuk
isoterm adsorpsi (kurva hubungan jumlah senyawa yang
terserap di fs.diam = Cs dan jumlah senyawa yang larut dan
terbawa oleh fs.gerak = CM).
 Kurva A Kurva B Kurva C

Kurva Konveks Kurva Linier Kurva Konkaf

(Cembung) Terjadi jika n=1 (Cekung)
Terjadi jika n>1 Kesetimbangan Terjadi jika n<1
Kecepatan dipermukaan Kurva melandai di
tergantung pada berjalan normal awal namun
jumlah situs aktif (proses adsorpsi kemudian adsorpsi
yang memenuhi dan desorpsi terjadi berlangsung cepat
lapisan permukaan secara simultan) di akhir. Terjadi jika
dan koefisien di tengah proses
distribusi menurun ditambahkan
jika konsentrasi pereaksi lain
bertambah. sehingga reaksi
berlangsung lebih
cepat.
 SIFAT :
1. Polaritas relatif kekuatan untuk mengadsorpsi
spesies tertentu.
-COOH > -OH > -NH2 > -SH > -CHO > =C=O > -COOR
> -OCH3 > -CH=CH-
2. Kapasitas adsorpsi jumlah gram solut yang
dapat diadsorpsi per gram adsorben
arang aktif > silika gel > alumina asam > alumina
basa > Cr2O3 > ZnS > Al2O3 > CaF2 > CaO
Kemurnian Eluen

Pengotor dalam eluen elusi terganggu

Pelarut yang mengandung peroksida : pada kolom
alumina, peroksida tertahan sehingga fungsi
fs.diam terganggu
Pelarut berhalogen : bila ada Na2CO3/K2CO3 dapat
terbentuk HCl bebas
Fase diam terdiri dari partikel polar, tergantung
pada gugus fungsi yang ada di permukaan. Ex:
alumina-karbon aktif-silika gel-magnesium-CaCO3-
sukrosa-amilum-selulosa.
Fase gerak membawa senyawa turun pada waktu
elusi. Kekuatan pelarut dipertimbangkan karena
dapat menentukan kompetisi penyerapan molekul
sampel.

Jika senyawa sangat larut dalam fs.gerak elusi

berlangsung cepat, jika senyawa tidak larut
dalam fs.gerak elusi berlangsung lama.
 Kromatografi partisi menggambarkan kesetimbangan cair-
cair di permukaan fase diam.
Terjadi distribusi senyawa komponen antara eluen
(fs.gerak) dan lapisan cairan tipis yang menempel
dipermukaan padatan (fs.diam).
Membutuhkan larutan penyangga untuk menjaga
kelarutan masing-masing komponen sebelum dan sesudah
terpisah dalam kolom.
Dalam kromatografi partisi biasanya terdiri dari fs.diam
POLAR dan fs.gerak NON POLAR untuk mengelusi sampel.
 Fs. Diam : Cairan yang melapisi partikel penyangga
ex:selulosa, silika gel, C8, C18.
Fs. Gerak : cairan yang tidak dapat bercampur
dengan fs. diam
Sampel : berbeda kelarutannya dalam fs.diam
Komponen yang lebih besar kelarutannya dalam fs.
diam akan tertahan lebih lama